《免疫学实验》预习报告

实验名称：《乙肝表面抗体的检测》

姓名： 刘海涛 学号： 2012013337 组别： 2 实验原理：在微孔板上预包被纯化的乙肝表面抗原配以酶标记抗体及TMB等其他试剂采用夹心法原理检测人血清或其他动物血清的乙肝表面抗体。

实验方法与步骤：

1 样品采集；取静脉血3-4ml于干净容器中，分离出血清或血浆标本，如果不及时处理，就将其置于冰箱中。

2 ，试剂准备；乙肝病毒表面抗体诊断试剂盒。

3，平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18~25℃），微孔板板开封后，余者即时以自封袋封存。 5.2配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按1：19稀释后使用。 5.3编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。

4加样：分别在相应孔中加入50ul阴、阳性对照血清或待测样本。

5加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50ul；轻拍混匀。 5.6温育：置37℃温育25min。 6洗涤：用洗涤液充分洗涤5次、洗涤后扣干（每次应保持30~60s的浸泡时间）。 7显色：每孔加入底物A、B各50ul，轻拍混匀，37℃暗置15min。

8终止：每孔加入终止液50ul，混匀。

9测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时，需用空白对照调零,30min钟内完成测定），并记录结果。 6结果判定与分析

临界值（C.O.）的计算：临界值=阴性对照孔OD均值*2.1；阴性对照OD均值小于0.05时以0.05计算。 结果判定：样本OD值S/C.O.>=1者为HbsAb阳性 样本OD值S/C.O.<1者为HbsAb阴性 阴性对照均值>0.1或阳性对照均值<0.4时，

实验无效，应重新试验。

注意事项：

1每板设阴、阳性对照血清各两孔，设空白对照时，不加样品及酶标记抗原，其余各步相同。 2洗涤时各孔均须加满，防止孔内有游离酶未能洗净。 12.3加试剂前应将试剂瓶翻转数次，是液体混匀。

3所用样品、废液和废弃物都应按传染源处理。 12.5所有样本、试剂和各种废弃物应按传染物处理，严格防止交叉感染，严格健全和执行消毒隔离制度。对于含有传染病和怀疑含有传染源的物质，应有合适的生物安全保证制度。

4样本显色深浅与样品中抗体的含量没有一定的正相关。

5不同品名、不同批号的试剂不可混用，以免产生错误结果。

第二篇：医学免疫学实习指导

 

目录

免疫学实验的目的和要求............................................... 2

实验室规则.......................................................... 2

第一篇 非特异性免疫检测.............................................. 3

实验一 血脑屏障作用.............................................. 3

实验二 吞噬细胞的功能试验........................................ 4

实验三 溶菌酶的溶菌作用.......................................... 7

实验四 血清总补体活性测定（CH50单位测定）......................... 9

第二篇 特异性体液免疫检测........................................... 11

实验五 凝 集 反 应.............................................. 11

实验六 沉淀反应................................................. 17

实验七 补体结合反应............................................. 25

实验八 中和实验（ Neutrlization test ）.............................. 29

实验九 免疫标记技术............................................. 33

实验十 免疫血清的制备及效价测定.................................. 40

实验十一 体外抗体形成细胞检查法（溶血空斑实验 PFC）............... 43

第三篇 细胞免疫检测................................................. 46

实验十二 E-玫瑰花环形成实验..................................... 46

实验十三 淋巴细胞转化实验....................................... 48

第四篇：免疫病理反应................................................ 52

实验十四 豚鼠速发型过敏反应...................................... 52

实验十五 免疫复合物型超敏反应.................................... 53

实验十六 豚鼠结核菌素试验....................................... 55

实验十七 小鼠 DNFB 试验......................................... 56

免疫学实验的目的和要求

? 每次实验前必须做好预习，明确本次实验的目的、内容、操作要点和相关的理论知识。

? 进入实验室必须严格遵守实验室规则。

? 实验中听从老师指导，依照三严（严肃、严格、严密）要求进行实验，做好实验记录。

? 认真观察分析实验结果,写出实验报告。实验中遇到的有关问题,用科学的态度总结探讨其原因,培养分析问题和解决问题的能力。

实验室规则

? 进入实验室必须穿好白大衣。

? 除实验中必须的学习用品外，不要放实验台上。

?  实验室内不允许吃食品、饮水，严禁吸烟。

? 实验中一定要保持实验室安静，不要大声喧哗，严禁打闹。

? 实验要按老师要求操作，如发现问题要及时报告指导老师。

? 爱护实验器材，如有损坏应及时报告老师，需赔偿者按规定办理。

? 实验完毕要清理台面，需冲洗者按要求冲洗，需收回者按要求摆放整齐收回。

? 离开实验室时，一定要有专人负责关好门窗、水源及照明设备。

第一篇 非特异性免疫检测

实验一 血脑屏障作用

[基本原理]

    血脑屏障由软脑膜、脉络丛的毛细血管壁和包在壁外的神经胶质细胞形成的胶质膜构成，起着天然的屏障作用，可以阻挡病原微生物及毒性产物、异物颗粒包括染料颗粒等从血流进入脑组织和脑脊液内，从而保护中枢神经系统免受损害。

[实验材料]

2只小鼠 。    1ml无菌注射器（配4号针头）。  5%台盼蓝水溶液。

生理盐水 0.1ml。  眼科剪子和镊子等。

[实验方法]

? 用 1ml无菌注射器吸取5%台盼蓝水溶液经尾静脉注入两只小鼠体内，每只0.7ml，更换注射器，给其中一只小鼠颅内注射生理盐水0.1ml。

? 5-10分钟后观察小鼠皮肤，尤其是眼、嘴的颜色变化。

? 于 30-60分钟，见小鼠眼、嘴呈现蓝色，即窒息死亡，腹部向下固定。

? 由头到尾沿背中线剪开皮肤，暴露皮下、肌肉和内脏，观察颜色变化。

? 小心剖开颅骨和椎骨，暴露脑和脊髓，与皮下、肌肉及内脏比较；并比较 2只小鼠有何不同。

[实验结果]

未经颅内注射的小鼠，眼、耳、鼻皮下及肌肉均呈现明显的蓝色，但脑、脊髓均未变色；而经颅内注射的小鼠上述部位可呈现明显的蓝色。

[注意事项]

? 台盼蓝水溶液要经过滤后方可使用。

? 尾静脉注射要从远断进针；如推注容易，表明进入了血管；如引起皮下凸起或发白，说明未进入了血管；拔出针头，从稍近断进针。

（谢 明）

实验二 吞噬细胞的功能试验

巨噬细胞能吞噬鸡红细胞、中性粒细胞可吞噬多种细菌，如葡萄球菌等。将巨噬细胞和中性粒细胞分别与鸡红细胞、表皮葡萄球菌混合，孵育一定时间后涂片染色镜检；见巨噬细胞可吞噬鸡红细胞；中性粒细胞可吞噬葡萄球菌，可计算出吞噬异物的细胞数和吞噬细胞中吞入的异物数。在巨噬细胞中亦可见到鸡红细胞发生形态改变。具此可判断两类吞噬细胞的吞噬功能和消化功能，用以评价机体的免疫状态。

[实验目的]

证实吞噬细胞的吞噬作用。了解机体的非特异免疫防护作用。

一、 豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用測定（大吞噬） ：

[基本原理]

淀粉可以刺激豚鼠腹腔引起非感染性炎症滲出，在腹腔局部出现较多巨噬细胞，巨噬细胞则能吞噬注入腹腔的鸡红细胞等较大异物。

[实验材料]

? 实验动物：豚鼠

? 鸡红细胞悬液：从鸡翼下静脉或心脏取血，按 1 : 5比例保存于Alsever氏保养液中，放4 C°冰箱可用1个月，用前将鸡红细胞用生理盐水洗3次，第3次洗涤 2000r/min,5min，弃上清，压积细胞用生理盐水配制为5%鸡红细胞悬液，供大吞噬试验用。

? 5%淀粉肉汤溶液、姬姆萨染液、玻片、注射器等。

[实验方法]

? 取无菌 5%淀粉肉汤溶液5ml注入豚鼠腹腔，常规饲养三天；实验前1小时再次注入豚鼠腹腔无菌5%淀粉肉汤溶液5ml，然后注射5%鸡红细胞悬液5ml，轻揉其腹部，使鸡血球均匀分布。

? 在注射后 30分钟、1小时、2小时、3小时、分别用注射器抽取豚鼠腹腔液推片。

? 自然干燥后，姬姆萨染色，油镜观察。

[实验结果]

计算 100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数目及被吞噬的鸡红细胞的总数，并观察鸡红细胞的消化程度，按下列公式计算吞噬百分比和吞噬指数。

吞噬百分比 =× 100%                                  

吞噬指数 = × 100%

鸡红细胞被消化的程度分 4级：

Ⅰ级：未消化，胞质浅红或浅黄，胞核浅紫红色。

Ⅱ级：轻度消化，胞质浅黄绿色，核固缩，成紫蓝色。

Ⅲ级：重度消化，胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。

Ⅳ级：完全消化，巨噬细胞内只见形状类似鸡红细胞大小

的空泡，边缘正齐，胞核隐约可见。

二 中性粒细胞吞噬作用的測定（小吞噬） ：

[基本原理]

血液中的中性粒细胞有吞噬病原微生物等较小异物的能力。将新鲜血液和细菌混合，经合适的时间后涂片染色，即能观察到被吞噬到中性粒细胞内的但还没有被消化掉的细菌。

[实验材料]

? 白色葡萄球菌：肉汤培养液中 37 C°培养16-18小时待用。

? 新鲜抗凝人血 0.5ml。

? 瑞氏染液、显微镜、孵箱、玻片等。

[实验方法]

1．吸取0.1ml白色葡萄球菌液加入新鲜抗凝人血0.5ml中，摇匀，37 C°孵育30分钟。

2．孵育过程的前 20分钟，每隔5分钟轻轻振荡一次，共4次，后10分钟静置孵育。

? 孵育结束后，用毛细滴管从红细胞层表面吸取上清少许推片。

? 自然干燥后，滴加瑞氏染液染色 1分钟，再加等量蒸馏水混匀，静置4分钟水洗，晾干油镜观察。

[实验结果]

计算 100个中性粒细胞，分别计算吞噬有细菌的中性粒细胞数目和被吞噬的细菌总数，计算吞噬百分比和吞噬指数，正常人吞噬百分比为60%，吞噬指数大于1。（计算方法同前）

[注意事项]

