生物与化学工程学院
仪器分析实训报告
题目：气相色谱内标法检测烟碱含量方法学考察
Study on the methodology investigation of detecting nicotine
content by GC internal standard method
专业：
姓名：
学号：
完成日期：
1
气相色谱内标法检测烟碱含量方法学考察
【摘 要】
【关键词】：
Study on the methodology investigation of detecting nicotine content by GC internal standard method Abstract：
Keywords：
2
目 录
1 绪论…………………………………………………………………5
1.1 烟碱的结构与化学性质……………………………………………5
1.2 烟碱的检测方法……………………………………………………5
1.2.1 非水滴定法检测烟碱含量…………………………………………5
1.2.2 紫外线分光光度法检测烟碱含量…………………………………6
1.2.3 水蒸气蒸馏法检测烟碱含量………………………………………6
1.2.4 高效液相色谱法检测烟碱含量……………………………………6
1.2.5 气相色谱法检测烟碱含量…………………………………………6
1.2.5.1 外标法检测烟碱含量………………………………………………7
1.2.5.2 归一化法检测烟碱含量……………………………………………7
1.2.5.3 内标法检测烟碱含量………………………………………………7
1.3 检测方法学考察……………………………………………………7
1.3.1 线性关系的考察……………………………………………………7
1.3.2 精密度的考察………………………………………………………8
1.3.3 重现性实验的考察…………………………………………………8 2 实验部分……………………………………………………………9
2.1 目的…………………………………………………………………9
2.2 材料和仪器…………………………………………………………9
2.2.1 材料…………………………………………………………………9
2.2.2 仪器…………………………………………………………………9
2.3 色谱条件……………………………………………………………9
2.4 实验设计及结果分析……………………………………………… 10
2.4.1 线性关系实验的考察………………………………………………10
2.4.2 精密度实验的考察…………………………………………………11
2.4.3 重现性实验的考察…………………………………………………11
2.4.4 结果分析……………………………………………………………12 参考文献…………………………………………………………………………13
3
气相色谱内标法检测烟碱含量方法学考察 1 绪论
1.1 烟碱的结构与化学性质
1.2
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.4
1.2.5 气相色谱法检测烟碱含量 高效液相色谱法检测烟碱含量 水蒸气蒸馏法检测烟碱含量 紫外分光光度法检测烟碱含量 烟碱的检测方法 非水滴定法检测烟碱含量
气相色谱法中有外标法、归一化法、内标法三种。
1.2.5.1外标法
1.2.5.2归一化法
1.2.5.3内标法
1.3 检测方法学考察
4
1.3.1 线性关系的考察
1.3.2 精密度的考察
1.3.3 重现性实验的考察
1.3.4 回收率
1.3.5 验证性
2 实验部分
2.1 目的
2.2
2.2.1 材料和仪器 材料
98％烟碱(自制备) 、喹啉(分析级别)、水（蒸馏水）、进样量为1ul、甲醇（分析级别）
2.2.2 仪器
气相色谱仪（7890Ⅱ型上海天美公司）、毛细管柱 （30m length TM—WAX From 20℃ to 260℃）
2.3 色谱条件
气体流速:N2 30ml/ min Air 30ml/min H2 50ml/min
5
柱箱温度（OVEN）170℃ 进样口温度（INJ）270℃
检测器温度（DET）270℃
2.4 实验设计及结果分析
通过实验及对实验结果的分析得出以下结论。
2.4.1 线性关系实验的考察
所用试剂：100ug/mL烟碱甲醇溶液， 100ug/mL喹啉甲醇溶液，甲醇（99%以上）
配制浓度分别为1、10、20、30、40、50ug/ml的烟碱甲醇溶液，内含50ug/ml的喹啉，吸取1ul进样检测，并记录烟碱和喹啉的峰面积及峰高，计算出它们之间的峰高比和面积比，结果见表1。
表1：烟碱/喹啉的峰高比及面积比 Table 1:peak height ratio and area ratio of nicotine/ quinoline
Test uL
-------------------------------------- peak height ratio area ratio No. nicotine quinoline methyl hydroxide
