1. 目 的
描 述 Waters 高 效 液 相 色 谱 仪 标 准 操 作 规 程 。
2. 适 用 范 围
化 验 室
3. 责 任 者
化 验 员 应 严 格 遵 照 该 操 作 规 程 , QC 主 管 负 责 监 督 本 规 程 的 实 施 。
4. 定 义
HPLC High Performance Liquid Chromatography , 高 效 液 相 色 谱 仪 。
5. 安 全 注 意 事 项
1
2
3
4
5
5.1 有 机 溶 媒 有 害 健 康 ， 各 溶 剂 瓶 口 应 封 严 。
5.2 检 查 废 液 桶 中 废 液 应 避 光 ， 防 止 废 液 桶 满 外 溢 。
6. 规 程
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
6.1 Waters HPLC的 组 成 ： 贮 液 器 ® 输 液 泵 ® 自 动 进 样 器 ® 分 离 柱 (柱 温 箱 ) ® 紫 外 检 测 器 ® 控 制 及 数 据 处 理 系 统 (Millennium 32化 学 工 作 站 )。
6.2 HPLC系 统 的 打 开 及 关 闭 顺 序
1
2
3
4
5
6
6.1
6.2
6.2.1 打 开 顺 序
对 于 分 体 式 ： 请 按 泵 、 进 样 器 、 柱 温 箱 、 检 测 器 的 顺 序 打 开 开 关 ， 待 各 部 分 分 别 显 示 初 始 化 完 毕 后 ， 最 后 打 开 Millennium 32化 学 工 作 站 。
泵 与 色 谱 工 作 站 的 连 接：对 于 510 泵，因 为 此 泵 与 色 谱 工 作 站 是 单 向 联 系 ， 如 要 使 泵 在 Remote 状 态 下 由 工 作 站 控 制 ， 首 先 要 在 泵 的 键 盘 上 按 Menu 键 ， 待 显 示 屏 切 换 至 Mode 状 态 下 ， 其 状 态 是 Loca ，按 Edit/Enter 键 ，在 Local 的 L 前 有 闪 动 的 光 标 显 示，按Ù 键， Local 转 换 成 Rem， 再 按 Edit/Enter 键，此 命 令 已 输 入 进 去, 最 后 按 Stop/Run 键， 使 泵 处 于Run 状 态 这 时 泵 和 工 作 站 的 连 接 即 告 成 功。 泵 的 任 何 动 作 都 可 由 工 作 站 来 控 制。还 应 注 意 这 一 步 工 作 在 每 次 开 机 时 都 要 进 行。
对 于 Alliance 2690 系 统 ： 先 打 开 Alliance 2690 主 机 、 检 测 器 电 源 开 关，待 初 始 化 完 毕 后 ，再 进 入 Millennium 32 化 学 工 作 站。
对 于 流 动 相 的 要 求：对 于 液 体 试 剂 应 尽 量 采 用 色 谱 纯 试 剂； 对 于 所 用 到 的 固 体 试 剂 应 采 用 分 析 纯 试 剂； 对 于 水，应 采 用 经 纯 水 机 处 理 过 的 超 纯 水； 流 动 相 在 使 用 前 一 定 要 经 0.45mm 的 滤 膜（ 滤 膜 分 为 水 相 膜 与 有 机 相 膜， 确 保使 用 正 确 的 滤 膜， 参 见 附 表 ) 过 滤、超 声 真 空 脱 气 方 可 使 用， 严 禁 含 盐 的 流 动 相 未 经 过 滤 直 接 使 用。
应 养 成 良 好 操 作 习 惯：
规 范 操 作 ， 树 立 保 护 HPLC 整 套 系 统 的 概 念 ，尤 其 对 于 输 液 泵、色 谱 柱、检 测 器，在 使 用 后 应 及 时 冲 洗，以 免 污 染 而 使 其 寿 命 缩 短 或 损 坏，尤 其 如 操 作 者 使 用 了 含 盐 的 流 动 相， 更 应 注 意 清 洗 的 步 骤： 首 先 用 脱 过 气 的 纯 水 在 流 速 为1ml/min 左 右 冲 洗 30～60 分 钟 ， 再 用 含 50％ 以 上 甲 醇 或 乙 腈 的 水 溶 液 以 相 同 的 流 速 冲 洗 20～30 分 钟 左 右。
如 要 卸 下 柱 子， 在 经 过 上 述 冲 洗 过 程 之 后，再 经 纯 甲 醇 或 乙 腈 以1ml/min 的 流 速 冲 洗 20~ 30 分 钟，柱 子 卸 下 后 应 马 上 拧 紧 柱 堵。
