“瘦肉精”检测方法

报告

系 别：化学系

班 级：08.7班

小组成员：杨丽冰、闫丽君、梁文涛、于冰、

朱文瀚

一、前言

中国的重大食品安全问题可谓生生不息，杀之不绝。继三聚氰胺奶粉、苏丹红、皮革奶事件之后，今年的“3?15”又曝出了双汇“瘦肉精”重大食品安全事件。与三聚氰胺奶粉事件相似，这次“瘦肉精”事件的主角又是一家著名企业——双汇集团。

双汇集团是中国肉类加工的“巨无霸”。双汇原是河南省漯河市国资委下属地方国企，20xx年，漯河市国资委以20亿元人民币的价格，将有“现金奶牛”之称的双汇实业集团100%的股权转让给美国高盛集团控制的罗特克斯有限公司，完成了双汇集团的“外卖”。有市场人士评论，这个中国最大的肉类加工“托拉斯”，在中国500强中排行160位的企业，如果不是到了忍无可忍的地步，有关部门是绝不会拿出来“祭杀”的。

双汇集团“瘦肉精”事件爆发后，国内猪价应声大幅下跌，补栏受抑，并已波及上游饲料原料需求，一周内仅全国养猪业因事件引起猪价下跌所至损失已3亿元以上。“瘦肉精”事件除了在经济上的负面影响，还产生了极大的社会冲击，继续动摇了中国老百姓对国内食品安全的信心。中央近年不断强调重视民生，什么是民生？衣食住行就是最基本的民生问题。如果国内连基本的食品安全都不能保证，那何谈民生呢？

在双汇“瘦肉精”案件中，河南省已控制涉案犯罪嫌疑人32人，抓捕归案29人，正式立案8起，分布于养殖户、生猪经纪人、采购员等各环节。农业部有关负责人3月23日表示，有关“瘦肉精”的案件被媒体报到后，农业部立即全面启动了生猪养殖重点地区排查工作，确保出栏生猪质量安全。

“瘦肉精”学名克伦特罗，是一种人工合成的β-肾上腺素能受体激动剂。“瘦肉精”中毒的症状表现比较特别，主要是心慌、肌肉震颤、头痛以及脸部潮红等，临床表现主要有话多、心跳过快、过度兴奋、心慌手抖等，常见有恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状。一般来说不会有大问题，健康的成年人如果得到及时医治，问题不会太过严重，但如果中毒的人本身患有心脑血管等慢性疾病，瘦肉精中毒甚至有可能致命。特别是对心脏病、心率失常、高血压、青光眼、

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糖尿病、甲状腺机能亢进等疾病的患者有较大危害，长期食用则有可能导致染色体畸变，会诱发恶性肿瘤。

二、“瘦肉精”的检测方法

1. 高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法不需要衍生，是利用β-肾上腺素能激动剂分子可与C18或C8固定相分子相互作用。

1.1 紫外检测器检测法

紫外检测器价格便宜，最为普及，但其选择性不好，在分离效果不好的情况下易受干扰，且灵敏度不高，该检测器常用于检测组织中高浓度的盐酸克伦特罗。

1.2 电化学检测器检测法

电化学检测器工作电位为1.25V，测定猪肉组织中的盐酸克伦特罗，方法灵敏度高，简便，可用于肌肉、肺脏、肝脏、肾脏及脂肪组织中盐酸克伦特罗残留的检测。电化学检测器在样品净处理较好时可以得到很好的灵敏度，但它不稳定，重现性差且不能作为梯度洗脱条件下检测器。

1.3 质谱检测器检测法

可以大大降低检测限，肉鳍是二级质谱可以作为特异性检测器，也可以弥补色谱上分离的不足，使得对样品处理的要求也大大降低。检测的精确度和准确度高，节省时间，重现性好，可以达到较高的灵敏度，效率成本比价高，操作简便，易于普及，而且假阳性率低，缺点是样品处理时间长，检测过程繁琐，对设备要求高，价格昂贵，在实际应用中受到一定的限制。

2. 气质联用法(GC-MS)

常用于测定血液及组织中盐酸克伦特罗残留。GC—MS与HPLC法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低，具有快速、分离效果好、费用较低等优点，能在多种残留物同时存在的情况下可以准确地对某种特定的残留物进行定性、定量分析，中国已将此法定为检测盐酸克伦特罗的确证性方法。但其衍生化操作繁琐，成本高，而且气质联用仪目前在国内实验室并未普及，难于开展此项工作。

3. 毛细管区带电泳法(CE)

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随着毛细管区带电泳技术(CE)自动化操作的实现，由于其具有灵活性高、重复性好、操作简便、所需样品量极少(一般只需几纳升)、许多分离参数如缓冲液的组成和pH值、毛细管的类型以及所使用的电场的波形等都可以调节的优点，毛细管区带电泳法非常适用于那些难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析，为快速、批量分离和分析离子化样品提供了一个很好的选择性手段。尽管毛细管区带电泳法分析样品还存在着一些亟待解决的问题，如检测时间较长，不能满足在线检测，仪器复杂，缺乏配套的检测器 ，目前使用范围不广，但是其仍具有较高的研究价值和应用前景。