1 0 500 500 0 0
2 100 500 400
3 200 500 300
4 300 500 200
5 400 500 100
6 500 500 0
用Origin7.5软件处理数据，作图如下所示：
图1 烟碱/喹啉的峰高比
Fig. 1 peak height ratio of nicotine/ quinoline
以烟碱与喹啉的峰高比为Y轴，以烟碱含量（单位ug）为X轴的回归方程分别为Y= (r= )由此可以看出烟碱含量在0—50ug/ml范围内，采用气相色谱法测定时其浓度与峰高比呈良好的线性关系。
用Origin7.5软件处理数据作图如下：
6
图2 烟碱与喹啉的面积比
Fig. 2 area ratio of nicotine/ quinoline
以烟碱与喹啉的面积比为Y轴，以烟碱含量（单位ug）为X轴的回归方程分别为Y= (r= )由此可以看出烟碱含量在0—50ug/ml范围内，采用气相色谱法测定时其浓度与峰面积比呈良好的线性关系。
线性关系试验中，t检验峰值比的t= >t0.01，面积比的t= >t0.01，查表t0.01= ，说明线性关系较好。
2.4.2 精密度实验的考察
配制浓度为50ug/ml的烟碱甲醇溶液，内含50ug/mL的喹啉，取同一支试管中的试液连续进5针，并记录烟碱和喹啉的峰面积及峰高，计算出它们之间的峰高比和面积比，结果见表2。
表2：精密度试验
Table 2 ：precision
Test uL
---------------------------- peak height ratio area ratio No. nicotine quinoline
1 500 500
2 500 500
3 500 500
4 500 500
峰高比S= RSD%= %
面积比S= RSD%= %
2.4.3 重现性实验的考察
配制浓度为50ug/ml的烟碱甲醇溶液，内含50ug/mL的喹啉，5支试管中的试液各进1针，并记录烟碱和喹啉的峰面积及峰高，计算出它们之间的峰高比和面积比，结果见表3。
7
表3：重现性试验
Table 3： reproducibility
Test uL
---------------------------- peak height ratio area ratio No. nicotine quinoline
1 500 500
2 500 500
3 500 500
4 500 500
峰高比S= RSD%= %
面积比S= RSD%= %
参考文献
8
第二篇：仪器分析实训论文 南阳理工学院
生物与化学工程学院
仪器分析实训报告
题目：气相色谱内标法检测烟碱含量方法学考察
Study on the methodology investigation of detecting nicotine
content by GC internal standard method
专业： 生物工程
姓名： 勾 培 培
学号：105010540013
完成日期：20xx年6月1日
1
气相色谱内标法检测烟碱含量方法学考察
【摘 要】烟碱(又称尼古丁)是烟叶中的主要成分。本次试验以喹啉为内标物，烟碱为测定对象，考查及检测气相色谱法内标法测定烟碱含量的方法学。试验中以有机溶剂萃取、填充气相色谱法测定对试验的重现性及精密度和线性关系进行进行了认真分析。一定范围内，烟碱含量的峰高比及面积比呈现线性关系，重现性及精密度良好。
【关键词】： 内标法 烟碱 气相色谱 方法学
Study on the methodology investigation of detecting
nicotine content by GC internal standard method Abstract：Nicotine (also called nicotine) is the main ingredient. Tobacco This trial as internal standard with things, -1h-qunolin-2-ones nicotine to determine object, examines and detecting gas chromatography internal standard method for determining the content of nornicotine methodology. Experiments with organic solvent extraction, filling gas chromatography was developed for the determination of the test the reproducibility and precision and linear relationship between analyzed carefully. A certain range, high ratio of nicotine content than present peak area of linear relation, reproducibility and precision is good.