流 速 的 变 化 应 采 用 阶 梯 式 递 增 或 递 减 的 方 式， 启 动 泵 时， 应 在 2 分 钟 之 内 由 小 流 速 慢 慢 增 大 到 所 需 的 流 速， 泵 关 闭 时 亦 然( 流 速 递 减)。 切 忌 流 速 的 骤 变。
1
2
3
4
5
6
6.1
6.2
6.2.1
6.2.2 关 闭 顺 序
首 先 退 出 Millennium 32化 学 工 作 站， 再 关 闭 系 统 的 其 他 部 分 。
6.3 Millennium 32化 学 工 作 站
Millennium 32色 谱 管 理 系 统 是 集 数 据 采 集 、 处 理 、 HPLC系 统 的 控 制 、 结 果 的 管 理 、 报 告 的 打 印 为 一 体 的 综 合 系 统 。 下 面 就着 重 介 绍 该 系 统 的 基 本 操 作 知 识 。
6.3.1 Millennium 32化 学 工 作 站 的 进 入
打 开 化 学 工 作 站 ， 系 统 自 动 进 入 Program Manager界 面 ， 双 击 Millennium 肖 像 ， 这 时 进 入Millennium界 面 ， 双 击 Session Manager 图 标 ， 系 统 将 自 动 初 始 化 ， 以 使 工 作 站 和 HPLC整 套 系 统 进 行 联 接 。 初 始 化 后 ， 按 系 统 要 求 键 入 你 的 User Name和 Password， 这 时 你 已 进 入 该 系 统 。
1
2
3
4
5
6
6.1
6.2
6.3
6.3.2
6.3.2 Project的 进 入 和 建 立
Project的 进 入： 在 Session Manager窗 口 下 ， 击 Project肖 像(或 从 View中 选 择 Projects), 在 其 中 有 已 建 好 的 Project， 双 击 你 所 需 的 Project肖 像 ， 再 进 行 你 想 做 的 工 作 。
Project的 建 立
从 File中 选 择 New， 即 显 示 New Project的 画 面 。
在 Project Name 中 输 入 你 的 Project 名 称 。
在 Initiallze Project 项 目 中 选 择 Copy 中 的 filter and fields 或 Methods。
在 From Project 中 选 择 要 拷 贝 的 现 存 Project。
选 择 Tablespace size。
选 OK， 存 贮 并 退 出 。
当 Millennium 软 件 在 建 立 一 个 新 的 Project 时 ， 在 屏 幕 上 及 时 显 示 出 完 成 建 立 新 Project 的 百 分 比 。 当 达 到 100% 时 ， 在 SessionManager 画 面 即 出 现 一 个 新 的 Project 肖 像 。
6.3.3 收 集 数 据 的 一 般 过 程
使 用 Millennuium32收 集 数 据 的 一 般 过 程 如 下 ：在 Project 窗 口 内 建 立 收 集 数 据 所 需 仪 器 的 仪 器 方 法； 建 立 包 括 此 仪 器 方 法 的 方 法 组 ； 使 用 此 方 法 组 收 集 数 据 。
本 部 分 包 括 ： 建 立 仪 器 方 法 ， 建 立 方 法 组 ， 收 集 样 品 。
· 建 立 /修 改 仪 器 方 法
从 Sessoin Manager窗 口 ， 打 开 所 需 的 Project。
选 择 Method 按 钮 ， 现 存 的 方 法 的 肖 像 即 出 现 在 屏 幕 上 。
从 命 令 菜 单 中 选 择 File， 然 后 选 择 其 中 的 New Instrument Method， 即 出 现 System Open 对 话 框 。
在 目 录 中 选 择 收 集 数 据 需 要 使 用 的 色 谱 硬 件 系 统 的 名 称 ， 如 ： System_1。 按 OK， 这 时 Instrument Method 窗 口 即 显 示 出 来 。
