概论
免疫球蛋白的水解片段~胃蛋白酶水解片段
F(ab’) 2片段的意义：既保留了结合双价抗原的生物学活性，又避免了Fc段作为抗原的免疫原性和免疫结合性。用于治疗时，可以避免或减轻可能引起的毒副作用；用于免疫检测时，可以避免标本中抗抗体对检测结果的干扰。
抗原抗体结合力
静电引力、范德华引力:作用最小、氢键:最具特异性、疏水作用力:作用最大
多克隆抗体（pAb)：抗原表位刺激机体多个B细胞克隆，产生针对抗原分子上一种或多种表位的抗体的混合物。
免疫原：完全抗原，既能刺激机体产生免疫应答，也能与免疫应答产物特异性结合。 半抗原(hapten)：仅有抗原性而无免疫原性的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等 载体(carrier)：赋予半抗原以免疫原性的物质
免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质称为免疫佐剂,简称佐剂
抗血清制备是将制备好的免疫原按照一定免疫程序接种给所选择动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体
单克隆抗体（McAb）：借助B细胞杂交瘤技术，由单个细胞增殖而成的细胞克隆所产生的、高度均一的、单一特异性的抗体。
单克隆抗体制备的基本原理：致敏B淋巴细胞能分泌特异性抗体，但不能在体外长期存活。骨髓瘤细胞可以在体外大量繁殖，但不能分泌特异性抗体。将小鼠的骨髓瘤细胞和能分泌抗体的B淋巴细胞融合，融合的杂交瘤细胞既具有肿瘤细胞易繁殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌抗体的能力。由于每个致敏的B淋巴细胞只针对单一的抗原表位产生抗体，所以克隆化的杂交瘤细胞能够分泌针对单一表位的单克隆抗体。 只有杂交的细胞能在HAT选择性培养基中长期存活，其余未杂交的细胞都将死亡。 大量制备单克隆抗体的方法有两类：动物体内诱生法、体外培养法
单克隆抗体的特性：高度特异性、高度的均一性、弱凝集反应和不呈现沉淀反应、对环境敏感性
解决勾状效应的根本方法为两步法检测：第一步：包被抗体捕获抗原成为固相，然后分离游离抗原；第二步：固相抗原与酶标抗体结合，分离液相酶标抗体后记录检测信号。 RF引起的假阳性RF为变性的抗IgG抗体。是一种自身抗体，多为IgM型、人抗鼠抗体效应(HAMA效应) 对双抗体夹心法检测的干扰
BAS与ELISA偶联应用形式：用于固相化抗体或抗原的制备：即是先将亲和素包被于固相载体，抗体或抗原也先与生物素结合，然后通过亲和素—生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。用于ELISA终反应的放大：用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗体，然后连接亲和素-酶结合物（BA-ELISA）、或亲和素及酶标生物素（BAB-ELISA）或ABC试剂（ABC-ELISA），从而使反应信号放大，提高检测灵敏度。
凝集反应
颗粒性抗原与特异性抗体结合后，在适当的电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象。可溶性抗原/抗体与载体颗粒结合形成致敏颗粒后，与相应的抗原/抗体结合，也能发生凝集反应。 凝集反应发生分为两个阶段：1、抗原抗体的特异性结合阶段；2、出现肉眼可见的凝集现象。
溶液中负离子强度越大，Z电位也越大，Z电位使颗粒间互相排斥。在凝集反应中IgM的作用远大于IgG。
为促使凝集现象的出现，可采取以下措施：1、增加蛋白质和电解质，缩短颗粒间的距离；2、增加溶液的
黏稠度；3、用胰酶和神经氨酸酶处理；4：以离心的方式克服颗粒间的排斥力。
半定量试验：将抗体标本对倍稀释后检测，出现阳性的最高稀释度为待测抗体的效价和滴度。
1、直接凝集试验：颗粒性抗原在有电解质的参与下，直接与相应抗体结合出现的凝集现象。
玻片凝集试验、试管凝集试验
2、间接凝集反应：将可溶性抗原或抗体，与相应抗体或抗原作用，在适当电解质参与下，出现特异性凝集现象称为间接凝集反应。
1）
2）反向间接凝集试验：用抗体致敏载体检测相应抗原；
3、间接凝集抑制试验
1)试验 目的检测物：。检测过程：标本＋抗体
→抗原致敏的颗粒→阳性（不凝集）；阴性（凝集）。
2)反向间接凝集抑制试验 目的检测物：。检测过程：标本＋抗原
→抗体致敏的颗粒→阳性（不凝集）；阴性（凝集）。
4、协同凝集反应：也是反向间接凝集试验，只是所用载体为金黄色葡萄球菌。
间接血凝试验：以红细胞为载体的间接凝集试验。将可溶性抗原(或抗体）吸附人的“O”型血
红细胞或绵羊或家兔的红细胞，制成致敏血红细胞，与相应抗体（或抗原）作用，在适宜电
解质参与下，出现红细胞凝集现象。
乳胶凝集试验：以聚苯乙烯胶乳颗粒为载体的间接凝集试验。
明胶凝集试验：以聚苯乙烯胶乳颗粒为载体的间接凝集试验。
抗球蛋白试验(Coombs试验 ) 诊断免疫溶血性贫血的主要方法。
目的：检测抗红细胞不完全抗体。 不完全抗体：能与颗粒抗原牢固结合，但一般不出现可
见反应，多为7S的IgG。
测定患者红细胞上有无附着不完全抗体。在洗涤过的红细胞悬液加入含抗人球蛋
白的试剂，混和后离心一分钟促进凝集。肉眼或显微镜下能见到红细胞凝集，即为阳性，说明红细胞表面
有不完全抗体。新生儿溶血、自体免疫溶血性贫血、输血反应、某些药物或疾病引起的免疫溶血性贫血。
测定患者血清中有无加入等量5% (Rh阳性的
O型红细胞)，温育以促使血清中的不完全抗体结合于红细胞上(致敏)，将红细胞充分洗涤，以后同直接试
验。如果红细胞发生凝集而正常对照(未经与受检血清温育的正常红细胞)不凝集，即为阳性，表明受试的
