实验三、 间接免疫荧光法检测血清中抗核抗体

一、实验目的：

1、掌握免疫荧光法的原理。

2、掌握免疫荧光法检测过程中避免非特异荧光干扰的方法。

二、实验原理：

间接免疫荧光技术是利用荧光抗体标记第二抗体检测未知抗原或未知抗体（第一抗体）的方法。以检测人血清抗核抗体（ANA）为例。病人血清中ANA（Ab）能与各种系细胞核成分（Ag）特异性结合，此种结合的Ab（IgG型）能与荧光标记的羊抗人IgG（二抗）结合，在荧光显微镜下，细胞核显示荧光，提示血清中ANA的存在。

三、试验材料：

0.1M，pH6.8PBS；小白鼠，待测血清，对照血清（阴性血清），羊抗人IgG荧光抗体、滴管、试管、孵箱、荧光显微镜等。

四、实验步骤：

1、小鼠断颈处死取肝，NS漂洗，剪取肝横断面印片于玻片上，左右各一处，自然干燥；滴加无水乙醇固定，室温凉干；

2、左右印片处分别盖上一片小纸片，分别滴加阳性血清和阴性血清各1滴，37℃30′；

3、去除纸片，PBS冲洗1min×3次，吸干水分；

4、左右印片处分别盖上一片小纸片，并滴加荧光标记羊抗人IgG（二抗）各1滴，37℃30

5、去除纸片，PBS漂洗1min×3次，吸干水分；

6、荧光显微镜镜检。

五、实验结果：

荧光显微镜下观察：

细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性；抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性；阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。

（均质型）细胞核呈均匀一致的荧光 (斑点型)细胞核内呈现斑点状荧光

六、实验讨论：

1、注意事项：

1）制作核抗原片（印片）不宜太厚；

2）滴加的血清或荧光抗体要充分盖满抗原片；

3）荧光抗体孵育时要注意避光;

4）染色后的片子应及时镜检，不宜放置过久。

5） 注意各步骤的漂洗要充分。

2、临床意义：

1）总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一个极为重要的筛选试验。绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。ANA阳性者进一步检测各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病情观察、预后及治疗评价有重要意义。

2）未经治疗的、活动性SLE的阳性率为80%－100%。药物性狼疮100%、全身硬皮病、混合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁性肝硬化等。

3） 干燥综合症（SS）、类风关、桥本甲状腺炎等。

3、间接免疫荧光法的优缺点：

优点：

1)制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种Ab检测

2)特异性、灵敏度高

3）快速、可定位。

缺点：

1）需要荧光显微镜

2）存在非特异荧光干扰（产生原因：自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题）

3）定性测定、判断结果不客观

4）制备片子难保存（荧光猝灭）

第二篇：实验课-分子荧光光谱法实验报告

实验二    分子荧光光谱法

[实验目的]

1、掌握荧光光度计的基本原理及使用。

2、了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用；

3、掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱：激发光谱、发射光谱的测定方法。

[实验原理]

1、激发光谱与发射光谱

具有不饱和基团的基态分子经光照后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态各振动能级所产生的光辐射。

激发光谱：是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长（或频率）变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。

荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱；获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的不变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以为纵坐标，为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱， 从曲线上找出，实际上选波长较长的高波长峰。

发射光谱：是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。发射光谱的获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以为纵坐标，为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱，从曲线上找出最大的。

2、荧光分光光度计

包括四个部分，即激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点是有两个单色器，光源与检测器通常成直角。

单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器

光源：氙灯、高压汞灯、激光器(可见与紫外区)

检测器：光电倍增管

[仪器材料]

仪器：HORIBA Fluoromax-4荧光光谱仪

试剂：罗丹明B、2-萘酚、3,3'-Diethyloxadicarbocyanine iodide（碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰花青）浓度分别为、、、、以及未知浓度试样一份。

[实验步骤]

1、按照实验原理中的方法分别扫描得到罗丹明B、2-萘酚和碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰化青（选取最高浓度的标准样品）的分子荧光光谱，确定三者各自的激发波长和发射波长。扫描确定未知溶液的和，根据图谱形状和激发、发射最大波长等信息确定未知溶液的物质种类。

2、在选定的激发波长和发射波长下，测定不同浓度碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰化青标准溶液的相对荧光强度。

3、以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，绘制碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰化青的标准曲线。

4、依据碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰化青的标准曲线和未知溶液在和的相对荧光强度（由步骤1已确定为羰化青溶液）推算出其浓度。

图一  分子荧光分析仪基本部件示意图

[实验结果及分析]

图二1  罗丹明B激发光谱                          图二2  罗丹明B荧光光谱

图三1  2-萘酚激发光谱                              图三2   2-萘酚荧光光谱

            

图四  罗丹明B分子结构                             图五    2-萘酚分子结构

发射光谱与激发光谱没有直接关系，发射光谱波长一般比激发光谱波长要长。从荧光光谱上可得出罗丹明B的，2-萘酚的。由于具有共轭体系的芳环或杂环化合物，p电子共轭程度越大，越易产生荧光；环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强。分析两种物质分子结构可知，罗丹明B共轭程度更大，因此荧光波长更长，与实验值相符合。

表一 标准曲线法实验数据

图六  标准曲线

（注：从曲线可以看出数据点（40，13440）严重偏离曲线，故舍去）

分析未知试样的激发光谱和荧光光谱可知其，，查阅相关文献可知为3,3'-Diethyloxadicarbocyanine iodide（碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰花青），根据标准曲线可知未知样品浓度。

[实验小结]

1、从实验图上可以看出有许多尖峰属于误差，最大值应当选择平缓的位置，避免尖峰位置。

2、在标准曲线上可以看到有一数据点严重偏离曲线，舍去，可能原因为实验时短暂，操作上的误差，选择激发波长位置的仓促性以及经验性等。

3、通过这次实验，掌握了分子荧光光度计的应用方法和工作原理，熟悉并掌握了利用分子荧光光度计进行定性分析的实验方法和原理。