? 血涂片应薄厚均匀适中，避免过薄或过厚。

? 瑞氏染液染色时间不能过长以免染色过重。

（谢 明）

实验三 溶菌酶的溶菌作用

[实验目的]

证实体液中溶菌酶的存在及溶菌酶对革兰氏阳性菌的溶解作用。

[基本原理]

溶菌酶的杀菌机理是其作用于细菌细胞壁的粘肽层，粘肽是细菌的细胞壁主要成分。溶菌酶能切断粘肽结构中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β- 1,4糖苷键，破坏粘肽支架，使细胞壁破坏。由于细菌细胞壁的重要功能之一是保护细菌，即抗低渗，故细菌失去细胞壁的保护作用后，在低渗环境中可发生溶解。溶菌酶的主要作用对象是革兰氏阳性菌。革兰氏阴性细菌细胞壁粘肽层外还有脂多糖、外膜和脂蛋白结构，故在一般情况下溶菌酶不易发挥直接做用。

[实验材料]

? 溶壁微球菌（ M.Lysodeikticus）：本菌是由空气中分离出的一种革兰氏阳性菌，对人不致病，菌落黄色，普通琼脂培养基生长良好，每月传代一次或冻干保存，用于制备溶壁微球菌琼脂平板。

? 标准溶菌酶：称取溶菌酶标准纯品，用 1/15mol.L -1 PBS配制为1000ug/ml原液，并稀释为100、50、10 ug/ml标准液，用前保存在冰箱中；用于阳性对照及制备标准曲线。

? 唾液：用无菌平皿收集唾液，可在同学间收集。

? 其它：无菌打孔器（孔径 2mm），无菌毛细吸管、米尺等。

[实验方法]

? 用无菌打孔器在溶壁微球菌琼脂平板上打孔，用针头挑出孔内琼脂，孔径 2mm左右，孔距5-20mm。

? 用毛细吸管取新鲜收集的唾液加入琼脂孔内，每孔加一滴，每滴约有 0.025ml,同时加标准溶菌酶作阳性对照。

? 置 24-28 C°下12-18h观察结果。

[实验结果]

用小米尺或三角板量取小孔周围溶菌环直径，并作记录，可与标准溶菌酶阳性对照作对比观察。

如需定量测定检品（唾液）中的溶菌酶含量，可将上述各种稀释度的溶菌酶标准溶液，分别加入小孔中，同法测定溶菌环直径，用半对数纸制成标准曲线，检品中的溶菌酶含量可从标准曲线上查出。

[附录]

? 溶壁微球菌琼脂平板的制作：①溶壁微球菌在使用前于琼脂斜面上传代一次，然后接种于普通琼脂平板 ,37C°培养24小时，用1/15mol.L -1 PBS或无菌蒸馏水洗下菌苔，洗涤两次，2000r/min，离心30min，弃上清，称量沉淀物湿重, 用无菌蒸馏水配成100mg/ml的菌液。②称取优质琼脂粉1g加入1/15mol.L -1 PBS 100ml,制成1%琼脂。③取上述菌液1ml, 加入加热融化并放至50-60 C°的琼脂中，摇匀倾注平板。冷凝后即为溶壁微球菌琼脂平板。

? 1/15mol.L -1 PBS的制备：①1/15mol.L -1 KH2PO4: KH2PO4 9.07g加蒸馏水至1000 ml；②1/15mol.L -1 Na2HPO4: 1/15mol.L -1 Na2HPO411.87g加蒸馏水至1000 ml；③1/15mol.L -1 PBS(pH6.4)：取1/15mol.L -1 KH2PO4 73ml加1/15mol.L -1 Na2HPO427ml,加NaCL0.5g即为pH6.4的1/15mol.L -1 PBS。

（谢 明）

实验四 血清总补体活性测定（CH50单位测定）

[实验原理]

补体能使抗体致民敏的羊红细胞发生溶血反应,根据溶血程度可测定补体总活性。以溶血百分率作纵坐标,相应的血清补体量为横坐标绘图,可知在50%溶血附近补体的量与溶血的程度呈直线关系。因此以50%溶血作为终点较以100%溶血作为终点更为敏感。故称为50%溶血试验,即CH50（50%complement hemolysis）。产生50%溶血所需补体的量为一个CH50单位。

[实验材料]

待测患者血清

5%绵羊红细胞悬液

3μ/0.1ml溶血素

PH7.2巴比妥缓冲液或生理盐水

370C水浴箱、小试管、吸管等

[实验方法]

取小试管8支,依次编号；

1-6管加入巴比妥缓冲液0.2ml；

于第1管加入待测血清0.2ml,混匀后吸出0.2ml加入第2管 …… 依次对倍稀释至第6管,从第6管吸取0.2ml弃去,此时各管血清稀释度依次为1/2、1/4 、 1/8……1/64 ；

1-6 管加入巴比妥缓冲液 0.2ml,第7管加0.4ml,第8管加0.5ml ，

1-7加溶血素0.1ml ；

每管各加绵羊红细胞 0.1ml,轻轻摇匀,置370 C水浴箱30分钟,40C 冰箱过夜。

血清总补体活性测定操作表 单位： ml

6为实验测定管；第7管为溶血素对照管；第8管为绵羊红细胞对照管

50% 标准溶血管的配置：

取5%绵羊红细胞1ml,离心后弃上清,加入蒸馏水0.5ml,使红细胞全部溶解,再加双倍（1.7%）生理盐水0.5ml,混匀后加5%绵羊红细胞1ml。混匀取此液 0.1ml加巴比妥缓冲液0.5ml即为50%标准溶血管。

[实验结果]

以50%溶血管为标准,肉眼依次观察,与标准管最接近者为终点管。按下式计算1ml血清的补体单位。

血清中补体活性单位（CH 50 单位） = 1/血清总量×终点管稀释倍数

本法测得血清总补体活性的正常值为80-160CH50μ/ml

[注意事项]

待测血清要求新鲜，一般要求在去血后 2小时做完实验。

试管口径大小一致，清洁透明，便于观察。

50%标准溶血管配置必须用同批实验用绵羊红细胞，并同时方入冰箱。

思考题：

何谓一个 CH50单位？何谓溶血素？

如何计算每 ml血清所含的CH50单位数？

（刘如意）

第二篇 特异性体液免疫检测

实验五 凝 集 反 应

凝集反应是指细菌、红细胞等颗粒性抗原或表面覆盖抗原的颗粒状物质与相应抗体特异结合，在适量电解质存在的条件下，形成肉眼可见的凝集现象。

一、直接凝集反应

颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）直接与相应特异性抗体结合，在适量电解质存在条件下，出现肉眼可见的凝集现象，称直接凝集反应。参加凝集反应的抗原称为凝集原，而抗体则称为凝集素。直接凝集反应有玻片法和试管法两类。

（一）玻片凝集反应

在玻片上进行的直接凝集反应,主要用于抗原的定性分析,数分钟之内便可观察结果,快速、简便。常用于细菌的分型鉴定,也用于ABO血型的测定。

【 实验材料】

（ 1）抗原：受检菌液或受检者的血细胞盐水悬液。

（ 2）抗体：用于细菌鉴定的1：20稀释诊断血清。

血型检测的A及B诊断血清。

（ 3）生理盐水、玻片、吸管、接种环。

【 实验方法】

（ 1）于洁净玻片的一端加诊断血清1滴，另一端加生理盐水1滴作阴性对照。

（ 2）用接种环取待检菌液或血细胞悬液分别涂于诊断血清和生理盐水，混匀。

（ 3）轻摇玻片，静置数分钟，观察结果。

【 结果分析】

玻片上抗原凝集成肉眼可见的小团块状或絮状凝集物，其周围液体澄清，为阳性反应。阴性反应和生理盐水对照均不发生凝集，为均匀混浊的乳状液。

【 注意事项】

细菌鉴定时，特别是肠道菌种的沙门菌属或志贺菌属，原则上先用多价诊断血清检测，如为阳性，再用单价诊断血清进行分群或定型。血型测定时，室温需保持在 20oC左右，若低于10oC，易出现冷凝集现象而造成假阳性的错误诊断。

（二）试管凝集反应

是用定量的颗粒性抗原悬液与一系列倍比稀释的待检血清在试管中进行的凝集反应，根据试验结果判定待检血清中有无相应抗体及其效价，对血清中抗体进行半定量分析。此法目前仍常用于某些病原微生物感染的免疫学诊断，例如，诊断伤寒和副伤寒的肥达氏（ Widal test）反应，诊断斑疹伤寒的外—裴氏反应（weil-felix test）。

【 实验材料】

诊断菌液, 1:10稀释的待检血清，生理盐水，小试管，刻度吸管，试管架，恒温水浴箱。

【 实验方法】

（1）稀释待检血清取8支试管排列于试管架上,依次编号,每管加入0.5ml生理盐水。于第1管中加入0.5ml待检血清,充分混匀后,吸出0.5ml加入第2管,同法混匀后又吸出0.5ml加入第3管,依次类推,连续稀释至第7管,最后从第7管中吸出0.5ml弃去。第8管为生理盐水对照管。

（2）于各管中加入诊断菌液0.5ml,振摇试管架，充分混匀。

试管凝集反应操作程序

(3)将试管静置于37oC恒温水浴箱中40min。

【 结果分析】

（ 1）首先观察阴性对照管，应无凝集现象，管底沉积呈圆形，边缘整齐，轻轻摇动则沉积菌分散均匀呈混浊现象。

? 观察实验管，凝集现象可根据强弱程度，分为五级：

++++ 细菌全部凝集，管底形成大片凝集物。

+++ 细菌大部分凝集，管底的片状凝集物较小而薄。

++ 约半数的细菌发生凝集，管底出现凝集环。

+ 仅有少部分细菌凝集，管底可见沉积的细菌周边有稀疏、点状的凝集物。

— 液体混浊，无凝集。

（ 3）血清抗体效价的判定：以出现明显凝集现象（++）的血清最高稀释度作为受检血清的抗体效价。

【 注意事项】

实验中应注意反应体系的温度、电解质浓度及酸碱度（ pH值）。

二、间接凝集反应

将可溶性抗原（或抗体）先吸附在一种与免疫无关，一定大小的载体颗粒表面成为致敏载体颗粒，然后与相应抗体（或抗原）结合，在适量电解质存在的条件下，出现肉眼可见的特异性凝集现象，称间接凝集反应，此法敏感度比直接凝集反应高，因而广泛地应用于临床检测中，间接凝集反应中常用的载体颗粒有人 “ O”型红细胞、动物红细胞、活性炭或硅酸铝颗粒，聚苯乙烯乳胶微球等。