血清中存在不完全抗体。多用于检测母体Rh(D)抗体，尽早发现和避免新生儿溶血。
沉淀反应
可溶性抗原与相应的抗体混合，在电解质存在的条件下，两者比例适合，即可有沉淀物出现 沉淀反应分为两个阶段：抗原抗体特异性结合；形成可见的免疫复合物。经典的沉淀反应在第二阶段观察
或测量沉淀线或沉淀环等来判断结果，称为终点法需要几十分钟到数小时；在第一阶段测定免疫复合物形
成的速率，称为速率法。
影响因素：
浊度形成的关键因素。 高剂量钩状反应(high dose hook effect)：当抗原过剩时，形成的IC分子小，而且容易离解，
浊度反而下降。用抗体检测抗原，当反应液中抗体过量时，在一定范围内，IC的形成量与抗原量的递增
正比，当抗原量递增至抗原抗体最佳比例时，IC的形成到达高峰。如再增加抗原量，IC的形成量反而减少。
因此，如检测时抗原过量则得出错误的检测结果。反应体系中保持抗体过量。
2、抗体的质量：特异性高，无交叉反应；效价高，避免低效价抗体引起的非特异性浊度；亲和力高，免疫复合物形成快，结合牢固；R型抗体，等价带宽，亲和力强。
3、抗原抗体反应的溶液：最适pH6.5-8.5；在一定范围内，离子强度大，IC形成快。
4、增浊剂PEG，tween-20。消除抗原抗体周围的电子云和水化层，促进加速IC的形成。
凝胶内沉淀试验：可溶性抗原和抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在二者比例适当的地方形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法： Mancini曲线：大分子抗原、时间扩散＞48h，常数K＝C∕d2、普通坐标纸曲线 Fahey曲线：小分子抗原、扩散时间24h、常数K＝logC∕d、半对数坐标纸曲线 C为抗原浓度， d为沉淀环直径
双向免疫扩散试验
1、抗原或抗体抗原浓度越高，形成的形成的沉淀线距抗体孔越远；
2、抗原或抗体相对分子量：抗原或抗体在琼脂内的扩散受分子量影响，分子量大者扩散速度慢，扩散圈小，局部浓度高，因此形成的沉淀圈弯向分子量大的一方，若二者分子量相等，则沉淀线呈直线；
3、a放在两个邻近的孔中，对应抗体放在中央孔中，两条沉淀线在其相邻的末端会互相连接和融合；若两个不同的抗原a和b，则两线互相交叉；若两个抗原有部分相同成分a和ab，则两线除有相连部分以外还有一伸出部分。
4、滴定抗体效价：固定抗原浓度，稀释抗体，出现沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。
一、对流免疫电泳 将双向免疫扩散与电泳两种方法的结合，定向加速的双扩。原理：在pH8.6的溶液中，大部分蛋白抗原带负电，在电场中向正极移动；IgG 分子量大，带的电荷少，在电场中虽也向正极移动，但速度缓慢。由于电渗引起负极移动的潮流速度超过了IgG向正极的移动，带动抗体移向负极，形成与抗原间的对流。二者相遇后，在最适比例处形成沉淀线。
二、火箭免疫电泳 将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。原理：电泳时，含于琼脂凝胶中的抗体不发生移动，而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。当抗原与抗体分子达到适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高度与样本中的抗原浓度呈正相关。
三、免疫电泳 免疫电泳是区带电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。 将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开。停止电泳后与电泳方向平行挖一小槽，加入含相应Ab的血清，在两侧后加入抗体做双相免疫扩散，已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，各区带在相应位置与Ab形成沉淀弧。
放射免疫技术
1.比放射：单位化学量标记物中所含的放射性强度，也可理解为每分子被标记物所挂放射性原子数目，比放射性过高，将影响标记物免疫活性，因为辐射自损伤大。
2.亲和性（Ka）抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合强度，Ka值高（109～12L/mol）有助于提高灵敏度、精确度和准确度
3.特异性：指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力
放射免疫分析（RIA）
适用：微量蛋白质 、激素、多肽等 以放射性核素标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争
结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。（特异性抗体限量）
125I-标记物的制备－标记
直接标记法（化学或酶促反应+取代反应置换）：乳过氧化物酶（LPO）标记法
间接标记法 联接标记法( bolton-Hunter 法)
分离结合、游离标记物：二抗体沉淀法、PEG 沉淀法、PR 试剂法、活性炭吸附法、固相分离法 测定仪器: 晶体闪烁计数仪(γ射线, 131I 125I 57Cr)、液体闪烁计数仪(β射线, 14C 3H 32P) 操作： 加样?温育?沉淀离心?放射性测定
临床意义：1.内分泌疾病的诊断:T3、T4、TSH、TG、TM、妇科激素、生长激素、皮质醇、醛固酮、甲旁素、睾酮、胰岛素、C肽、胃泌素、前列腺素等等.