Keywords： Internal standard method nicotine gas chromatography methodology
2
目 录
1 绪论…………………………………………………………………4
1.1 烟碱的结构与化学性质……………………………………………4
1.2 烟碱的检测方法……………………………………………………4
1.2.1 非水滴定法检测烟碱含量…………………………………………4
1.2.2 紫外线分光光度法检测烟碱含量…………………………………5
1.2.3 水蒸气蒸馏法检测烟碱含量………………………………………5
1.2.4 高效液相色谱法检测烟碱含量……………………………………5
1.2.5 气相色谱法检测烟碱含量…………………………………………6
1.2.5.1 外标法检测烟碱含量………………………………………………6
1.2.5.2 归一化法检测烟碱含量……………………………………………6
1.2.5.3 内标法检测烟碱含量………………………………………………7
1.3 检测方法学考察……………………………………………………7
1.3.1 线性关系的考察……………………………………………………7
1.3.2 精密度的考察………………………………………………………8
1.3.3 重现性实验的考察…………………………………………………8 2 实验部分……………………………………………………………8
2.1 目的…………………………………………………………………8
2.2 材料和仪器…………………………………………………………9
2.2.1 材料…………………………………………………………………9
2.2.2 仪器…………………………………………………………………9
2.3 色谱条件……………………………………………………………9
2.4 实验设计及结果分析……………………………………………… 9
2.4.1 线性关系实验的考察……………………………………………….9
2.4.2 精密度实验的考察…………………………………………………11
2.4.3 重现性实验的考察…………………………………………………12
2.4.4 结果分析……………………………………………………………12
参考文献………………………………………………………………………13
3
气相色谱内标法检测烟碱含量方法学考察
1 绪论
1.1 烟碱的结构与化学性质
烟碱是一种吡啶型生物碱，俗称尼古丁（nicotine）。 存在于烟草属经济植物中，无色挥发性液体，有刺激性臭味，在空气中易发生变质。它能迅速溶于水及酒精中，通过口、鼻、支气管黏膜，很容易被人体吸收。重复使用尼古丁可增加心脏速度和升高血压并降低食欲。大剂量的尼古丁会引起呕吐以及恶心，严重时人会死亡。
结构式：
化学性质： 烟碱在常温下是无色油状液体，易溶于水，并能溶于酒精、 乙醚、丙酮等有机溶剂中，具有用单健相连的两个含氮杂环（即吡啶环和吡咯环），使烟碱可与酸性物质产 生质子化反应生成盐。
1.2
1.2.1 烟碱的检测方法 非水滴定法检测烟碱含量
4
在 Ba(OH)2 作用下,用甲苯一氯仿 9:1(V/V)混合液萃取香烟中尼古丁。过滤、干燥处理后用高氯酸-冰醋酸标准溶液进行非水滴定,测定烟草中尼古丁含量.方法简便、快速,不使用标准品.应用于香烟中尼古丁含量的测定方法操作简便。
1.2.2 紫外分光光度法检测烟碱含量【3】
紫外线分光光度法 ：紫外分光光度法根据烟碱对 295nm 紫外光有最大的吸收峰，且在一定的浓度范围内，溶液吸光度与烟碱含量呈线性正相关关系 的性质，用紫外分光光度计测试式样吸光对，计算出烟碱的含量。
紫外分光光度法操作简单、准确度高、灵敏度高、重现性好。波长长(频率小)的光线能量小，波长短(频率大)的光线能量大。分光光度测量是关于物质分子对 不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH 等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。
1.2.3 水蒸气蒸馏法检测烟碱含量
水蒸气蒸馏法系指将含有挥发性成分的药材与水共蒸馏，使挥发性成分随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成分的浸提方法。该法适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏、在水中稳定且难溶或不溶于水的药材成分的浸提。水蒸气蒸馏法可分为共水蒸馏法、通水蒸气蒸馏法、水上蒸馏法。为提高馏出液的浓度，一般需将馏出液进行重蒸馏或加盐重蒸馏。常用设备为多能提取罐、挥发油提取罐，它在生产活动中被广泛使用。
1.2.4 高效液相色谱法检测烟碱含量[4]
高效液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微硅胶为基质的键合相色谱。根据固定相的形式，液相色谱法可以分为柱色谱法、纸色谱法及薄层色谱法。按吸附力可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱。