（一）正向间接血凝试验

将绵羊红细胞或人的“ O”型红细胞用醛类固定（称为醛化，可改变血球表面性质，使其易于吸附蛋白质类抗原，并可长期保存使用），再将可溶性抗原吸附于醛化的血细胞上，制成抗原致敏的红细胞，当与相应的抗体结合，使红细胞被动的聚合在一起，出现肉眼可见的凝集现象，常用于检测传染病抗体或自身抗体。

【 实验材料】

（ 1）抗原制备：将伤寒杆菌接种在培养基上，37oC培养24小时，用生理盐水洗下，100oC水浴2小时，离心弃上清，稀释后备用。

（ 2）致敏红细胞的制备：取稀释的抗原与等体积的已醛化的2%SRBC混合，37oC水浴2小时，每隔15分钟振摇一次，取出后洗涤弃上清，稀释成0.5%备用。

（ 3）试管、试管架、刻度吸管、恒温水浴箱。

【 实验方法】

（ 1）取8支小试管排列于试管架上，依次编号。每管加入0.25ml生理盐水。于第1管内加入1:10稀释的免疫血清0.25ml混匀，倍比稀释至第7管。第8管为阴性对照。

（ 2）每管中加入0.25ml致敏绵羊红细胞，振摇试管架，使之充分混匀。

（ 3）将试管架静置于37oC恒温水浴箱中1小时。

正向间接血凝试验操作程序

【 结果分析】

（ 1）首先观察阴性对照管，应无凝集现象，管底红细胞沉积呈圆形，边缘整齐，轻轻摇动则沉积菌分散均匀呈混浊现象。

（ 2）观察实验管，凝集现象可根据强弱程度，分为五级：

++++ 细菌全部凝集，管底形成大片凝集物。

+++ 细菌大部分凝集，管底的片状凝集物较小而薄。

++ 约半数的细菌发生凝集，管底出现凝集环。

+ 仅有少部分细菌凝集，管底可见沉积的细菌周边有稀疏、点状的凝集物。

— 液体混浊，无凝集。

（ 3）血清抗体效价的判定：以出现明显凝集现象（++）的血清最高稀释度作为受检血清的抗体效价。

【 注意事项】

? 红细胞需来自同一个体、批号相同，且致敏血球应新鲜配置。

? 使用器材必须清洁，否则对结果有很大影响。

（二）反向间接血凝试验

将特异性抗体吸附于醛化的红细胞上，再与相应抗原结合，在适量电解质存在条件下，红细胞被动聚集出现肉眼可见凝集现象。用于检测标本中的相应可溶性抗原。

【 实验材料】

（ 1）1:20抗—HBs致敏的醛化血球、纯化的1:20抗—HBs、待检血清、稀释液。

（ 2）“V”型微量血凝板，0.025ml稀释棒、微量搅拌器、刻度吸管、滴管（40滴/ml）。

【 实验方法】

（ 1）配制致敏血球悬液 于每瓶冻干诊断血球加4ml稀释液，轻轻旋摇使成均匀血球悬液，浓度约为0.6%。

（ 2）正式试验

① 在“V”型微量血凝板上，每份待检血清设立8孔，于各孔内用40滴/ml滴管各加1滴稀释液（相当于0.025ml）。

② 用0.025ml容量的稀释棒蘸满待检查血清分别依次在各孔内捻转作倍比稀释（一般每孔内均需捻转10次左右），直至第7孔，第8孔为致敏血球对照。另设第9孔为阳性对照，加0.025mlHBsAg阳性血清。

③ 于每孔中加0.025ml混匀的致敏血球悬液。

④ 将血凝板置于微型振荡器上振荡1~2分钟，置37oC1小时后观察结果。

反向间接血凝试验操作程序

【 结果分析】

不凝集：红细胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圆点。

明显凝集（++）：红细胞于孔底形成薄膜状凝集，中央可见疏松的红点。

出现明显凝集的血清最高稀释度为 HBsAg效价，凡效价≥1:16者需进一步做中和试验。

中和试验

在血凝板上每份标本设测定排与对照排，每排 8孔。于每孔加稀释液0.025ml，用2支稀释棒蘸取被检血清，分别在2排作倍比稀释到第7孔，第8孔不含血清，为血球对照，然后，于测定排各孔加稀释液0.025ml，对照排各孔加1:20抗HBsAg0.025ml，血凝板振荡1~2分钟，置37oC30分钟。取出，于各孔加0.025ml致敏血球，振摇混匀，置37oC1小时后观察结果。

凡正式试验效价≥ 1:16，且中和试验的对照排凝集孔数至少低于测定排凝集孔数2孔者，为HBsAg阳性，否则系非特异性凝集。

【 注意事项】

（ 1）配制的致敏血球悬液一般当天用完，若置2~10oC，使用期不超过3天。

（ 2）试验用的血凝板、滴管、稀释棒等器材必须十分清洁，否则易造成非特异性凝集。

? 血凝板、稀释棒用后均需用次氯酸钠（ 10%v/v）浸泡过夜；滴管需煮沸10分钟，然后用水冲净，再用蒸馏水冲洗，晾干备用。

思考题：

? 试述直接凝集反应和间接凝集反应的异同点。

? 正向间接血凝试验与反向间接血凝试验在原理上有何相同和不同？正向间接血凝试验可否应用微量血凝板测定法？

（雷艳君）

实验六 沉淀反应

可溶性抗原（如血清中的蛋白,组织浸出液,细胞裂解液等）与其相应的抗体在溶液中或凝胶中结合,若比例合适,可形成肉眼可见的抗原-抗体复合物,这就是免疫沉淀反应。免疫沉淀反应可以在小玻璃管中或毛细玻璃管及凝胶平板中进行。在用凝胶平板做实验时,常用琼脂糖凝胶做介质,有的加电流,使反应更快更灵敏。

一、环状沉淀

【 实验原理】

在环状沉淀试管中，当可溶性抗原与相应特异性抗体结合后，于两者交界面处可形成白色沉淀环。此法系Ascoli于1902年建立，用于检查兽类内脏、皮毛浸液等标本中炭疽杆菌抗原，由于其较高的灵敏性和特异性，目前仍用于法医学血迹鉴定、流行病学媒介昆虫的吸血习性鉴定等。

【 实验材料】

待测血迹干燥纸片

抗人血清抗体、抗羊血清抗体和抗鸡血清抗体

生理盐水

环状沉淀管及管架、吸管等。

【 实验方法】

1、取环状沉淀管3支，分别加入抗人、抗羊和抗鸡血清抗体各0.1ml 于管底部，并注明，置于管架上。

2、另取3支试管，分别将3种血迹纸片加入，再各加生理盐水1ml，室温5-10分钟后将溶液摇匀。

3、吸取上清液分别加入上述含有抗人、抗羊、抗鸡血清抗体的环状沉淀管内，并使两者形成一清晰交界面。置室温下1-5分钟观察结果。

【 结果分析】

根据是否与已知抗血清出现白色沉淀环，判定血迹类型。

【 注意事项】

1、因血清分子密度及比重均大于生理盐水，故当加入含有抗原的生理盐水时只需将沉淀管倾斜，加抗原的吸管勿接触抗血清，使含抗原的生理盐水沿管壁缓缓流下，再将沉淀管直立即可呈一清晰交界面。

2、在加抗原时，吸管的头部切勿触及抗血清，否则不仅使抗原抗体混合，不能呈清晰交界面，而且如再用此吸管加抗原于另一支含不同抗血清的沉淀管后，必然会出现交叉反应，无法判定结果。

二 单向扩散

【 实验原理】

抗原或抗体这两种成分中只有一种扩散，将已知抗体与琼脂混合，将抗原

置于凝胶孔中，抗原则呈辐射状扩散，在孔的周围与抗体结合，在比例合适的地方形成肉眼可见的沉淀环。当抗体的浓度一定时，抗原的浓度与形成沉淀环的直径成正比。

【 实验材料】

1% 琼脂糖（琼脂糖1g,0.1mol/L pH 8.6 巴比妥-巴比妥钠缓冲液100ml），玻片或培养皿，凝胶打孔器（直径3mm），水浴箱， 10ml 吸管， 5μl微量加样器，已知抗体，标准抗原，待测抗原。

【 实验方法】

1 ） 取一张玻璃片，用水冲洗干净，再用少量 75% 乙醇冲洗，晾干后置于水

平台备用。

2 ）将 1% 琼脂糖融化， 56 ℃水浴中保温

3 ） 取 15ml 琼脂糖加到 56 ℃预热的玻璃管中，加入适量的抗体（约 200ml ）充分混匀后平铺于玻璃片上。

4 ） 待凝胶凝固后打孔（直径3mm）

5 ） 将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔中，每孔 5 μ l

6 ） 将凝胶板置于湿盒，室温过夜（24h 以上）后观察结果。、

7 ）绘制标准曲线，测出样品中相应抗原含量。

[ 结果分析 ]

1 本实验主要用于检查血型中 IgG ， IgA ， IgM 以及补体成分 C3 ， C4 等的含量 / 由于各类免疫球蛋白的分子量大小不等，因此同样浓度的 IgG ， IgA ， IgM 在琼脂糖中的扩散速度各异， IgG 扩散最快，形成的沉淀环直径最大， IgM 的分子量最大，扩散速度慢，形成的沉淀环较小。

2 形成的沉淀环大小与抗原或抗体的浓度相关，因此临床检测时应先调整抗体和抗原各自的最适浓度，抗体的最适浓度应使免疫扩散后的沉淀环边缘清晰，且能测出血清中的免疫球蛋白的正常值和最大限度的异常值。抗体浓度过高，形成的沉淀环直径小；浓度过低，不易检测抗原的最高限浓度。沉淀环的大小与所检测的抗原浓度成正比。抗原浓度过低时，沉淀环太小不易测定，过高时，沉淀环太大，浪费抗体。

单向扩散示意图

三 双向扩散

【 实验原理】

双向免疫扩散是指抗原和抗体在同一凝胶内部扩散，彼此相遇后形成特

异性的沉淀线。该反应是将抗原和抗体加入同一凝胶中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散。当抗原和抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧型沉淀线。