2.传染性疾病及寄生虫疾病的诊断3.肿瘤相关抗原 CA199、CA125、PSA、SCC
4.血液疾病的诊断:转铁蛋白、白介素、细胞因子5.血药浓度的检测:洋地黄、地高辛、吗啡
免疫放射IRMA 以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。（标记抗体过量） 特点是用核素标记抗体直接结合受检标本中抗原的非竞争性免疫结合反应.通过固相免疫吸附剂作为B或F的分离手段.
属固相免疫标记测定,原理与ELISA极为相似.
IRMA主要是标记物是核素及最后检测是放射性量.
ELISA的标记物是酶, 酶催化底物生成有色产物,根据颜色反应程度定性或定量.
单位点 IRMA：先用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用固相抗原结合未结合的标记抗体并将其分离, 测定上清液的放射量
双位点 IRMA：先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。
RIA与IRMA异同点
1.标记物:RIA标记抗原,IRMA标记抗体 2.反应速率:RIA中抗体微量,必需高亲和力的多克隆抗体.IRMA中抗体过量,反应较RIA快,可应用单克隆抗体.
3.反应模式:RIA为竞争抑制,放射量与受检抗原成反比.IRMA为非竞争结合,放射量与受检抗原成正比.
4.特异性:应用单抗的IRMA的交叉反应率较RIA低.
5.标准曲线工作浓度:RIA为2～3个数量级,IRMA可达3个数量级以上
6.分析误差:RIA加入的抗体和标记抗原均为定量的,加样误差可严重影响结果.而IRMA的标记抗体和固相抗体均为过量,只存在标本的加样误差.IRMA批内批间变异 较小.
7.其他:RIA可以测大分子量和小分子量的物质,应用少量高亲和力的多克隆抗体.IRMA只能测在分子上具有2个以上抗原表位的物质,应有较多的来源丰富的单克隆抗体.
酶免疫技术
特点：抗原抗体反应的特异性、酶高效催化反应的专一性
主要试剂：酶标记的抗体或抗原 酶标物特点：免疫学活性、酶对底物的催化活性
原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应，酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析
常用酶：
1）辣根过氧化物酶（HRP） ELISA中应用最为广泛的标记用酶
糖蛋白（主酶）、亚铁血红素（辅基）、主酶与酶活性无关、辅基是酶的活性中心
HRP的底物：H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高，供氢体DH2习惯上被称为底物、四甲基联苯胺 TMB、邻苯二胺 OPD、5-氨基水杨酸5-ASA
TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。
OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。
2）碱性磷酸酶（AP）
底物：对-硝基苯磷酸酯（pNPP ）、经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。
3）β–半乳糖苷酶（β-Gal）用于均相酶免疫测定
底物：4MUG、酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。
一、酶标记抗体或抗原
制备方法 1过碘酸钠法（直接法）：常用于HRP标记抗体或抗原 2戊二醛交联法
二、固相载体
固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法 包被coating：将抗原或抗体结合于固相载体
封闭blocking：用牛血清白蛋白或小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附
均相酶免疫测定 用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定
原理：酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。
酶放大免疫测定技术EMIT、克隆酶供体免疫分析 CEDIA
非均相酶免疫测定 与均相不同之处：需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定、固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定
基本原理 包被、反应：加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体、洗涤：使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离、底物显色：定性或定量的分析
三个必要试剂：固相的抗原或抗体、酶标记物（酶结合物）、酶反应的底物
ELISA检测抗原的方法：
1）双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定、乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等
2）竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。
应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）
ELISA检测抗体的方法
1）双抗原夹心法应用：乙型肝炎表面抗体
2）竞争法应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测
3）捕获法应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体、甲型肝炎HAV-IgM抗体、乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
原理：抗人IgMμ链抗体包被、捕获待测标本中IgM类抗体、加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体、底物显色
1）直接化学发光剂：在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。
1. 吖啶酯：在,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物 N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。
2．三联吡啶钌：三联吡啶钌 [RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。