高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也 有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱 5
外 效应”。 在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞 留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。
1.2.5 气相色谱法检测烟碱含量
气相色谱法中有外标法、归一化法、内标法三种。
1.2.5.1外标法 【1】
用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待 测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法（external standard method）。外标法是色谱分析中的一种定量方法，它不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。
外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。外标法操作、计算简单，无需各组分都被检出、洗脱，但进样量要求十分准 确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。
1.2.5.2归一化法
归一化法是色谱定量分析中最常用的一种方法。待试样组分全部出峰后，将各组分的面积乘以校正因子校准为各组分的相应质量，然后归一化，求出各组分的百分含量：
组分i在混合物中的百分含量可由下式计算：
6
归一化法的优点是：简便、准确，当操作条件如进样量、流速变化时，对定量结果影响很小。缺点是：对该法的苛刻要求限制了该法的使用。
1.2.5.3内标法 【1】
内标法 internal standard method 是色谱分析中一种比较准确的定量方法，尤其在没有标准物对照时,此方法更显其优越性。内标法是将一定重量的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积(或峰高)及相对校正因子。
在此实验中将使用内标法来测定烟碱的含量方法如下:内标法是将一定重量的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混 合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析,分别测定内标物和待测组分的峰面积(或峰高)及相对校正因子,可求出被测组分在样品中的百分含量：
校正因子（f）： f= (As/ms)/(Ar/mr)
其中 As 和 Ar 分别为内标物和对照品的峰面积或峰高,ms 和 mr 分别为 加入内标物和对照品的量。
根据含内标物的待测组分溶液色谱峰响应值,计算烟碱含量（mi）： mi=f×Ai/(As/ms) 其中 Ai 和 As 分别为供试品和内标物的峰面积或峰高，ms 为加入内 标物的量（必要时，再根据稀释倍数、取样量和标示量折算成为标示量的百分含量,或根据稀释倍数和取样量折算成百分含量）。
1.3 检测方法学考察
1.3.1 线性关系的考察【2】
两个变量之间存在一次函数关系，就称它们之间存在线性关系.正比例关系是线性关系中的特例，反比例关系不是线性关系，。更通俗一点讲，如果把这两个变量分别作为点的横坐标与纵坐标，其图象是平面上的一条直线，则这两个变量之间的关系就是线性关系。即如果可以用一个二元一次方程来表达两个变量之间 7
关系的话，这两个变量之间的关系称为线性关系，因而，二元一次方程也称为线性方程。推而广之,含有n个变量的一次方程，也称为n元线性方程，不过这已经与直线没有什么关系了。
1.3.2 精密度的考察【3】
用该法测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合的程度。它们越接近就越精密。常用标准(偏)差(standard deviation，SD或S)；相对标准(偏)差(relative standard deviation，RSD),也称变异系数(coefficient of variation，CV)。分析时,常用RSD表示精密度。
1.3.3 重现性实验的考察
用相同的方法,同一试验材料，在不同的条件下获得 的单个结果之间的一致程度。当分析方法将被法定标准采用时,应进行重现性试验。
1.3.4 回收率
回收率是反应待测物在样品分析过程中的损失的程度，损失越少,回收率越高,如果作标液 1PPM,就是1毫克/升,而作出标准数据为0.99 毫克/升，就是说你的回收率是 99％,这个与真实成分有密切的关系，说明方法的准确度。
1.3.5 验证性
验证性实验是指对研究对象有了一定了解,并形成了一定认识或提出了某种假说,为验证这种认识或假说是否正确而进行的一种实验.验证性实验强调演示和证明科学内容的活动,科学知识和科学过程分离,与背景无关,注重探究的结果(事实,概念,理论),而不是探究的过程.验证性实验传递了这样一种信息:了解一个发现和如何把这个发现的结果应用到一个确定的问题上比直接学习如何发现要重要得多.验证性实验强调实验操作和观察等个别智力技能,强调任何快速经济的获得生物知识.