4. 免疫分析法(IA)

免疫分析法法灵敏高，一次可处理大量样品，样品处理简单或者不需要处理，成本低，每个检测成本在1～10元左右。随着新标记物的发展与联合应用、单克隆以及基因工程抗体的应用及免疫放大技术，明显提高检测特异性，可实现分子水平的检测。

4.1 放射免疫分析技术(RIA)

放射免疫分析技术具有特异性强、灵敏度高、准确、快速、操作简便、易于标准化等优点；但是由于RIA需要较昂贵的液体闪烁仪或γ-放射仪，且放射性同位素对人员有一定的伤害，废弃物又不易处理，这些都限制了此种方法的广泛应用。

4.2 酶免疫分析法(EIA)

酶联免疫吸附法(Enzyme — linked immunoassay，ELISA)是检测盐酸克伦特罗较高效的酶免疫分析方法，是用酶标记的抗体或抗抗体来进行的抗原-抗体反应，利用免疫学抗原抗体特异性结合和酶的高效催化作用，通过化学方法将植物辣根过氧化物酶(HRP)与盐酸克伦特罗结合，形成偶联克伦特罗，然后加入待测克伦特罗，竞争性与克伦特罗抗体结合，洗涤后加底物，由于酶的专一性催化作用，可使原来无色的底物通过水解，氧化或还原反应而显示颜色，根据有色物的变化计量待测克伦特罗的量。

目前国内主要采用ELISA作为筛选法，该法快速、简便，可定性或半定量，只能检查出克伦特罗及其同类药物(β-肾上腺受体激活剂)的存在，不能确定其

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各自化学本质，假阳性率高，需用GC—MS确证，但该仪器价格昂贵，一般实验室不易普及；另外国内试剂质量不过关，而国外试剂盒较贵，成本大。

4.3 滴金免疫技术(DIGFA)

它是胶体金标记技术与快速免疫斑点结合技术相结合的产物。滴金免疫技术的关键技术是抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金标记的单克隆抗体的制备、免疫渗滤装置(如硝酸纤维抗体包被膜)的制备，后3种关键技术已比较成熟，若研制出特异性强、灵敏度高的盐酸克伦特罗单克隆抗体，就能开发出具有市场潜力的检测试纸条，检测盐酸克伦特罗的滴金免疫试纸条或滴金免疫测试盒可实现盐酸克伦特罗的高效现场检测。

三、总结

“瘦肉精”问题的源头还是在养殖上，中国生猪养殖主要靠农户散养，监管起来比较难。对于生猪出栏是否合格，“瘦肉精”检测不是一个必检项目。除了双汇等大企业，中国的大部分屠宰企业没有检测“瘦肉精”的能力和设备，“瘦肉精”的检测可以说是一个真空。

事实上，此番双汇“瘦肉精”排查工作，即便是在上级高压之下，河南沁阳、温县等地的监管部门仍犯了“上紧下松”的顽固毛病，抽检合格率竟高达98.8%。幸亏央视一追到底，才让当地不得不认错，并承诺“重新排查”。河南“瘦肉精”事件，从发现、曝光，一直到“拉网式排查”环节，都要新闻媒体来推着走，否则监管系统就要失灵，这实在是媒体不可承受之重，实为可悲！

某种意义上说，正是当前的食品监管体系，一些地方政府的利益错位与纵容袒护，害了我们的企业，让他们把胆量从“偷针”练到“偷金”，这才是更让公众不安的一点。

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第二篇：检查瘦肉精方法

检测瘦肉精的方法：高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱一质谱法（GC－MS）、毛细管区带电泳法（CE）和免疫分析技术（IA）。

而我国结合自己的实际情况，20xx年农业部首先组织制定了饲料中盐酸克伦特罗的测定标淮。该标准选择确定了两种：即高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱一质谱法（GC－MS）。其中将HPLC法作为检测瘦肉精的半确证性方法，其最低检测限为 0．05μg/kg，

优点：是检测精确度高，而且假阳性率低；缺点是检测过程烦琐、检测时间长，需贵重仪器、难于操作、价格昂贵。

而GC一MS法优点是能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析。GC－MS法与HPLC法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低，已将GC－MS法定为检测瘦肉精的确证性方法。GC－MS法的缺点同HPLC相似。

(一)试剂和材料 以下所有试剂，除特别注明外，均为分析纯试剂；水为符合GB／T6682规定的二级水。

①盐酸克伦特罗对照品：含盐酸克伦特罗不得少于98．5％ ②盐酸 ③无水甲醇 ④氢氧化钠 ⑤磷酸二氢钾 ⑥磷酸 ⑦盐酸溶液 取盐酸4．2ml，加水至1000ml，即得。 ⑧o．5mol／L磷酸二氢钾溶液 取磷酸二氢钾68g，加水800ml溶解并用磷酸调pH值至3．O，用水稀释至1000ml，即得。