2） 酶促反应发光剂：是利用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂 1．鲁米诺及其衍生物（HRP）2．AMPPD(ALP)
发光剂的标记技术：1碳二亚胺（EDC）缩合2过碘酸钠氧化3重氮盐偶联4 N-羟基琥珀酰亚胺活化法
直接化学发光免疫分析：用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。
化学发光酶免疫分析（CLEIA）：用参与催化化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原/抗体，与待测标本相应的抗原(抗体)发生免疫反应，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，洗涤，加入底物(发光剂)，酶催化分解底物发光
电化学发光免疫分析（ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，三丙胺(TPA)为电子供体，在电场因电子转移而发生特异性化学发光反应，包括电化学和化学发光两过程。
临床应用：甲状腺激素、生殖激素、垂体激素和皮质激素、贫血因子、肿瘤标志物、感染性疾病、糖尿病、胰岛素、血清C-肽、血浆胰高糖素等、心脏标志物、病毒标记物、过敏性疾病、治疗药物监测
荧光
选择激发光波长在最接近于荧光物质的最大吸收峰处，而测定荧光波长设在接近于最大发射光波峰时，可得到最高的荧光效率。
荧光淬灭：荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退。是由于激发态电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。
荧光物质：是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。 异硫氰酸荧光素 (FITC)（应用最广泛）
荧光抗体技术FAT
基本原理：荧光素标记抗体与切片中组织/细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。 抗体要求：高特异性、高亲和力、经纯化提取IgG (抗血清)
标记原理：利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 搅拌法、透析法
去除游离荧光素：透析或凝胶过滤（如G50）
去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法（收集中间段）
去除非特异反应抗体：动物肝粉吸收(最好是与试验标本同种的动物脏器)
荧光抗体的鉴定：荧光素与蛋白结合比率
直接法：荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。
间接法：特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。 双标记法：两种荧光素标记两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。
特异荧光强度“++”以上判定为阳性，阴性对照应呈“-”或“±”。根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
非均相荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定
均相荧光免疫测定：荧光偏振免疫测定
时间分辨荧光免疫测定
基本原理：自发荧光寿命短:1ns～10ns，镧系元素寿命长:10μs～1000μs，短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光（可有效降低本底荧光的干扰）。stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差。Stokes位移小，激发光谱和发射光谱常有重叠，相互干扰，影响检测结果的准确性。镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠。发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少。激发光谱带较宽：300nm～350nm，有利于增加激发能，提高灵敏度。比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量。镧系元素离子在游离状态下，荧光信号很弱，只有与适当螯合剂形成螯合物后，可使荧光得到增强，而螯合物的荧光寿命与形成螯合物的配位体有关。
双抗体夹心法：固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。
固相抗体竞争法：待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。
固相抗原竞争法：待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。
荧光偏振免疫测定
基本原理：FPIA是利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素（常用FITC）标记抗原与其抗原-抗体复合物之间荧光偏振强度的差异，测定体液中小分子物质的含量。
抗原抗体竞争反应：AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱、AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强、若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱、待检抗原含量与偏振荧光强度成反比
荧光酶免疫测定
基本原理：碱性磷酸酶标记抗体或抗原，固相载体包被抗原或抗体，酶分解4-MUP，脱磷酸根基团形成4-MU，360nm激发光照射，发出450nm荧光。
荧光抗体技术的应用
①自身抗体检测②病原体检测③免疫病理检测④细胞表面抗原和受体检测⑤特殊应用：流式细胞分析 时间分辨荧光免疫测定：蛋白质、激素、药物、肿瘤标记物、病原体抗原/抗体等 荧光偏振免疫测定：药物、维生素、激素、常规生化项目等
荧光酶免疫测定：病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿瘤标志物等
補體
补体：具酶样活性、不耐热的糖蛋白，其存在与抗原性异物的刺激无关，在正常人血清中含
量相对稳定，某些疾病时，含量及其活性可发生改变。可将其分为： 补体固有成分、补体调节蛋白、补体受体