2 实验部分
2.1 目的
8
①内标法测定烟碱含量；
②学会对实验的结果的线性关系；精密度实验；重现性试验及实验结果的分析。
2.2
2.2.1 材料和仪器 材料
98％烟碱(自制备) 、喹啉(分析级别)、水（蒸馏水）、进样量为1ul、甲醇（分析级别）
2.2.2 仪器
气相色谱仪（7890Ⅱ型上海天美公司）、毛细管柱 （30m length TM—WAX From 20℃ to 260℃）
2.3 色谱条件
气体流速:N2 30ml/ min Air 30ml/min H2 50ml/min
柱箱温度（OVEN）170℃ 进样口温度（INJ）270℃
检测器温度（DET）270℃
2.4 实验设计及结果分析
通过实验及对实验结果的分析得出以下结论。
2.4.1 线性关系实验的考察
所用试剂：100ug/mL烟碱甲醇溶液， 100ug/mL喹啉甲醇溶液，甲醇（99%以上）
配制浓度分别为1、10、20、30、40、50ug/ml的烟碱甲醇溶液，内含50ug/ml的喹啉，吸取1ul进样检测，并记录烟碱和喹啉的峰面积及峰高，计算出它们之间的峰高比和面积比，结果见表1。
表1：烟碱/喹啉的峰高比及面积比 Table 1:peak height ratio and area ratio of nicotine/ quinoline
Test uL
-------------------------------------- peak height ratio area ratio
9
No. nicotine quinoline methyl hydroxide 峰高比 面积比 1 0 500 500 0 0
2 100 500 400 0.014421 0.022468
3 200 500 300 0.106262 0.129319 4 300 500 200 0.209760 0.248217 5 400 500 100 0.437736 0.471182 6 500 500 0 0.597969 0.589386
用Origin7.5软件处理数据，作图如下所示
：
图1 烟碱/喹啉的峰高比
Fig. 1 peak height ratio of nicotine/ quinoline
以烟碱与喹啉的峰高比为Y轴，以烟碱含量（单位ug）为X轴的回归方程分别为Y= A + B * X(r=0.97081) 由此可以看出烟碱含量在0—50ug/ml范围内，采用气相色谱法测定时其浓度与峰高比呈良好的线性关系。
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A -0.17634 0.05006
B 0.01499 0.00151
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0.98512 0.04773 5 0.00217
------------------------------------------------------------
用Origin7.5软件处理数据作图如下：
10
Y = A + B * X
Parameter Value
A
B
R -0.1506 0.01476 SD Error 0.03735 0.00113 N P ------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------
0.99138 0.03562 5 9.60189E-4
图2 烟碱与喹啉的面积比
Fig. 2 area ratio of nicotine/ quinoline
以烟碱与喹啉的面积比为Y轴，以烟碱含量（单位ug）为X轴的回归方程分别为Y= 0.01476X -0.1506 (r=0.99138)由此可以看出烟碱含量在0—50ug/ml范围内，采用气相色谱法测定时其浓度与峰面积比呈良好的线性关系。
线性关系试验中，t检验峰值比的t= 8.320 >t0.01，面积比的t= 6.750 >t0.01，查表t0.01= 4.604，说明线性关系较好。
2.4.2 精密度实验的考察
配制浓度为50ug/ml的烟碱甲醇溶液，内含50ug/mL的喹啉，取同一支试管中的试液连续进5针，并记录烟碱和喹啉的峰面积及峰高，计算出它们之间的峰高比和面积比，结果见表2。
11
表2：精密度试验
表2：精密度试验
Table 2 ：precision
Test uL
---------------------------- peak height ratio area ratio No. nicotine quinoline
1 500 500 0.597969 0.589386 2 500 500 0.709997 0.695886 3 500 500 0.610637 0.617886 4 500 500 0.568678 0.554308 峰高比S=0.097325 RSD%= 12.51 %
面积比S=0.104331 RSD%= 13.96 %
配制浓度为50ug/ml的烟碱甲醇溶液，内含50ug/mL的喹啉，5支试管中的试液各进1针，并记录烟碱和喹啉的峰面积及峰高，计算出它们之间的峰高比和面积比，结果见表3。
表3：重现性试验
参考文Table 3： reproducibility
Test uL
---------------------------- peak height ratio area ratio No. nicotine quinoline
1 500 500 0.610637 0.617886 2 500 500 0.568678 0.554308 3 500 500 0.681878 0.710168 4 500 500 0.604653 0.600463 5 500 500 0.641129 0.630362 峰高比S= 0.059543 RSD%= 5.64 %
面积比S=0.059828 RSD%=5.83 %
2.4.4 结果分析
线性关系试验中，t检验峰值比的t=8.320>t0.01，面积比的t=6.750>t0.01，查表t0.01=4.604，说明线性关系较好。
12
精密度试验及重现性试验，就差异系数而言，RSD﹪> 5﹪，精密度不是很好。偶然误差存在几率较大，但也有可能操作人员不熟练出现“误差”，造成结果不精确。
参考文献
【1】《液质连用法测定血浆中连红霉素的内标法与外标法比较》张丽芳，薛飞群。
【2】张荣建.《仪器分析实验》.科学出版社.
【3】赵文宽.《仪器分析实验》.高等教育出版社，2003
【4】《分析化学》,2007
13