⑨0．05mol几磷酸二氢钾溶液 取磷酸二氢钾6．88，加水800ml溶解并用磷酸调pH值至3．0，用水稀释至1000mi，即得。

a．氢氧化钠溶液 取氢氧化钠48，加水使溶解成100mi，即得。

b．盐酸克伦特罗对照品储备液(1mg／mi) 准确称取28．3mg盐酸克伦特罗对照晶至25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至25ml，一20~C以下保存，有效期1年。

⑩盐酸克伦特罗对照品工作液(10ttg／mi) 取lmg／mi储备液o．5ml到50mi量瓶中，加水至50mi，2～8~C保存，有效期1个月。

⑾盐酸克伦特罗对照溶液(100ng／m1) 取1(ug／m1工作液o．5ml到：50mi量瓶中水至50mi，2～8~C保存，有效期1个月。

⑿盐酸克伦特罗检测试剂盒(2～8~C冰箱中保存)

⒀固相萃取柱C，s：100mglml含碳量≥17％

(二)仪器和设备

①酶联免疫反应读数仪 ②分析天平：精度0．00001g ③天平：精度0．01g④冷冻离心机 ⑤50mi具塞离心管 ⑥匀浆机 ⑦微型振荡器 ⑧回旋振荡器 ⑨空气压缩机 ⑩干热浓缩器 ①微量移液器 单道20uL，50ul，100uL；多道50～250uL，

(三)测定步骤

①试料的制备(尿)

取供试尿lml，于3000r／min离心l0min，上清液作为供试试料，直接供酶联免疫测定法测定。

取空白尿lml，于3000r／min离心l0min，上清液作为空白试料，直接供酶联免疫测定法测定。

取空白尿2ml，于3000r／min离心l0min，上清液1.0ml添加l00ug／L的克伦特罗对照溶液20／H。作为2ug/l空白添加试料，直接供酶联免疫测定法测定。

②试料的制备(肝)

取约l00g新鲜或冷冻后融化的空白或供试猪肝,用匀浆机以10000r／rain匀浆1-2min，使均匀呈糊状，一20~C以下冰箱中贮存备用。

取均浆后的供试肝样，作为供试试料。

取均浆后的空白肝样，作为空白试料。

取均浆后的空白肝样(1土0．05)e添加l00ng／m1的克伦特罗对照溶液20tzL作为2ng／g空白添加试料。

a：提取(肝) 取(1士o．05)z试料，置50ml离心管中；加盐酸溶液5.0mi，旋涡混匀，中速振荡1．5h；在10—15~C下以4000r／mill以上速度离心15min；上清液移人另一50ml离心管中，加入氢氧化钠溶液300gL，混匀，振荡15min；加0.5mol／l磷酸二氢钾溶液4。0ml，混匀，2—8~C放置过夜；取上述溶液于10～15~C以4000r／111113以上的速度离心15min，上清液备用。

b．净化(肝) C，，固相萃取柱依次用无水甲醇3mi、0.05mol／L磷酸二氢钾溶液2mi预洗，不使柱床干涸；将备用上清液全部过柱；用0.05mol／L磷酸二氢钾溶液2ml淋洗，挤干，弃去所有淋洗液；用无水甲醇2mi洗脱，流速控制在0.5ml／mm以下，挤干，收集洗脱液；于50～60~C下用氮气或空气缓缓吹干洗脱液；残余物用水1.0ml溶解，以4000r／mill以上的速度离心15rain，清液作为试样溶液供酶联免疫测定法测定。

③测定

a．室温应控制在19～30~C。

b．取在19—30~C放置1—2h的试剂盒，按每个标准溶液和试样溶液至少两孔计算所需酶联板条的数量，插入框架。每个微孔加入用缓冲溶液100倍稀释的抗体100~tL，封口膜封板，室温孵育30min。

c倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。用多道移液器加水250pL到酶联板的微?L内，稍后倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，如此重复操作洗板3次。

d．分别吸取标准溶液、空白试料、空白添加试料和供试试料各20uL，分别放入不同微孔底中央，并在每孔内加入用缓冲溶液100倍稀释的酶结合物100~I。，在微型振荡器上混匀，用封口膜封好，室温孵育30min。

e．倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体，重复洗板3次。

f．用多道移液器加入用底物缓冲溶液10倍稀释的底物100uL，室温避光孵育15min。 g．用多道移液器每孔加终止液100uL。

h．在1h内将酶联板放于酶标仪内，于450nm波长处测定吸光度值。

(四)计算 用数据分析软件对结果进行分析，绘出标准曲线，并得出试料中克伦特罗的含量。

(五)灵敏度和回收率

本方法的平均检测下限为0.1mg／Kg。

本方法在1ug／kg添加浓度水平上猪尿回收率范围为60％一120％，猪肝回收率范围为40％～120％。