【 实验材料】

1% 琼脂糖，玻片或培养皿，凝胶打孔器（直径 3mm ），水浴箱， 10ml

吸管， 5 μ l 微量加样器，抗原，抗体。

【 实验方法】

1 ）取一张玻璃片，用水冲洗干净，再用少量 75% 乙醇冲洗，晾干后置于水平台备用。

2 ）将 1% 琼脂糖融化， 56 ℃水浴中保温。

3 ）将 1% 凝胶约 3ml 铺于玻片上，待凝固后打孔，直径 3mm ，间距 10mm 。（如图所示）

4 ）中心孔加 5 μ l 抗体，周围孔内每孔加 5 μ l 抗原样品（抗原抗体均需预先做系列稀释以获得适宜的抗原抗体比例）。

5 ）将凝胶板置于湿盒，室温过夜（ 24h 以上）后观察结果。

【 结果分析】

1 ）阳性结果为在抗原孔与抗体孔之间出现沉淀线。若出现几条沉淀线表明抗原与抗体均不是单一组分。

2 ）此法可用来比较两个抗原的相关性。当两种抗原的决定簇完全相同时，则与抗体形成的沉淀线相吻合；若两抗原的决定簇完全不同时，则与抗体形成的沉淀线呈不相关的交叉线；若两种抗原有部分决定簇相同时，则与抗体形成呈部分交叉的沉淀线。

双向扩散示意图

四 火箭电泳

将抗原抗体反应置于一定的电场中进行，能使抗原抗体反应更加快速，灵敏。根据方法的不同，主要有火箭电泳，对流免疫电泳，交叉免疫电泳等。

【 实验原理】

火箭电泳是把单向扩散技术与电泳技术结合起来。抗原在含有抗体的琼

脂糖凝胶中电泳时，在电场的作用下，抗原向一个方向移动并逐步与凝胶中的相应抗体结合形成沉淀峰。沉淀峰的高度与抗原的浓度成正比。

【 实验材料】

1% 琼脂糖，玻片或培养皿，凝胶打孔器（直径 3mm ），水浴箱， 10ml

吸管， 5 μ l 微量加样器，已知抗体，标准抗原，待测抗原，电泳仪。

【 实验方法】

1 ）取一张玻璃片，用水冲洗干净，再用少量 75% 乙醇冲洗，晾干后置于水

平台备用。

2 ）将 1% 琼脂糖融化， 56 ℃水浴中保温

3 ）取 15ml 琼脂糖加到 56 ℃预热的玻璃管中，加入适量的抗体（约 200ml ）

充分混匀后平铺于玻璃片上。

4 ）待凝胶凝固后打孔（直径 3mm ）

5 ）将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔中，每孔 5 μ l

6 ）在 35v/cm 电场中电泳 30min 。

7 ）根据标准稀释抗原的峰高绘制标准曲线，计算待检样品的抗原含量。

【 结果分析】

1 ）本实验主要用于抗原的测定（只能测定μ g/ml 以上的含量）。计算方法同单向扩散，均需先根据系列稀释的标准抗原的峰高作出标准曲线，然后在标准曲线上找出待检抗原对应的浓度。

2 ）可用于检测血清免疫球蛋白或分泌型 IgA 及补体 C3 等的含量。

3 ）一般来说，抗原应放在负极的一侧，因为多数蛋白性抗原在碱性电泳缓冲液中带负电，在电场中向阳极运动。

五 对流免疫电泳

【 实验原理】

当抗原和抗体在琼脂介质中电泳时 ，抗体的 PI 比较高，在适当的 pH 值下，抗体带正电荷而抗原带负电荷，故在电场中抗体向阴极方向移动而抗原向阳极运动，直至相遇后形成沉淀线，其原理与双向免疫扩散相同，但具有方法简便，快速及一次电泳可以检测多个样品等特点。

【 实验材料】

1% 琼脂糖，玻片或培养皿，凝胶打孔器（直径 3mm）,水浴箱， 5μl 微量加样器，抗体，抗原，电泳仪，阳性对照血清，滤纸

【 实验方法】

1 ）取一张玻璃片，用水冲洗干净后，再用少量 75% 乙醇冲洗，晾干后置于水平台备用。

2 ） 1% 琼脂糖融化， 56 ℃水浴中保温

3 ）吸取琼脂糖铺于玻璃板上，厚约 1.5mm ），制成所需胶板。

4 ）等待琼脂糖凝固后，用打孔器成对打孔，孔径 3mm ，孔间距 3mm 。排距 3mm 。

5 ）在孔中分别加入抗原和抗体，每孔 5 μ l

6 ）在电场中电泳 30 分钟（ 5v/cm ）

7 ）观察结果。在两孔间出现沉淀线的为阳性。

【 结果分析】

本实验是定性实验，用于多种疾病的检测，如 HbsAg ， AFP 等的检测，血吸虫，包虫病等抗体的测定。

 

五 免疫电泳

[ 原理 ]在凝胶介质中将区带电泳法与免疫双扩散相结合的一种免疫化学方法。先使血清在琼脂糖凝胶中电泳，在一定的电场强度下，由于血清中各种蛋白质的分子大小及电荷状态和电荷量不同，泳动速率也各不相同，使各自组分得到分离，然后在电泳轴的平行方向挖一长槽，加入抗血清，抗原与相应抗体扩散，相遇，出现沉淀弧线。

[ 材料 ]1% 琼脂糖，玻片或培养皿，凝胶打孔器（直径 3mm ），水浴箱， 5 μ l 微量加样器，抗体，抗原，电泳仪，阳性对照血清，滤纸

[ 方法 ]

1 ）将玻璃板洗干净，用 75% 乙醇冲洗，晾干备用

2 ）将 1% 琼脂糖融化， 56 ℃水浴中保温备用

3 ）铺板，打孔。

4 ）将凝胶孔加满抗原，其中一孔加电泳指示剂。

5 ）将凝胶板放在电泳槽中进行电泳 10v/cm ，根据指示剂判定电泳时间。

6 ）电泳后在凝胶板上沿电泳方向平行挖 2mm 左右宽的长槽，其中加入抗血清或特异性抗体。

7 ）将凝胶板转入湿盒中，室温放置 12 或 18 小时，可观察到在一定位置出现的沉淀弧线。

[ 结果与分析 ]

? 临床上常用于 M 蛋白血症，确认该异常蛋白属于哪一亚类免疫球蛋白，或哪一型轻链。

? 鉴定蛋白质抗体，为单价抗体或多价抗体，如检测多克隆丙种球蛋白血症中同时存在的高含量 IgG ， IgA 和 IgM 。

? 鉴定未知蛋白抗原（或抗体）。

免疫电泳示意图

思考题

1 免疫沉淀实验中哪些可以用来检测抗原，哪些用来检测抗体？哪些是定性的，哪些可以定量。

2 免疫沉淀反应与凝集反应在应用方面有什么区别？

实验七 补体结合反应

[ 原理 ]抗原与抗体结合形成的复合物能激活补体，若抗原是绵羊红细胞，那么补体被激活后，使绵羊红细胞溶解，出现溶血现象。补体结合实验是一种有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。参与本反应的五种成分可分为两个系统，一为待检系统，即为已知抗原（或抗体）和待检抗体（或抗原）另一个为指示系统，即绵羊红细胞和其相应的溶血素。待检抗原，抗体和先加入的补体作用后，再加入指示系统。若待检系统中的抗原 - 抗体相对应，两者特异性结合后激活补体，再加入的指示系统无补体结合，不出现溶血，是为补体结合实验阳性；若待检系统中的抗原与抗体不对应或缺少一方，补体不被激活，当指示系统加入后，绵羊红细胞 - 溶血素复合物激活补体，产生溶血现象，是为补体结合实验阴性。

本实验敏感性，特异性均较高，可用于检测某些病毒病，立克次体病，梅毒病等。由于参与反应的各成分之间要求有适当的量的关系，因此，做本实验之前必须通过一系列预备实验来确定补体，溶血素，抗原或抗体的使用量。

[ 方法 ]

一）溶血素单位滴定

1 材料：溶血素血清，抗原， 2% 绵羊红细胞悬液，补体（1:30 取豚鼠新鲜血清），生理盐水，小试管，吸管,37 ℃水浴箱。

2 实验过程

1 ）按表分别加入各种不同稀释的溶血素 0.2ml 及其他成分。

2 ）充分混匀后置于 37 ℃水浴箱中 30 分钟，然后观察结果。

3 ）能呈现完全溶血的最高稀释度的溶血素为 1 个单位

4 ）配制 2 个单位的溶血素溶液。

例如下表的结果表明，第11管（1:9600 倍稀释）中0.2ml溶血素为1个单位。实验室常用0.2ml中含2个溶血单位的稀释液，即1:4800,配制时可以取 1:100 倍稀释的溶血素1ml 加生理盐水47ml 。

例：溶血素的滴定表 :

二）补体单位滴定

1 材料

1）补体 1:30 稀释。

2）抗体2单位溶血素

3）抗原2%绵羊红细胞

4）生理盐水,小试管，吸管,37℃水浴箱

2方法

1）依下表加入1:30 稀释的补体。

2）依次加入其他各成分至每管中,37℃水浴后观察结果

3）补体单位的确定 凡能使一定量红细胞发生完全溶解的最小补体量，称为1个确定单位。如下表中自第3管可出现完全溶血现象，因此第3管 0.1ml）所含补体为1个确定单位。

由于在实际应用时补体有一部分损失，故需酌量增加一些，通常取其次高的一管补体量称为1个使用单位。在下例中：

1 个确定单位 =0.1ml 1:30 稀释的补体。

1 个使用单位 =0.12ml1:30 稀释的补体。

4 ）补体的稀释 若使每 0.2ml 补体含 2 个使用单位，可照下式计算： 30 :（2 × 0.12 ） = x : 0.2

X=  =25

即将补体稀释25倍，取0.2ml即可。

三）正式实验

正式实验可以做定量的，也可以做定性的。本实验用伤寒杆菌的提取液为抗原，与其免疫血清做定性实验。

1 材料

1）补体 1:25 稀释

2）抗体 1:5 稀释的伤寒血清

3）抗原 1:50 稀释的伤寒抗原,1:50 稀释的痢疾抗原

4）指示系统2单位溶血素,2% 绵羊红细胞。

5 ）其他 同预备实验

2 方法

按下表顺序操作:

3结果

观察各管溶血情况，记录并分析其意义。

4注意事项

1 ）以细菌做抗原时，应使用细菌的提取液而不是悬液，通过滴定找出最合适的稀释度

2 ）所用试管，微量板，吸管等器材必须清洁无脂，各试剂无菌，以防止抗补体现象。

3 ）除了免疫球蛋白外，本实验中的其他成分均需要滴定。

思考题

1 本实验中设立的对照有什么意义，如果去掉是否可以？

实验八 中和实验（ Neutrlization test ）

中和实验是一种特异性和敏感性均很高的血清学实验。在体外，病毒可以被相应的特异性抗体中和而失去其感染性，通过单层细胞培养检验病毒的感染性是否失去的方法称为中和实验。