补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，称为CH50，应用绵羊红细胞（SRBC）和其相应的抗体（溶血素），作为能诱导补体活化经典途径的指示物和激活剂。补体能使溶血素特异性结合的绵羊红细胞溶解。在适当、稳定的反应系统中，溶血反应与补体的剂量依赖关系呈现“S”形曲线。在轻微溶血和接近完全溶血时，补体量的变化对溶血程度的影响不大，即溶血对补体量的依赖不敏感。但在30％～70%溶血时，补体含量仅出现较小的变动，溶血程度也会发生较大的改变
CH50增高见于：急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等
CH50降低见于：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎 、急性肾小球肾炎
单个补体成分的测定
免疫溶血法：根据补体参与抗体介导溶细胞作用的级联效应特征建立的单一补体成分检测。指示:以SRBC-抗SRBC为激活物和指示系统。参照:以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照。结果:有溶血发生，表明待检标本存在参照血清所缺乏的补体成分，溶血程度与此补体成分量呈正比，以50％溶血为终点。 免疫化学法 比浊法原理：借助补体的抗原性和与相应抗体反应的前带现象建立的补体单个成分定量检测法。比浊法不足：必需以过量的某种补体相应抗体为保证
补体结合试验CFT：
将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应系统中抗原或抗体的传统方法。
反应系统：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）、补体系统、指示系统：SRBC与相应溶血素。试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞SRBCS
反应分两步进行：第一步:反应系统与补体的作用 第二步:指示系统利用剩余补体的反应 不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性 由于该试验基于指示和试验两对抗原抗体系统竞争补体，因此，补体必须恒量，且以满足指示系统的溶血为度，过多会导致假阴性，而过少则引起假阳性。 对补体进行滴定和确定其用量，以能产生完全溶血的最少补体用量为1个实用单位，正式试验时使用2个实用单位
1．免疫相关性疾病：如自身免疫性疾病时，C1、C2、C3、C4和Hf等缺陷；超敏反应时（III型超敏反应），C3a、C5a等过敏毒素的产生。
2．与补体有关的遗传性疾病：①C2、C3缺陷导致的严重感染；②与C1抑制物缺陷相关的遗传性血管神经性水肿③SLE患者出现的细胞表面CR1缺陷与C1C清除障碍④涉及I因子、H因子缺陷的肾小球肾炎；⑤DAF缺陷引起的阵发性血红蛋白尿；⑥C1q缺陷表现的严重顽固性皮肤损害，以及C1q、C1r、C4、C2缺陷造成的免疫复合物性血管炎（包括肾炎）等。
3．补体含量显著降低的疾病：①消耗增多:免疫复合物形成导致的补体活化和消耗增多.如SLE.②补体的大量丢失:主要见于大面积烧伤、失血及肾脏病患者③补体合成不足:常见于肝脏疾病患者或营养不良的病人。
生物素-亲合素放大技术
生物素：维生素H，动、植物组织中广泛分布,卵黄和肝含量高。I环为咪唑酮环，可与亲合素结合、Ⅱ环为噻吩环，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构。侧链的末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团衍生物－活化生物素，易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。长臂活化生物素（BCNHS）：减小空间位阻 标记蛋白质醛基的活化生物素：生物素酰肼(BHZ)、肼化生物胞素(BCHZ)
标记蛋白质巯基的活化生物素：马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)
标记核酸的活化生物素：光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸如Bio-dUTP、BNHS和BHZ
亲合素(AV) 和链霉亲合素(SA)是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。
SA表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合远低于AV，因此目前以SA标记的酶结合物更为常用。
生物素-亲合素系统(BAS)特点：灵敏度高:生物素标记蛋白具有多价性，且标记后的抗原/抗体生物活性不变，每个亲合素有四个生物素结合部位、稳定性高和特异性强、适用性广泛
生物素-亲合素系统的应用
生物素-亲合素系统基本类型及原理：BAB法、BA法，也称标记亲合素-生物素法（LAB）、ABC法 BAS在ELISA中的应用 ：BAS用于固相化抗原/抗体的制备、BAS用于ELISA的终反应放大 BAS在均相酶免疫测定中的应用
BAS用于荧光抗体技术可明显提高方法的灵敏度和特异性，通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）；也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体的夹心法。 BAS用于时间分辨荧光免疫分析也可以将反应信号放大。
小 结： 二种基本类型：以游离亲合素为中间物，分别连接包含生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素的BAB法或ABC技术；另一类是直接用标记亲合素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法或LAB。无论采用酶、荧光素或发光物作为检测示踪剂，均是待测抗原与生物素化抗体反应形成复合物后，再利用生物素与亲合素间的多价放大结合特性，或直接与标有示踪剂的生物素结合（BA、LAB法），或依次与亲合素（链霉亲合素）、生物素示踪标记物反应连接成聚合物（BAB、ABC法），最终使待测反应信号被放大，提高检测方法的灵敏度。
固相膜免疫测定
固相膜的特点:多孔性(毛细管作用),非共价键高度吸附抗体或抗原(高度敏感性),易于漂洗(操作简便) 常用固相膜:玻璃纤维素膜,尼龙膜,聚偏氟乙稀(PVDF)膜,硝酸纤维素（NC）膜
免疫金标记技术:主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，用于定性或半定量快速检测。也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（IGSS） 向金溶液内加入还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶
膜固相免疫测定的特点：简便，快速、单份测定、保存期长（优质试剂）、可测定物范围广、敏感度略
低、精密度较差，质控困难、稳定性较差
1）免疫渗滤测定IFA 2）免疫层析测定（ICA ） 3）金免疫层析实验（GIFA） 4）斑点酶免疫吸附试验 （Dot-ELISA） 5）酶联免疫斑点试验（ELISPOT）：细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。 BCIP/NBT 底物孵育后， 聚偏氟乙烯（PVDF） 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子 6）Westernblot：抗原表位可能被破坏而漏检7）放射免疫沉淀试验（RIPA）：抗原表位不会破坏
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，指用标记特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的免疫检测方法。 标本制片过程由于广泛蛋白交联而使其组织的某些抗原决定簇发生遮蔽、致使免疫细胞化学信号减弱或消失等不良效应。使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，抗原修复。 常用方法：酶消化法、盐酸水解暴露抗原法、微波炉恢复抗原法、高压锅恢复抗原法、煮沸恢复抗原法
免疫荧光组织化学：采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，分辨出抗原(或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量。
荧光抗体的标记
直接法：优点：操作简便、特异性高 缺点：敏感度偏低、抗体制备麻烦
间接法：优点：较直接法灵敏，标记一种抗体可以鉴定多种抗原 缺点：非特异荧光、操作时间较长 补体法：优点：敏感度较高、标记一种抗体可以鉴定多种抗原、适用于任何动物的抗原抗体系统 非特异性荧光消除
用非免疫血清或10%牛血清白蛋白温育切片封闭非特异抗原位点、动物肝粉吸收荧光抗体中非特异性成分、层析或透析去除游离荧光素，纯化荧光抗体、将抗体的浓度调整到高稀释度、选择适合的切片方法、封固剂、镜油必须无自发荧光、用高渗盐浸洗，降低非特异性染色背景、伊文氏蓝衬染法
酶免疫组织化学：应用酶标抗体(抗原)与组织或细胞标本中的抗原(抗体)反应，催化底物产生显色反应 非标记抗体酶免疫组化染色：酶通过免疫学反应与抗酶抗体及组织抗原上的第一抗体结合，最后经酶分子催化底物的显色反应，达到对抗原的检测
酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过第二抗体作桥抗体，将结合在组织抗原上的第一抗体与第三抗体连接起来，最后形成酶联的抗原-抗体复合物
PAP法：是酶桥法的改良法。PAP法将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性(PAP复合物)
双桥PAP法：是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上。对抗原有明显放大作用
碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（APAAP）法：有些组织细胞富含内源性过氧化物酶，染色不宜使用HRP体系。用碱性磷酸酶代替HRP建立碱性磷酸酶(AP)-抗碱性磷酶(AAP)法，含有内源性HRP的组织切片:首选标记酶为AP
亲合组织化学
亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术ABC：预先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合形成可溶性的ABC复合物。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，
ABC中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合。
桥联亲合素-生物素技术BRAB：以游离亲合素作为桥联剂，利用亲合素多价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来，达到检测反应分子目的。由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物素复合物可积聚大量酶分子；加入底物后，产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。 标记生物素-抗生物素技术LAB：以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接。
葡萄球菌A蛋白法：从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，由于它能与多种动物IgG的Fc段结合，用SPA标记物（酶、荧光素、放射性物质）显示抗原与抗体结合反应。
凝集素法：凝集素是指一类从植物种子、无脊椎动物和较高等动物组织中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质，可使红细胞凝集故称凝集素。凝集素具有与特定糖基专一结合的特性，是研究肿瘤细胞膜糖分子变化的一种理想工具。凝集素法就是一方面利用凝集素可以与标记物结合，另一方面又可以与细胞膜糖基结合所形成一种亲合反应
链霉亲合素-生物素法 (LSAB）：利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合素-生物素方法
免疫电子显微镜（IEM）技术是利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密度产物，在电子显微镜下对高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的技术。
特点:定位更为精确，可定位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、组织发生等方面有其独特的
免疫细胞的分离及其表面标志检测技术
外周血单个核细胞分离
外周血单个核细胞（PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞。Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