窗 口 的 上 部 分 是 该 系 统 的 所 有 仪 器 的 肖 像 。 用 鼠 标 器 将 需 要 设 定 仪 器 参 数 的 仪 器 部 件 激 活 ， 然 后 在 仪 器 肖 像 上 双 击 两 下 ， 即 出 现 Instrument Dialog Box 画 面 。
对 各 个 部 件 设 置 操 作 条 件 ， 或 通 过 输 入 新 的 参 数 来 更 改 以 前 的 参 数 。 例 如 ： 定 义 泵 参 数 ， 先 双 击 SIM/PCM 的 肖 像 。 填 写 泵 参 数 ， 按 OK。
当 所 有 参 数 设 置 完 成 后 ， 按 OK。 即 回 到 Instrument Method 窗 口 。 选 File 中 的 Save As 存 贮 仪 器 方 法 文 件 ， 如 有 需 要 ， 起 一 文 件 名 ， 按 OK。
选 择 File 中 的 Exit， 即 回 到 Project 窗 口 。 新 的 仪 器 方 法 肖 像 即 出 现 在 此 窗 口 下 。
· 建 立 方 法 组 (Method Set)
仪 器 方 法 编 好 后 ， 必 须 存 于 一 方 法 组 中 ， 才 能 在 Quick Set Control 中 调 用 。
在 Project 窗 口 下 选 方 法 肖 像 。
选 File 中 的 New Method Set， 即 显 示 出 Method Set 对 话 框 。
在 此 画 面 的 Instrument Method 一 栏 ， 选 择 已 确 定 的 仪 器 方 法 。 其 他 项 目 可 空 着 不 填 。 然 后 选 File， Save As。 输 入 方 法 组 名 后 ， 按 OK。
选 File， Exit。 即 退 回 到 Project 窗 口 。 新 设 置 的 方 法 组 肖 像 即 出 现 在 此 窗 口 下 。
· 收 集 样 品 ：完 成 以 上 各 步 骤 后 ， 即 可 收 集 样 品 。
在 Project 窗 口 下 选 择 Quick Set Control 肖 像 。 出 现 System Open 对 话 框 。
选 择 建 立 仪 器 方 法 时 确 定 的 色 谱 硬 件 系 统 ， 按 OK。 即 出 现 Quick Set Control 窗 口 。
在 此 窗 口 下 的 Sample Loading Table 中 用 鼠 标 器 按 第 一 行 ， 这 时 Millennium 软 件 会 自 动 填 充 各 项 初 始 参 数 。 通 过 输 入 新 值 可 更 改 表 中 的 各 项 参 数 ， 表 中 的 瓶 号(对 于 高 效 液 相 色 谱 仪 的 进 样 表 ，除 另 有 规 定 外 ， 按 括 号 法 安 排 进 样 顺 序 。 即 第 一 针 为 标 准 品 1作 为 系 统 适 用 性 共 进 6针 ， 要 求 RSD不 大 于 2%， 随 后 为 标 准 品 2， 进 样 次 数 为 2针 ， 然 后 为 样 品 1到 样 品 3， 各 进 2针 。 样 品 3 后 为 标 准 品 1，依 次 类 推 ， 直 到 将 所 有 样 品 都 安 排 在 进 样 表 中 ) 进 样 次 数 ， 进 样 体 积 ， 运 行 时 间 等 项 目 对 自 动 进 样 器 有 控 制 作 用 。
在 Method Set Report 一 列 中 选 择 在 前 面 刚 刚 建 立 的 方 法 组 。
在 运 行 方 式 ( mode )中 选 Run Only。
选 择 进 样 方 式： 菜 单mode 下 选 单 个 样 品 或 样 品 组 进 样。
将 Sample Loading Table 中 第 一 行 点 黑 。 击 Setup Instrument 按 钮 ， 启 动 系 统 。
系 统 启 动 后 可 击baseline monitor 图 标， 即 可 观 察 基 线 。
待 基 线 平 稳 后 ， 击 绿 灯 或 样 品 盘 肖 像 准 备 进 样 。 出 现 Injector wait 提 示 信 息 ， 随 即 进 样。