中和实验是以测定病毒的感染性为基础，所以该实验必须在动物，鸡胚或组织培养细胞等活性体内进行，必须选用对病毒敏感的细胞，动物或鸡胚为材料，根据实验的不同目的设置严格的对照实验。

中和实验的主要应用是：

1 鉴定病毒：中和实验具有很高的特异性，利用已知型别的免疫血清与未知病毒做中和实验，如被中和，不但可以定量，而且可以定性。

2 可以用于分析病毒的抗原性。

3 测定免疫血清的效价和疫苗免疫后的抗体反应。

4 测定血清中的抗体滴度，用于诊断病毒性疾病。

[原理]特异性的抗病毒免疫血清——中和抗体与病毒作用，能够抑制病毒对敏感细胞的吸附、穿入和脱壳，从而抑制了病毒的增殖，使 病毒失去感染性，中和实验常用有两种方法：一种是用已知病毒检测被测血清中的抗体效价，另一种是用已知免疫血清鉴定病毒型别。

一 ）中和实验方法一——用已知病毒检测被检血清中的抗体效价

1 材料

1 ）病毒悬液：选用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒液各 1.5ml 。使用前用 Eagle 维持液稀释至 100TCID50/0.1ml 含量（ TCID50 即能使 50% 组织培养管发生细胞病变的病毒量）

2 ）待检血清；用前 56 ℃ 30 分钟灭活，以除去非特异性抑制物

3 ）敏感细胞：需长成单层，一般需 2-4 天，根据细胞种类和繁殖程度确定，本实验选用 Hela 细胞培养管 40 只。

4 ）灭菌 Eagle 维持液、灭菌小试管 15 只、灭菌 1ml 吸管， 37 ℃水浴箱， 37 ℃ 5%CO 2 培养箱和显微镜。

2 方法

a 实验组实验方法（ 1-5 号管）

1) 稀释血清：取 15 支灭菌试管，分成三排，每排 5 只分别编号。将待检血清用 Eagle 维持液从 1 ： 5 按四倍递增稀释到 1:1280, 稀释后的血清每管 0.25Ml.

2) 在第一排各试管内，每管加入Ⅰ型病毒液 0.25ml ，第二排各试管内，每管加入Ⅱ型病毒液 0.25ml ，第三排各试管内，每管加入Ⅲ型病毒液 0.25ml ，加完后摇动试管架充分混匀，置 37 ℃水浴箱 1 小时取出。

3) 取 30 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，在每支培养管中加入上述病毒与血液混合液 .0.2ml ，每份混合液接种 2 支细胞培养管。接种后，培养管置于 37 ℃水浴 1 小时取出，于每支培养管内加入 0.8mlEagle 维持液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。

b 实验对照组实验方法

1 ）病毒对照组（6号管）

取 6 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支试管中加病毒液 0.1ml ，每型病毒液各接种 2 只培养管。然后送 37 ℃水浴保温 1 小时取出，于每支培养管中加入 0.9mlEagle 维持液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱 培养。

2 ）血清对照组（ 7 号管）

取 2 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支试管中加 1:20 稀释的待检血清 0.1ml ，然后送 37 ℃水浴保温 1 小时取出，于每支培养管中加入 0.9mlEagle 维持液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。

3 ）细胞对照管（ 8 号管）

取 2 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。

3 结果

在培养第 3 ， 5 ， 7 天各观察一次，观察时将细胞培养管从温箱取出，显微镜低倍视野下观察有无 CPE （细胞病变效应），并按表记录。当细胞出现 CPE 时，可见磁暴生长减缓或停止生长，细胞变大，肿胀，甚至死亡，脱落。观察后，出现 CPE 的培养管可弃去，未出现 CPE 的培养管继续送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养至第 7 天。

中和实验 CPE 结果记录:

结果判定

1 病毒对照组均应出现 CPE 为“＋”

2 血清对照组和细胞对照组不应出现 CPE ，为“－”。

二） 中和方法实验二——用已知免疫血清鉴定病毒型别

1 材料

1 ） 病毒悬液：选用未知型别的脊髓灰质炎病毒 1 ： 10 稀释液 1ml 。

2 ）免疫血清：选用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒免疫血清（ 1 ： 5 稀释）各 0.35ml 。

3 ）敏感细胞：选用 Hela 细胞培养管 15 支。

4 ）其余材料同方法一。

2 方法

a 实验组实验方法

1 ） 取待鉴定病毒稀释液 0.75ml 分别与三型特异性免疫血清（各 0.25ml ）等量混合，在 37 ℃ 水浴 1 小时取出。

2 ）取 6 支 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支培养管中加入混合液 0.2ml ，每份混合液接种 2 支细胞培养管。接种后，培养管置 37 ℃水浴箱中水浴 1 小时取出，于每支培养管内加入 Eagle 维持液 0.8ml ，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。

b 实验对照组实验方法

1 ）病毒对照组

取 2 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支试管中待检病毒悬液 0.1ml ，送 37 ℃水浴保温 1 小时取出，于每支培养管中加入 0.9mlEagle 维持液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。

2 ）血清对照组

取 6 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支试管中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型免疫血清各 0.1ml ，然后送 37 ℃水浴保温 1 小时取出，于每支培养管中加入 0.9mlEagle 维持液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱 培养。

3 结果 :

4 结果判定

1 ）方法同方法一

2 ）鉴定病毒。待鉴定的病毒与哪一型免疫血清的中和试验结果为阳性，即为该型病毒。

注意事项

1 必须选用对细胞有较稳定致病力的病毒。

2 灭活的血清必冷却后应用。

3 本试验必须要有阳性对照，阴性对照和细胞对照。

思考题

1 中和实验的理论基础是什么？

2 中和实验是用来检测抗原还是抗体，或均可检测？

实验九 免疫标记技术

免疫荧光技术(immunofluorescence technique)

免疫荧光技术(immunofluorescence technique)是一种以荧光物作为标记物的免疫分析技术，荧光物质分子在特定条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态而极不稳定，其迅速回到基态时，可以电磁辐射形式释放出所有的光能，发射出波长较照射光长的荧光。用荧光素与已知的抗体（或抗原，较少用）结合，但不影响其免疫活性，然后可将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物。

常用的荧光素主要有：

1 ．异硫氰酸荧光素 (FITC) ，最大吸收光谱为 490~495nm ，最大发射光谱为 520~530nm ，呈黄绿色荧光。

2 ．四乙基罗丹明 (RB200) ，最大吸收光谱为 570nm ，最大发射光谱为 595~600nm ，呈明亮橙色荧光。

3 ．四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) ，最大吸收光谱为 550nm ，最大发射光谱为 620nm ，呈橙红色荧光。

一、 FITC 标记抗体技术

在碱性条件下， FITC 的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰氨化而形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。

目前一般实验使用的荧光抗体多为商品化试剂，不需自己合成。

二、荧光抗体染色法

实验原理

荧光抗体染色技术的基本原理是利用抗原抗体特异性结合的特点，用标记有荧光素的荧光抗体检测待检抗原样本，如形成抗原抗体复合物，则其在蓝紫光或紫外光照射下发出荧光，用荧光显微镜进行观察。本实验常用于测定细胞表面抗原和受体，各种病原微生物的快速检查和鉴定，组织内抗原的定性和定位研究以及各种自身抗体的检测等。经典的荧光抗体技术包括直接法、间接法和补体法。

实验材料

1 ．抗原 呼吸道合胞病毒 (RSV) （或待检标本）

2 ．细胞 Hep-2 （或 Hela ）细胞单层

3 ．荧光抗体 1:40 抗 RSA IgG-FITC 标记物； 1:40 抗兔 IgG-FITC 标记物

4 ．中间抗血清 1:200 兔抗 RSV 免疫血清 (Abt)

实验方法

1.制备抗原片

⑴ RSV 感染细胞：用 RSV 感染 Hep-2 或 Hela 细胞单层培养物，在细胞未出现 CPE 前，用胰酶消化使分散，并配制成 4-6 ′ 10 5 个 /ml 的细胞悬液，用吸管将细胞悬液滴加到 10 点镀膜玻片上，每个圆点上约 0.025ml ，再将镀膜玻片放入二氧化碳孵箱， 37 ° C 培养 6~24 小时。培养后的玻片用 pH7.4 的 PBS 漂洗 3 次，干燥后固定。

⑵ 固定：将玻片放入盛有冷丙酮的洗缸中， 4 ° C 固定 20 分钟，漂洗，自然干燥。

⑶ 抗原片的保存：固定好的抗原片最好立即进行荧光抗体染色，若必须保存时，置于低温下密闭保存备用。

2.荧光抗体染色法

⑴ 直接染色法 直接使荧光抗体与玻片上的抗原反应。

① 用吸管滴加 1:40 抗 RSV IgG-FITC 标记物，使其布满整个标本区。将玻片置湿盒中， 37 ° C 孵育 30 分钟。

② 将玻片取出，用自来水冲去多余的标记抗体液后，用 PBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。最后用蒸馏水冲洗 1 次，晾干。

③ 用纯度高的甘油封片，镜检。

⑵ 间接染色法

① 用吸管吸取 1:200 兔抗 RSV 免疫血清，滴于抗原片上，使其布满整个标本区，约 0.025ml 。将玻片置湿盒 37 ° C 孵育 30~40 分钟， PBS 漂洗 3 次，每次 2 分钟。

② 滴加 1:40 抗兔 IgG-FITC 标记物于抗原片上，约 0.025ml 。将玻片置湿盒 37 ° C 孵育 30~40 分钟， PBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。标本不要太干，各染液勿混流。

③ 0.02% 伊文思蓝覆盖 5 分钟，去染液加甘油封片，镜检。

结果判定

荧光显微镜下所观察到的荧光图象主要以两个指标判断结果，一是形态学特征，一是荧光的亮度，必须将两者结合起来综合判断。

特异性荧光呈黄绿色，其强度用“ ++++ ”、“ +++ ”、“ ++ ”、“ + ”、“—”表示。

思考题

1. 何谓免疫标记技术？常用的免疫标记法有那些？

2. 荧光抗体染色的原理是什么？有那些常见方法？

酶联免疫吸附实验（间接法）

酶联免疫吸附实验 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 是一种用酶标记抗体或抗原，对相应的抗原或抗体进行测定的免疫标记技术。他利用了抗原抗体反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体，具有敏感性高、特异性强、简单、结果便于观察、可用于大规模快速检测等特点。常用方法有直接法、间接法、夹心法和竞争法等。