基本原理：不同细胞密度不同、不同细胞表面生物学特性不同、不同细胞表面分化抗原不同 密度梯度离心(Ficoll)离心:（血小板、血漿）~單個核細胞~分層液~粒細胞~紅細胞
淋巴细胞分离：贴壁粘附法、吸附柱过滤法、磁铁吸引法、Percoll 分离液法— (聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒)（——连续密度梯度离心）
T细胞和B细胞的分离：E花环沉降法-T细胞有绵羊红细胞受体 、尼龙毛柱分离法-B细胞、单核细胞的粘附特性
T细胞亚群的分离 ：亲和板结合分离法、磁性微球分离法、荧光激活细胞分离仪分离法
淋巴细胞标志及亚群分类 常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（CD） 辅助性T细胞（help T cell, 细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell, ） 调节性T细胞（regulatory T cell,
B细胞表面标志
SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。
NK细胞表面标志
主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。
免疫细胞表面标志的检测：抗体致敏细胞花环法、免疫细胞化学法、免疫荧光法、流式细胞分析法 淋巴细胞表面标志检测的临床意义 ：淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。 对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。
淋巴细胞的功能检测
体内实验主要间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定 T细胞功能检测
非特异性刺激物：植物血凝素(PHA) -------T细胞、刀豆素A(ConA) -------T细胞、美洲商陆(PWM) -------T、 B细胞、脂多糖(LPS) ------- B细胞 特异性刺激物：异种抗原、同种组织抗原
B细胞功能检测
B细胞增殖能力的试验、溶血空斑试验、B细胞抗体形成功能的检测、体内试验
B细胞增殖能力的试验
抗IgM、细菌脂多糖、SAC的SPA~B增值~形态学、3H－TdR掺入法
溶血空斑试验
IgG+Ab~~活化补体 溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响、评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。
B细胞抗体形成功能的检测——酶联免疫斑点法
包被抗原刺激细胞产生抗体，形成抗原抗体复合物，加梅标二抗显色
NK细胞活性测定：常用靶细胞: K562细胞株
吞噬细胞功能检测技术 中性粒细胞、巨噬细胞 趋化、吞噬、胞内杀灭作用 中性粒细胞功能的检测
1.细胞趋化功能的检测：滤膜渗透法（Boyden 小室法）、琼脂糖平板法
2.吞噬和杀菌功能测定：显微镜检查法、溶菌法、NBT还原试验
巨噬细胞功能检测 (一)炭粒廓清试验 (二)吞噬功能检测：巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。
细胞因子 是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。
细胞粘附因子 是介导细胞间及细胞与细胞外基质间粘附作用的分子，其化学本质为糖蛋白，可以细胞膜表面表达和可溶性两种形式存在。
1.基于DNA检测的分子生物学测定法：DNA扩增法、RNA印迹法、原位杂交法、核酸酶保护分析 2.生物活性测定法
促进细胞增殖和增殖抑制测定法：以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。
直接计数法、细胞代谢活性测定方法 ：3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比色法
细胞代谢产物测定法：代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标记或可溶性分子测定法
1) 放射性核素掺入法：通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。
2) MTT 比色法 ：不使用放射性核素，以细胞代谢变化为增殖指征--MTT-甲臢结晶指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关
细胞毒活性测定法：待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。死细胞数、51Cr释放量越高或比色测定的吸光值越低，表明待测细胞因子的细胞毒活性则越高。 常用于TNF等的测定
抗病毒活性测定法：常用于IFN等的测定，IFN可诱导细胞产生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保护细胞不受病毒感染，产生细胞病变效应（CPE）。
趋化活性测定法
趋化性：诱导细胞向由趋化因子低浓度出向趋化因子高浓度处作定向移动的特性,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。 化学增活性：细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性,可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。
免疫学测定法：细胞因子(或受体)与相应的特异性抗体( 单克隆抗体或多克隆抗体)结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子(或受体)的水平。
ELISA法：是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISA的基本步骤，可作定性或定量分析。ELISA法不仅可以用于细胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的测定
流式细胞分析法：基于荧光抗体染色技术，并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测1．分离和培养待检细胞 2．细胞固定 3．封闭非特异性结合位点 4．染色与分析
酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot) ：在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同ELISA，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。