在 样 品 测 试 过 程 中， 系 统 会 在 Quick Set 窗 口 下 显 示 瓶 号 和 进 样 次 数 及 运 行 时 间 。 并 可 在 此 窗 口 下 观 察 检 测 器 的 输 出 情 况 。 屏 幕 上 显 示 的 检 测 器 输 出 是 自 动 满 量 程 方 式 (即 自 动 按 最 大 信 号 满 格 输 出 )。
当 收 集 完 色 谱 数 据 后 ， 选 择 File， Exit。 退 出 Quick Set 窗 口 。 样 品 收 集 完 成 后 ， Millennuium32会 自 动 存 贮 收 集 的 数 据 。
6.3.4 建 立 数 据 处 理 的 方 法
在 Millennuium32中 ， 完 成 不 同 的 任 务 需 编 辑 不 同 的 方 法 ， 如 仪 器 方 法 (收 集 数 据 )， 处 理 方 法 (定 性 定 量 分 析 )， 报 告 方 法 (打 印 实 验 报 告 )等 。
本 部 分 包 括 ：
*重 新 调 出 色 谱 峰 进 行 观 察 。
*谱 图 积 分 及 确 定 积 分 表 中 的 参 数 。
*输 入 组 分 表 资 料 。
*存 贮 数 据 处 理 方 法 。
· 调 阅 色 谱 图
进 入 在 其 中 收 集 样 品 的 Project， 在 此 窗 口 下 选 Channel 肖 像 。
在 Channel View Table 中 选 择 欲 进 行 色 谱 分 析 的 文 件 行 并 使 其 变 黑。
在 Tools 下 选 择 Review 肖 像 ， 这 时 在 Review Data窗 口 下 即 显 示 出 你 调 入 的 色 谱 图 。
选 File， New Method。 在 New Method 对 话 框 中 指 定 数 据 处 理 的 类 型 ， 如 LC， 选 OK。
· 色 谱 图 的 积 分
选 View， Integration Table。 在 屏 幕 下 部 即 出 现 Integration Event Table。
在 Peak Width， Minimum Area， Minimum Height 方 框 中 输 入 适 宜 的 数 值 。
按 Integration 按 钮 ， 观 察 积 分 情 况 ， 并 适 当 进 行 积 分 参 数 的 调 整 。
· 输 入 组 分 资 料
选 View， Component Table。 即 可 见 到 空 的 组 分 表 。
选 Options， Fill Table From Result， 即 可 自 动 填 充 积 分 完 毕 的 色 谱 图 的 组 分 表 。 也 可 用 手 动 方 式 修 改 表 中 的 参 数 。
按 Calibration/Quantitate 后 ， 选 View， Result Table。 即 可 看 到 积 分 的 结 果 。
· 存 贮 数 据 处 理 方 法
在Review Data 窗 口 下，选 File， Save Method。 在 Processing Method Save As 对 话 框 的 窗 口 下输 入 数 据 处 理 方 法 名 称 。
按 OK， 贮 存 Processing Method。 在 组 分 表 的 上 方 可 看 到 新 的 Processing Method 的 名 称 。
选 File， Exit。 即 可 退 出 Review Data 窗 口 ， 回 到 Project 窗 口 。
6.3.5 重 新 观 察 色 谱 结 果
· 进 入 你 所 需 的Project 窗 口 。 击 Result View 肖 像 。
· 在 Result View Table 中 选 择 你 想 观 察 的 色 谱 数 据 。
· 击 Review 肖 像 ， 你 所 选 择 的 第 一 个 色 谱 数 据 的 谱 图 将 在 Review Data 窗 口 下 ， 其 结 果 将 显 示 在 Result Table 中 的 第 一 行 。
· 按 Next Ch/Inj 的 方 框 即 可 看 到 下 一 针 进 样 的 有 关 资 料 。
· 选 File， Exit。 即 可 回 到 Project 窗 口 。