常用标记酶有：辣根过氧化物酶 (HRP) ，碱性磷酸酶 (AP) ，葡萄糖氧化酶 (GOD) 等。

实验原理

先将用于检测特异性抗体的已知抗原结合到固相载体上，再先后加入待测抗体和酶标二抗进行反应，其间通过洗液的洗涤去除未能固化到固相载体上的成分，这样因为抗原抗体反应的特异性，就保正了只有当检测标本中含可与已知抗原特异性结合的抗体时，标记的酶才能在反应孔中存在而不被洗去，当加入酶的底物后，底物被酶催化产生有色的产物，通过目测或分光光度计检测 OD 值就可测出底物的降解量，从而推知存在于标本中的抗体量。

实验材料

1. 40 孔酶标板

2. 1:300 乙肝表面抗原溶液

3. 1:10 待测血清

4. 健康人血清

5. HBsAg 诊断血清

6. 辣根过氧化物酶标记羊抗人 IgG 抗体（酶标二抗）

7. 抗原稀释液（ pH9.6 碳酸盐缓冲液）

8. 洗涤液（ pH7.4 磷酸盐—吐温缓冲液）

9. 血清稀释液（含 0.1% 牛血清白蛋白的磷酸盐—吐温缓冲液）

10. 底物显色剂（邻苯二胺—— H 2 O 2 溶液）

11. 终止液（ 2M H 2 SO 4 ）

实验方法

1.包被抗原:用抗原稀释液将HBsAg按1:300稀释成工作浓度,加入到40孔酶标板1-9孔,每孔0.1ml。第10孔加稀释液作空白对照。酶标板置湿盒内,4°C孵育过夜。

2 ．洗涤：次日,甩去酶标板中液体,每孔加洗涤液至满,室温放置3分钟后,甩干,再加入洗涤液,重复3遍。目的在于去除未吸附的抗原,最后甩干。

3. 加待测血清：用血清稀释液倍比稀释待测血清，方法如下表：

每管取 0.1ml 分别加入到酶标板相应的 1~7 孔内。第 8 孔加入 0.1ml 健康人血清，作阴性对照。第 9 孔加入 0.1ml HBsAg 诊断血清，作阳性对照。酶标板置湿盒内， 37 ° C 孵育 30 分钟。

4. 洗涤：甩干酶标板中的液体，用洗涤液按照步骤 2 中的方法洗涤 3 遍，最后甩干。

5 ．加酶标二抗：将稀释好的酶标记羊抗人 IgG 抗体按每孔 0.1ml 加入 1~9 孔，第 10 孔仍只加 0.1ml pH7.4 磷酸缓冲液。酶标板置湿盒内， 37 ° C 孵育 30 分钟。

6. 洗涤：同步骤 4 。

7. 加底物显色：将新配制的邻苯二胺—— H 2 O 2 溶液按每孔 0.1ml 加到 1~10 孔中，置湿盒 37 ° C 孵育或室温静置 10~15 分钟。

8. 加终止剂一滴终止显色反应。

结果判定

第 10 孔为空白对照孔，无色，主要用于酶联免疫检测仪的调零。

第 9 孔为阳性对照，显棕黄色。

第 8 孔为阴性对照，无色（有时可因操作不精细或非特异性吸附而呈极浅的黄色）。

实验孔（ 1~7 孔）中结果阳性者，呈棕黄色。随着抗体量的递减，颜色也逐渐变浅。

效价孔的判定，以与阴性对照孔有显著性颜色差异的、血清稀释度最高的实验孔为效价孔，其血清稀释度即为所测抗体的效价。

注意事项：

1. 实验操作中，注意用于不同试剂的吸管、滴管不能混用，以免发生误差而出现假阴性或假阳性结果。

2. 邻苯二胺属有毒化学物质，要避免和皮肤接触。

思考题

1. 酶联免疫吸附实验的基本原理是什么？常用方法有那些？

2. 间接法和直接法相比各有什么优缺点？

放射免疫测定法—— 125 I 标记技术

放射免疫测定 (radioimmunoassay, RIA) 是将同位分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。由于此项技术具有灵敏度高（可检测出 ng 至 pg 级的微量物质）、特异性强（可分辨结构类似的抗原）、重复性好、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等优点，因此在医学及其他生物科学研究领域和临床实验诊断中广泛的应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。

RIA 常用的放射性同位素有 125I、 135I、 3H、14C等，其中以125I最常用。因其具有以下优点 ① 125 I 化学性质活泼，容易标记成功，可以用较简便的方法标记抗原或抗体； ② 125I 衰变过程中不产生b射线，对标记蛋白、多肽等抗原的免疫活性无显著影响； ③ 容易获得高比放性的标记物，测定的灵敏度较高； ④ 释放的g射线可以用晶体闪烁计数仪直接测量，方法简便，易于推广应用； ⑤ 125I的核素丰度、计数率及半衰期（125I60 天,135I 8.1 天）均优与135I 。

标记125I的氯胺T法：（标记甲型肝炎病毒抗体—抗 HAV IgG）

实验原理

氯胺T是氯代酰胺类氧化剂，在水溶液中易分解形成次氯酸，将 125I-氧化成放射性单质碘（125I2），其可取代酉各氨酸残基苯环上的氢原子，或与组氨酸残基的咪唑环共价连接，使蛋白质或多肽发生碘化反应。

实验材料

1. 抗 HAV IgG （约含蛋白 5mg/ml ）

2. Na 125 I ( 比放射性 >20mCi/ml) 1mlCi

3. 0.25M pH7.4 PBS ； 0.05M pH7.4 PBS

4. 氯胺 T 50 m l/100 m l （临用前用 0.25M PBS 配置）

5. 偏重亚硫酸钠 100 m g/100 m l （临用前配置）

6. 1% KI （溶于 0.05M PBS ）

7. Sephadex G25 层析柱（ 1 × 20cm ）：称 10g Sephadex G25 ，用 0.05M pH7.4 PBS 浸泡，漂洗后装柱，然后用溶于同种缓冲液的 1% 牛血清白蛋白（ BSA ） 1ml 上柱封闭，以减少标记蛋白通过时的吸附损耗。

8. 小试管 （用于收集洗脱液的试管应先用 1%BSA 湿润以封闭管壁）

9. 微量进样器

10. 晶体闪烁计数仪

11.15% 三氯醋酸

实验方法

1. 取 1 小试管，加入抗 HAV IgG 2.5 m g ， 0.05M PBS 50 m l ， Na 125 I 800 m Ci （具体体积根据 125 I 衰减表查算）。

2. 再加入氯胺 T 30 m g （快速加入，立即震摇），室温反应 3 分钟。

3. 加入偏重亚硫酸钠 60 m g ，终止反应。

4. 加入 1% KI 200 m l （作为载体，用以稀释放射性碘，减少吸附）。

5. 将上述反应液通过 Sephadex G25 层析柱，待液体进入柱床后，用 0.05M PBS 洗脱，按每管 10 滴 / 分收集，共 45~50 管。

6. 用晶体闪烁计数仪测量各管的放射值，将放射性最强的标记蛋白 3~4 管合并，加 15% 三氯醋酸沉淀蛋白，离心。测定上清和沉淀的 cpm ，求出蛋白沉淀的 cpm 占总 cpm （上清 + 沉淀的 cpm ）的百分率。

7. 计算 125 I 标记蛋白的比放射性：单位重量标记蛋白上的放射性强度称为重量比放射性。计算公式如下：
125 I 蛋白 ( m Ci/mg)= 所用 125 I 总放射性 ( m Ci)× 125 I 标记率 / 所用蛋白总量 ( m g)

注意事项：由于实验中使用了放射性同位素，因此实验过程中所有含 125 I 的液体及试剂均不能随意弃置，需集中处理。另外注意不要让其溅入口、眼。

思考题：

1. 何为放射免疫测定法？其特点是什么？

2. 用 125 I 做为标记物有何优点？

125 I 衰减表

实验十 免疫血清的制备及效价测定

制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。

制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，只要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。

测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定，本次实验将采用溶血实验测定所获得的免疫血清的效价。

一、免疫血清（浆）的制备

我们要制备的是抗绵羊红细胞 (SRBC) 的免疫血清，即溶血素。

实验材料

1. 20% SRBC

2. 小白鼠

3. 无菌 1ml 注射器

4. 抗凝剂 （枸橼酸钠或肝素）

5. 小试管

实验步骤

1. 免疫动物：初次免疫小鼠为腹腔注射20%SRBC0.2ml,4天后以相同剂量、相同途径加强免疫一次。

2. 获得免疫血清（浆）：小鼠初次免疫7天后,摘眼球取血,收入加有抗凝剂的小试管中,2000转/分离心1分钟,上清即为免疫血浆。

二、免疫血清（浆）的效价测定—溶血法

实验原理

该方法的基本原理是根据补体的经典激活途径，即当抗原抗体复合物存在时，补体系统被激活，最后形成的攻复合体可使细胞性抗原溶解。当实验中抗原和补体的量固定不变，且对于抗体相对过量时，则随着抗体量的不同，被溶解的细胞性抗原的量也不同，两者成正比关系，因此根据溶解的抗原的多少就可以判断出抗体的量。

实验材料

1. 待测免疫血清（浆）

2. 20%SRBC

3. 补体

4. 生理盐水

5. 试管

实验方法

1. 将前面获得的小鼠抗 SRBC 免疫血浆首先稀释 10 倍，成为 1:10 免疫血浆。

2. 取3个试管,分别编号为A、B、C,用于对1:10免疫血浆的3倍、4倍和5倍稀释，即A号管内为1:30的免疫血浆;B号管为1:40 的免疫血浆；C号管为1:50的免疫血浆。

3. 取 15 支试管，分为A、B、C三列，每列5只，先给每管中加入生理盐水0.5ml,再从A、B、C号管中分别吸取0.5ml血浆加入相应各列的第一个管中,然后各列再进行倍比稀释,血清稀释度如下表：

注意每列的最后一管应该弃去0.5ml液体。

4. 向每个试管中分别加入SRBC0.25ml和补体0.25ml 。

5. 混均各管中的液体,置37°C水浴30~40分钟。

结果判定

以发生完全溶血的最高血清稀释度管为效价判定管，其血清稀释度即为免疫血清的效价。

注意事项

1. 动物免疫时注意确保SRBC被注射到了腹腔中,要避免注入其他脏器（如肠、膀胱）内。

2. 稀释血清时尽量做到精确，注意用于不同列的吸管不要混用。

思考题

1. 影响免疫血清质量的因素有那些？

2. 各种检测抗体效价的方法相比有什么优缺点？

实验十一 体外抗体形成细胞检查法（溶血空斑实验 PFC）

(Plaque forming cell---PFC检查法)

    PFC测定技术又称溶血空斑试验。是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。自从1963年Jerne和Nordin首先建立PFC测定技术以来,使免疫学方法得到很大的发展。特别是间接溶血空斑测定法的建立，更扩大了本实验的应用范围。它不仅可以测定产生 IgM 类的抗体产生细胞，而且还可以检测产生其他各类免疫蛋白及其亚类的抗体形成细胞。它不仅可以作为免疫基本理论研究的有力工具，而且还可以作为临床筛检抗肿瘤新药以及研究中药对机体免疫功能的影响（免疫增强剂和免疫抑制剂）的特异指标。

    溶血空斑试验分直接溶血空斑试验和间接溶血空斑试验。前者是为测定产生 IgM 型抗体的细胞。因为活化补体的能力强，可以不必另加抗 Ig 试剂（显斑剂），也就是只加细胞和补体即可出现空斑，故称直接溶血空斑测定。至于产生其他类型抗体的（如 IgG 或 IgA 等）细胞检测，就需要在试验系统中另加显斑剂（因为这些类别的抗体活化补体的能力弱）也就是加靶细胞和抗各类 Ig 高纯度的抗血清（系指用高浓度的抗原制备的抗血清）再加补体才能出现可见的空斑，故称间接溶血空斑测定。

    小鼠脾PFC测定方法，经多次改进使本法的敏感度不断提高。目前所用的方法分为：琼脂固相法和小室液相法。

    其基本原理是将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可见的溶血空斑。

一 琼脂固相法

[实验材料]

（1）玻璃器皿（7X1.5 厘米）

（2）1毫升注射器和青霉素小瓶

（3）水浴(47-49℃ )

（4）Hanks'液

（5）胎牛血清 (56℃30分钟灭活,并经羊红细胞吸收)

（6）琼脂或琼脂糖(表层基0.7%;底层基1.4%;用Hanks'液配制 )

（7）右旋糖酐(DEAE-dxtran分子量50万,用蒸馏水配置10毫克/毫升).

（8）抗-Ig血清(测定间接空斑用)

（9）20%绵羊红细胞悬液(Hanks'液配制)

（10）补体:新鲜豚鼠血清(用前经绵羊红细胞吸收)

[试验方法]

（1）将溶化的底层琼脂倾注平皿形成一薄层, 将其凝固,备用。

（2）将每管含2毫升表层基的试管加热溶化后,放47-49℃水浴内保温。

（3）免疫小鼠脾细胞悬液的制备：将免疫小鼠（腹腔或静脉注射绵羊红细胞 4x10 8 个。测定直接溶血空斑，用免疫后 4 天的鼠。测间接空斑，用免疫后 10 天的小鼠。）拉脱颈椎致死。取出脾脏，用 200 目钢网研磨过滤，细胞计数并检查活细胞的百分率。

（4）实验平皿的制备：将底层平皿和所有试剂预温 40 ℃ 左右。于水浴内保温的表层基中加入以下试剂：

胎牛血清0.1毫升

DEAE-右旋糖酐0.1毫升

适当稀释的抗-Ig血清0.1毫升

20%羊红细胞0.1毫升

脾细胞悬液0.1毫升

充分混匀,倾注于铺有底层之平皿内,在水平台上令表层基铺平,凝固后,37℃1小时,然后每个平皿加1:10稀释的补体1.5-2.0毫升,使均匀覆盖其表面,再次温育30分钟,即可进行空斑计数。

[注意事项]

（1）补体浓度以1:10为宜。

（2）所有器皿和各种试剂在加入表层基前均需预温。

二 小室液相法

[实验材料]

（1）玻璃小室的制备：取两张玻片，其中一张玻片两端及中间各铺一条双面胶带，将另一张重叠于其上压紧，即成窄缝状的Canninham小室c

（2）10% 羊红细胞悬液。

（3）1:2 稀释的补体。

（4）1:2 胎牛血清(56C30分钟灭活,并经羊红细胞吸收) 。

（5）填充液（0.6%SRBC 用 Hanks' 液配制）。

（6）石蜡-凡士林混合物。

（7）抗-Ig血清（测间接空斑）。

[实验方法]

（1）制备脾细胞悬液（同前）,稀释成5X106 细胞/毫升。

（2）填充小室：于含1毫升Hanks'液的试管内加入以下试剂。

1:2胎牛血清0.2毫升。

10%羊红细胞悬液0.1毫升。

脾细胞悬液0.1毫升。

1:22 稀释的补体0.1毫升。

抗-Ig血清0.1毫升（间接空斑）。

充分混匀,用毛细管吸取混合液填充小室,空隙以填充液补充。

（3）融化的石蜡-凡士林混合物将小室封闭。 37℃1小时，即可进行空斑计数。

[注意事项]

（1）小室内不能留有气泡。

（2）小室边缘必须用石蜡封严。

（3）严格在限定时间内计数空斑，不得超过数小时。

思考题：  简述溶血空斑试验原理及其实际应用

( 王军阳 )

第三篇 细胞免疫检测

实验十二 E-玫瑰花环形成实验

[ 实验原理 ]

人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体,在体外一定条件下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合,可以形成以T细胞为中心,周围黏附着多个绵羊红细胞的花环,为E花环试验（erythrocyte rosette test）。应用最广的有总E花环试验（Et,t为total的缩写）和活性E花环试验（Ea,a为active 的缩写）。 Et代表被检标本中T淋巴细胞的总数,Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细胞数,这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究,为某些疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考。

[ 实验材料 ]

1.1%肝素水溶液。

2.Hanks'液(无Ca2+、Mg2+)PH7.4-7.6。

3.淋巴细胞分离液（市售商品）。

4.绵羊红细胞悬液：取新鲜绵羊血以1:1的比例与爱氏血球保存液混合，置4℃备用,2周内使用。

5.0.8% 戊二醛、姬姆萨染液。

6.离心机、水浴箱,显微镜等。

[ 实验方法 ]

1.无菌抽取患者静脉血1毫升,加入事先有0.05毫升肝素液的试管内,混匀抗凝。

2.加Hanks'液1毫升于上述试管稀释血液,然后缓慢加入盛有1毫升淋巴细胞分离液的试管中,注意不要打乱交界液面。

3.2000 转/分钟水平离心20分钟。

4.小心吸取血浆层和分离液层之间的白色膜状的淋巴细胞层,Hanks'液洗涤两次,最后用含20%小牛血清的Hanks'液将细胞调成2X106/毫升。

5.将爱氏液保存的绵羊红细胞用 Hanks'液洗涤三次，弃上清，将压积红细胞用 Hanks' 液配成 1% 细胞悬液（ 8X10 7 / 毫升）。

6.Et 试验：将淋巴细胞悬液 0.1 毫升和绵羊红细胞 0.1 毫升混匀（细胞数合适比例为 1 ： 100 ）， 37 ℃ 水浴 10 分钟，低速离心 500 转 / 分钟， 5 分钟，再置 4 ℃ 2小时或过夜。取出后弃去大部分上清，轻轻摇匀，加0.8% 戊二醛 2 滴固定数分钟后涂片，自然干燥后加 1 滴姬姆萨染液，覆以盖玻片，高倍镜观察。凡淋巴细胞周围吸附 3 个或以上绵羊红细胞者为阳性花结细胞。

7.Ea试验:将淋巴细胞悬液0.1毫升和绵羊红细胞0.02毫升混匀（两者比例为1:20）,低速离心500转/分钟,5分钟,弃去大部分上清,轻轻摇匀,加0.8%戊二醛 2滴固定数分钟后涂片,其余程序同Et试验。

[ 实验结果 ]

随机计数 200 个淋巴细胞，记录其中形成花结的和未形成花结的淋巴细胞数,然后根据下列公式计算E花结形成百分率：E花结形成百分率 = 形成花结细胞数/（花结细胞数+未形成花结细胞数）X100%,一般正常值Et为50-70%,Ea正常值为 25—35%。

[ 注意事项 ]

1.一定要用新鲜血，否则会影响细胞活性，且绵羊红细胞受体会从T细胞表面脱落。

2.计数前，重悬和混匀细胞要轻柔，否则花结会散开消失。

思考题：

E 花环形成的原理是什么？为什么测 Ea比Et更有意义？

（王军阳）

实验十三 淋巴细胞转化实验

（Lymphocyte transformation test-LTT）

[实验原理]

T淋巴细胞表面具有植物血凝素（PHA）和刀豆蛋白（ConA）等非特异性有丝分裂原受体,在体内或体外遇到有丝分裂原刺激后,可转化为淋巴母细胞,依其细胞转化程度可测定T细胞的应答功能,称为淋巴细胞转化试验。

淋巴母细胞的主要特点：

（1）形态学改变:细胞体积明显增大,为成熟淋巴细胞3-4倍。核膜清晰,核染色质疏松呈网状。核内见明显核仁1-4个。胞浆丰富,嗜碱性,有伪足样突出。胞浆内有时可见小空泡。

（2）细胞内核酸和蛋白质合成增加。

（3）细胞代谢功能旺盛。

利用淋巴母细胞的不同特点，目前有多种实验方法可用于淋巴细胞转化程度的检测。根据其形态学改变，可通过体内法和体外法检测；根据细胞内核酸和蛋白质合成增加的特点，可通过 3 H-TdR 掺入法检测；根据细胞代谢功能旺盛的特点，可通过 MTT 法进行检测。

一、淋转试验形态学检查法（体内法）

[实验原理]

在体内，当外周血T淋巴细胞遇到PHA 或ConA后可发生转化形成淋巴母细胞,通过采集外周血涂片染色,镜下计数100-200个淋巴细胞,计算其转化率。转化率高低可反映机体细胞免疫水平,因此常作为检测细胞免疫功能的指标之一。形态学方法简便易行，但结果受操作和主观因素影响较大。

[实验材料]

1. ConA 溶液：根据ConA的纯度配制成最适浓度，一般为0.3-0.5mg/ml。

2.姬姆萨染液或瑞氏染液。

3.玻片、离心机、显微镜、计数器等。

[实验方法]