6.3.6 报 告 方 法 的 编 辑 及 试 验 报 告 的 打 印
· 启 动 报 告 出 版 系 统
进 入“PROJECT” 窗 口。
在Views 下 按 一 下 方 法 肖 像。
选 择File，New Report Method。 这 时 即 可 编 辑 新 的 报 告 方 法。
在 报 告 排 版 窗 口 中， 右 边 为 一 张 模 拟 的 白 纸， 左 上 方 的 列 表 为 排 版 时 可 放 置 在 右 边 纸 上 的 项 目。 如 图 谱， 积 分 表， 样 品 信 息， 仪 器 方 法 等， 左 下 方 为 报 告 头 标 和 脚 标（ 如 土〕。 选 择Individual 为 每 个 结 果 有 一 个 报 告， 选Summary of Result Sets All 方 式 为 打 一 个 集 中 的 报 告。 按OK。
· 设 计 报 告 格 式
按 一 下Chromatogram Groups 肖 像。 在 Chromatogram Groups 列 表 中 选 择Auto-scaled Chromatogram 。 并 在 报 告 页 面 上 按 一 下， 用 鼠 标 器 将 此 图 形 放 在 画 面 合 适 的 位 置 上。
用 鼠 标 器 将 箭 头 放 在 画 面 的 边 缘， 当 箭 头 变 成 双 箭 头 时 将 图 形 放 大 或 缩 小。
选 择Format，Landscape。 可 将 图 谱 垂 直 放 置。
按 一 下Method Group 肖 像， 从Method Group 的 列 表 中 选 择Instrument Method， 并 在 报 告 页 面 上 的 合 适 处 按 一 下。 这 时 Instrument Method 方 框 将 出 现 在 报 告 页 面 上。
按 一 下Table Groups 肖 像， 在 Table Groups ， 并 在 报 告 格 式 上 的 合 适 位 置 上 按 一 下。
选 择Format，Page Size。 可 改 变 报 告 尺 寸 的 大 小。
选 择Customize，Header。 即 出 现Header 窗 口。 在 此 窗 口 下 选 择General information 肖 像。在 General information Field 列 表 中 按 一 下Date。 这 时 在Field Name 的 方 框 中 即 出 现Date 方 框。 可 用 鼠 标 器 将 此 方 框 移 动 到 合 适 的 位 置。
可 用 文 字， 箭 头， 方 框 等 工 具 在Header 窗 口 下 增 加 你 感 兴 趣 的 内 容。
选File，Save。 输 入 Header 的 名 称 （如：My_Header〕， 按 OK， 返 回 到Header 窗 口。
选File，Exit。 即 回 到Report Publisher 窗 口。
在 Customize，Footer。 即 出 现 Footer 窗 口。
按 一 下 General information 肖 像， 在General information Field 列 表 中 按 一 下Page Number 的 方 框。 将 此 方 框 放 在 报 告 页 面 的 注 脚 位 置 上。
选File，Save。 输 入Footer 的 名 称 ( 如：My_ Footer )， 按OK， 返 回 到Footer 窗 口。
选File，Exit。 回 到Report Publish 窗 口。
在Footer 列 表 中 选 刚 编 好 的 脚 标。
· 存 储 报 告 方 法
选File，Save。 输 入 此 报 告 的 方 法 名 ( 如：My_ Report ) ， 按 OK， 返 回 到 Report Publisher 窗 口。
选File，Exit。 即 回 到PROJECT 窗 口。 在 此 窗 口 下 即 可 看 到 My_ Report 报 告 方 法 的 肖 像。
· 报 告 格 式 预 览： 报 告 格 式 设 计 好 后， 在 打 印 之 前， 可 在 此 预 先 看 到 打 印 效 果， 如 需 修 改 可 随 时 切 换 到 报 告 出 版 窗 口， 边 看 边 修 改， 直 到 满 意 为 止。