1.实验前3天，每只小鼠腹腔注射ConA0.3-0.5毫克。

2.3天后,通过摘除小鼠眼球采集外周血,加入预先加有肝素的试管中。

3.涂片:取1小滴抗凝血滴在玻片中央,用推片将血液涂开。自然干燥。

4.固定:取甲醇1-2滴滴在涂片上,自然干燥。

5.染色:加姬姆萨或瑞氏染液2滴于涂片上,同时加2滴水,用吸管水平涂开,使染液均匀覆盖涂抹面,染色时间为5-10分钟。

6.自来水细水冲洗染液,然后用吸水纸轻轻吸干玻片上的液体。

7.显微镜观察结果,计数淋巴转化细胞,计算转化率。

[实验结果]

转化过程中,常见的细胞类型有：淋巴母细胞、过度型淋巴母细胞、核分裂相细胞和成熟淋巴细胞等。计数时,过度型淋巴母细胞和核分裂相细胞亦作为转化细胞。

转化率=转化的淋巴细胞数/（转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数）×100%

二 淋转试验3H-TdR掺入法

[实验原理]

T淋巴细胞受 ConA或PHA激活后,进入细胞周期有丝分裂。当进入细胞周期S期时,细胞合成DNA量明显增加,在培养基中加入氚（3H）标记的DNA前身物质胸腺嘧啶核苷（TdR）,则3H-TdR 被作为合成DNA的原料被摄入细胞,掺入到新合成的DNA中。根据同位素掺入细胞的量可推测淋巴细胞对刺激物的应答水平。掺入的同位素3H,经液体闪烁测量法测出,将3H每分脉冲数（cpm）加以计算,用不同公式表示结果。

同位素掺入法淋转试验,较之形态学方法更为客观、准确,重复性也好,但需一定设备条件。

[实验材料]

1.1640 培养液

2.ConA ：根据ConA 的纯度配制成最适浓度，一般为5-10μg/ml 。

3.脂溶形闪烁液：

POPOP（1,4 双（5-苯基恶唑基-2）苯0.4g

PPO[2, 5二苯基恶唑]4g

无水乙醇 200ml

二甲苯 800ml

POPOP 先用少量二甲苯置 37 ℃ 水浴溶解后，再补足其他成分即可。

4.3H-TdR（市售商品）：临用前用培养液稀释成10μCi/ml 。

5.多头细胞收集仪、玻璃纤维滤纸、样品杯,液体亲烁计数器等。

[实验方法]

1.无菌分离淋巴细胞（同E花环）,用1640培养液调制成1X106/毫升,加入96孔培养板,每孔100μl。

2.每孔加 ConA 100μl,每个样品加3孔,另3孔不加ConA作对照。37℃培养约56小时。

3．结束培养前加入3H-TdR0.5-1.0μCi/孔。

4.继续培养6-12小时后,用多头细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维滤纸上。

5.烤干后,将滤纸放入闪烁杯中,每杯加闪烁液5毫升,液闪仪测定各管cpm 。

[实验结果]

将ConA刺激组和对照组各自的平均cpm值,代入下列公式计算ConA刺激指数（index of stimulation, SI）

SI=ConA 刺激管的cpm均值/对照管的cpm均值

三 淋转试验 MTT 法

[实验原理]

MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）是Mosmann1983年报告的。原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物（MTT）由黄色还原为兰色的甲肷,后者溶于有机溶剂（如二甲基亚枫、酸化异丙醇等）,甲肷产量与细胞活性成正比。可在560nm处用酶标仪测定其OD值。

[实验材料]

1.MTT:PBS配制成5毫克/毫升的储存液,过滤除菌后冻存。

2.溶剂:DMSO、10%SDS、0.04的盐酸-异丙醇。

3.酶标仪

[实验方法]

1.无菌分离淋巴细胞（同E花环）,用1640培养液调制成1X106/毫升,加入96孔培养板,每孔100μl。

2.每孔加ConA100μl,每个样品加3孔,另3孔不加ConA作对照。 37℃培养约56小时。

3.结束培养前加入20μl/孔。继续培养6小时左右。

4.2000转/分钟离心10分钟,弃上清。

5.每孔加 100μl溶剂,轻微震荡使甲肷产物溶解。

6.在酶标仪上波长560nm测定OD值。

[实验结果]

SI=ConA刺激管OD均值/对照管OD均值。

[注意事项]

1.淋巴细胞要新鲜制备,否则会影响实验结果。

2.ConA 刺激时间要根据淋巴细胞转化情况决定，一般为55-66小时。

思考题：

淋巴细胞转化试验与 E 花环试验的原理有何不同？它们的检测有何意义？

( 王军阳）

第四篇：免疫病理反应

实验十四 豚鼠速发型过敏反应

一.实验原理

经过敏原刺激的动物机体可产生IgE类抗体，此抗体可与肥大细胞、嗜碱粒细胞表面的IgE Fc受体结合，使机体处于致敏状态。同一致敏原第二次刺激机体后，可立刻使肥大细胞、嗜碱粒细胞释放生物活性物质如组织胺、缓激肽、慢反应物质等，导致过敏性休克。

二、实验材料：

豚鼠、正常马血清，鸡蛋清，无菌注射器，针头，解剖用具。

三、实验方法

1.取3只豚鼠，以甲、乙、丙编号,其中甲、乙两只经腹腔或皮下注射1:10 马血清0.1ml 。丙注射0.1ml生理盐水做为对照。

2.经14～21日，甲豚鼠心脏注射鸡蛋清 1 ～ 2ml,乙丙两只豚鼠经心脏注入马血清1～2ml 。

3.注射后密切观察动物状态，如注射抗原后数分钟动物出现不安，用前爪搔鼻，咳嗽，打喷嚏、耸毛、痉挛、大小便失禁、呼吸困难、站立不稳，最后窒息而死于过敏性休克。（轻型者可逐渐恢复而不死亡，此时动物处于脱敏状态，在一定时间内注射同种过敏原，则不出现过敏症状）。

4.将死亡豚鼠解剖，可见肺气肿，豚鼠肠蠕动正常，颜色正常。

5.甲丙豚鼠均不出现过敏症状。四、注意事项：

心脏注射必须准确，有回血后再注入过敏原。

思考题：

1. 可用几种方法制备动物速发型超敏反应动物模型。

2. 用青霉素时为何要做皮试？脱敏的机理是什么？

实验十五 免疫复合物型超敏反应

（Immune Complex hypersensitivity）-Arthus 现象

一、实验原理：

Arthus reaction 是指给机体反复多次注射抗原，使个体内存在高水平抗体时，然后在局部皮下组织注射相同性质的抗原。则在局部组织形成大复合物，导致激活补体，释放过敏毒素，组织胺及凝聚血小板，释放血管活性物质，最终导致局部出现水肿、出血、坏死等炎症反应，这种现象称 Arthus 现象。此现象在抗原注射后 1 ～ 2 小时后出现反应。 3 小时反应达到高峰， 10 ～ 12 小时反应开始减弱，趋向消退。

二、实验材料：

动物（采用豚鼠或家兔），抗原（马血清），无菌注射器及针头。

三、实验方法：

给动物皮下注射马血清 3 ～ 5ml ，共 4 ～ 6 次，每次间隔 4 ～ 5 日。

自第四次注射抗原后，在 1 ～ 2 小时于注射局部出现水肿、出血及坏死等炎症反应。 3 ～ 6 小时反应达高峰、 10 ～ 12 小时开始减弱。豚鼠结核菌素试验

一、实验原理：

结核菌素为结核杆菌的菌体成分。注入机体皮内，若受试者曾受结核杆菌感染或接种过卡价苗。则结核菌素刺激致敏的 T 细胞，释放多种淋巴因子，在注射局部形成以单核细胞浸润为主的炎症，表现为红肿、硬结、溃烂，此即迟发型超敏反应。

二、实验材料：

豚鼠两只， 1 ： 1000 稀释的旧结核菌素（ Old tuberculin, O. T ）卡介苗注射器及针头。

三、实验方法：

1.取豚鼠两只，其中一只于两个月前曾注射卡介苗，用剪刀将豚鼠背部之毛剪净或用剃刀剃净，并用碘酒、酒精棉球消毒之。

2.用卡介苗注射器吸取 1 ： 1000 的旧结核菌素，于两只豚鼠皮内各注入 0.1ml 。

3.注射后 48 ～ 72 小时观察局部皮肤反应。

四、结果分析：

皮肤反应可分为四种情况

实验十六 豚鼠结核菌素试验

【实验原理】

结核菌素为结核杆菌的菌体成分。注入机体皮内，若受试者曾受结核杆菌感染或接种过卡价苗。则结核菌素刺激致敏的 T 细胞，释放多种淋巴因子，在注射局部形成以单核细胞浸润为主的炎症，表现为红肿、硬结、溃烂，此即迟发型超敏反应。

【实验材料】

豚鼠两只， 1:1000 稀释的旧结核菌素（Old tuberculin, OT）卡介苗注射器及针头。

【实验方法】

1.取豚鼠两只，其中一只于两个月前曾注射卡介苗，用剪刀将豚鼠背部之毛剪净或用剃刀剃净，并用碘酒、酒精棉球消毒之。

2.用卡介苗注射器吸取 1:1000 的旧结核菌素，于两只豚鼠皮内各注入 0.1ml 。

3.注射后 48 ～ 72 小时观察局部皮肤反应。

【结果分析】

皮肤反应可分为四种情况

（刘意如）

实验十七 小鼠 DNFB 试验

一、实验原理

DNFB （二硝基氟苯）是一种化学物质，可作为半抗原与皮肤内的组织蛋白结合，成为完全抗原，经此抗原致敏的小鼠，在耳部涂抹 DNFB 后，可对 DNFB 产生特异的迟发型超敏反应，耳部出现肿胀，镜检可见大量的单核细胞，淋巴细胞浸润。

二、实验材料：

小鼠两只， 1%DNFB 溶液（用 1 份丙酮加 1 份橄榄油稀释）

三、实验方法：

1 ．将两只小鼠腹部刮毛，其中一只在腹部涂抹 1%DNFB100 μ l ，另一只涂抹不含 DNFB 的丙酮橄榄油 100 μ l ，做为对照。

2 ．五天后，每只小鼠的左耳涂上 1%DNFB 溶液 5 μ l 。

3 ． 24 小时后，观察小鼠左右耳肿胀情况，亦可做组织切片观察细胞浸润情况。

四、结果分析：

对照小鼠由于未用 DNFB 过敏，左耳不出现肿胀，试验小鼠由于经 DNFB 致敏，受第二次 DNFB 刺激后，在局部产生迟发型超敏反应，此试亦称接触超敏反应。