在PROJECT 窗 口 下， 选Result 肖 像， 即 出 现Result View Table 表。
在 此 表 上 选 择 需 要 报 告 的 结 果 文 件， 使 其 变 黑。
按 一 下Preview 肖 像， 即 出 现Report Method Selection 窗 口。
从 目 录 上 选 择 刚 才 已 建 立 好 的 报 告 方 法， 按 OK。 这 时 即 出 现 刚 才 所 选 结 果 的 报 告。
在 上 画 面 上 按NextPage 或PrevPage 即 可 看 到 报 告 的 下 一 页 或 上 一 页。
按 方 法 编 辑 肖 像 即 可 对 当 前 方 法 进 行 编 辑。
按 打 印 肖 像， 即 可 将 此 报 告 打 印 出 来。
选 择File，Exit。 即 可 退 出 报 告 画 面， 回 到“PROJECT” 窗 口。
6.3.6
1
2
3
4
5
6
6.1
6.2
6.3
6.3.1
6.3.2
6.3.3
6.3.4
6.3.5
6.3.6
6.3.7 批 量 进 样 结 果 的 处 理 及 打 印 报 告
· 当 已 有 确 定 的 处 理 方 法 后 ， 可 用 此 方 法 处 理 数 据 。
在 Channel View Table 表 中 选 择 你 要 的 样 品 行 并 将 其 按 黑 。
在 Tools 下 击Process and Report 肖 像 。 这 时 即 出 现 Process and Report Options 对 话 框 。
在 处 理 方 法 一 栏 中 选 择 Use Specified Prosessing method 并 指 定 处 理 方 法 ， 把 Print 选 择 框 的 叉 扇 掉 。 按 OK。 这 时 开 始 处 理 你 所 选 的 数 据 ， 在 屏 幕 下 方 显 示 出 Result Generator 肖 像 。
按 Result View 肖 像 ， 处 理 后 的 数 据 即 出 现 在 Result View Table 中。
· 打 印 报 告
在 Result View Table 表 中 选 择 你 要 的结 果 行 并 将 其 按 黑 。
在 Tools 下 按 一 下 打 印 机 肖 像 ， 这 时 出 现 Background Report Generator 对 话 框 选 择 你 所 要 用 的 报 告 方 法 ， 按 OK。 色 谱 报 告 即 可 打 印 出 来 。
6.3.8 使 用 后 应 填 写 使 用 记 录 (参 见 附 录 1)。
2.
3.
4.
5.
6.
6.1.
6.2.
6.3.
6.4. 日 常 维 护
6.4.1 在 每 次 运 行 样 品 组 之 前 需 做 如 下 系 统 维 护：
检 查 并 及 时 更 换 洗 针 溶 液；用 水、甲 醇- 水 （1：1）冲 洗 系 统 15-30 分 钟，再 改 用 流 动 相 来 平 衡 系 统 ；在 自 动 进 样 器 上 用 手 动 方 式 清 洗 进 样 器 和 取 样 针 3-5 遍；用 洗 瓶 清 洗 泵 的 柱 塞 杆。
6.4.2 在 每 次 运 行 样 品 组 之 后 需 做 如 下 系 统 维 护：
用 水、比例为1：1的甲 醇-水或乙 腈-水，冲 洗 系 统 20-30分 钟；在 自 动 进 样 器 上。 用 手 动 方 式 清 洗 进 样 器 和 取 样 针 3-5遍；用 洗 瓶 清 洗 泵 的 柱 塞 杆。
每 年 由 沃 特 斯 公 司 的 维 修 工 程 师 进 行 一 次 大 修。
7. 参 照
《 Waters 515 输 液 泵 操 作 手 册》
《 Waters 717 自 动 进 样 器 操 作 手 册 》
《 Waters 486 紫 外 检 测 器 操 作 手 册 》
《 Waters Millennuium32 工 作 站 操 作 手 册 》
《 Waters 2690 系 统 操 作 手 册》
8. 分 发 部 门
质 量 保 证 部
附 录 1：
Waters高效液相色谱仪使用记录
附 录 2
高效液相色谱仪维护记录