细胞因子的测定主要应用于：特定疾病的辅助诊断、机体免疫状态的评估、临床疾病治疗效果的监测和指导用药、疾病预防
细胞因子的联合检测意义：细胞因子具有网络调节的状调节的特点、级联效应或相互抑制作用的网络系统。有助于提供有效的疾病诊断和机体免疫状态信息 举例：T细胞、巨噬细胞和上皮样细胞分泌相应细胞因子的功能：IL-1、 IL-2、IFN-γ和GM-CSF、Th1/Th2细胞平衡状态：IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ
体液免疫球蛋白测定
血清IgG、IgA、IgM 测定
IgA分为血清型和分泌型，是参与黏膜局部免疫的主要抗体，主要存在于胃肠道和支气管分泌液、初乳、唾液和泪液中。
疫应答中最早出现的抗体。
测定方法：单向环状免疫扩散法、免疫浊度法 原理、误差主要原因、评价
血清IgG、IgA、IgM测定的临床意义
低Ig血症:先天性低Ig血症（免疫缺陷病）；获得性低Ig血症(蛋白丢失).
高Ig血症:多克隆Ig增高（感染）；单克隆Ig增高（免疫增殖病）
血清IgD、IgE测定
正常人血清中IgD含量很低，膜结合型IgD(mIgD)构成BCR，是B细胞分化发育成熟的标志。
起I型超敏反应；与机体抗寄生虫免疫也可能有关。
IgD测定方法：放射免疫分析法、化学发光免疫分析法、免疫比浊法、酶联免疫吸附法 IgD：增高：类风湿性关节炎、变态反应性疾病、 败血症、新生儿溶血病
总IgE测定：放射免疫分析法、化学发光免疫分析法、免疫比浊法、酶联免疫吸附法 特异性IgE测定：免疫斑点法、酶联免疫吸附法
IgE增高：变态反应性疾病、寄生虫感染、病毒感染、自身免疫性疾病。
尿液及脑脊液Ig测定
生理情况下，Ig根据其分子量大小，通过血脑屏障的难易度不同，IgG、IgA、IgM在脑脊液中的浓度递减。 尿液：肾小球滤膜受损程度：选择性蛋白尿指数 增高有临床意义：肾病、免疫增殖病，可根据尿内Ig增高的类型帮助鉴别诊断肾小球疾病的种类
血清IgG亚类测定及临床意义
Ig亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，其含量依次下降
测定方法：单向免疫扩散法、免疫比浊法（常用）、放射免疫分析法、酶联免疫吸附法 临床意义：IgG亚类的含量随年龄的不同而变化免疫缺陷病降低明显
M蛋白测定及临床意义
M蛋白：B淋巴细胞或浆细胞单克隆异常增殖产生的异常单克隆免疫球蛋白
临床上多见于多发性骨髓瘤、高丙种球蛋白血症、恶性淋巴瘤、重链病、轻链病
蛋白区带电泳（经典方法，计算蛋白含量和百分比）、免疫比浊法（免疫球蛋白定量、准确性高、快速）、免疫电泳（M蛋白分型）、免疫固定电泳（M蛋白分型及鉴定，分辨率高） 本周蛋白的检测 样本：尿液 方法：免疫电泳、加热沉淀（简便易行）
κ–Ig和λ-Ig定量检测 样本：尿液、血液 单向免疫扩散法、免疫比浊法（准确、快速）应用：M蛋白血症的分型及鉴定
冷球蛋白：在低温下发生沉淀，加温后又复溶的免疫球蛋白在低温时产生冷沉淀的机制尚不十分明确多数冷球蛋白为免疫复合物，其抗原可以是外源 性的，也可以是内源性的 冷球蛋白的类型及临床意义
I型：为单克隆冷球蛋白型，占25%～40%;多见于免疫增生性疾病
Ⅱ型：单克隆和多克隆混合型冷球蛋白，占15%～25%;多见于自身免疫性疾病
Ш型：多克隆混合型冷球蛋白，约占50% ;多见于自身免疫性疾病以及感染性疾病
免疫球蛋白是由浆细胞所产生能与相应抗原特异性结合的球蛋白，分为IgG 、IgA、IgM、IgE和IgD五类，其相应重链分别称为γ链、α链、μ链、δ链和ε链，轻链分为κ型和λ型，两型轻链无功能差异 选择性蛋白尿指数来评估肾小球滤过膜破坏程度及观察治疗和预后效果；测定尿液免疫球蛋白含量，来对肾小球疾病类型鉴别。
测定脑脊液蛋白质，对判断CSF中蛋白质的来源，区分中枢神经系统疾病类别有着重要意义。临床上常通过白蛋白商值和脑脊液免疫球蛋白指数来反映血脑屏障受损程度。 血清IgG亚类测定对研究免疫缺陷病和超敏反应性疾病有重要价值。
免疫自动化仪器分析
检测用抗体必须具有高特异性和高亲和力，通常采用磁性微球作为固相载体，增加反应面积，最常使用生物素-亲和素包被、酶-发光底物、酶-荧光底物、元素-化学发光和元素-荧光等放大抗原抗体的反应信号，结合计算机软件系统自动处理分析信号及数据转换
检测原理：自动免疫比浊分析、化学发光免疫分析、荧光免疫分析
散射免疫比浊法
原理：一定波长光沿水平轴照射，遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射发生偏转，光线偏转角度与发射光波长、抗原抗体复合物大小和多少相关。待测抗原越多，形成的复合物越多，散射光强度越强。 ：散射比浊法，颗粒直径<<入射光的波长，散射光的分布比较均匀
Heidelberger曲线：抗体量恒定，抗原抗体复合物↑散射信号响应值↑达到高峰时，抗原抗体复合物开始溶解，散射比浊中一定要抗体过量，测量时段是抗原抗体反应的上升支 定时散射比浊法 两步检测：预反应阶段：加入少量样本与抗体反应并测定第一次散射光信号值、反应阶段：加入全量样本，约反应2分钟后进行第二次测定信号值 抗体要过量，检测范围预置大、对抗原过量进行阈值限定 速率散射比浊：将各单位时间内抗原-抗体形成复合物的速率及复合物颗粒产生的散射信号连接。特點：测定单位时间内抗原-抗体反应复合物形成的最快时间段的信号值、不测定抗原-抗体复合物最大量及最稳定期的信号值、抗原过量检测
免疫透射比浊
原理：测定一定体积的溶液通过的光线量（光通量），当光线通过时，由于溶液中存在抗原-抗体复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光的减少，测定光通量和抗原抗体复合物的量成反比。
影响免疫比浊的因素：1.抗原抗体比例。抗原抗体比例对复合物的数量和颗粒大小关系极大，当抗体>抗原时成正相关，当抗体<抗原时成负相关2.抗体纯度和效价。3.增聚剂。在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，如3-4％的聚乙二醇等，利用其破坏抗原抗体的水化层，促进其靠近反应，但如浓度不适合，高了会影响其它溶质或产生非特异性聚集影响结果。
发光免疫技术 常用发光底物：氨基苯二酰肼类（鲁米诺及异鲁米诺衍生物）、吖啶酯类、电化学发光 （ECL）{三联吡啶钌、三丙胺（TPA）}
化学发光免疫分析类型
化学发光免疫分析（CLIA）{吖啶酯类}、化学发光酶免疫分析（CLEIA）{HRP标记Ag/Ab，以鲁米诺类作发光底物}、微粒子化学发光免疫分析（MLIA）{ALP标记Ag/Ab，三氧乙烷作发光底物}、电化学发光免疫分析（ECLIA）{三联吡啶钌NHS酯在电极表面反应}
吖啶酯类标记的优点：1.氧化反应不需催化剂，只要在碱性环境中就可进行2.在氧化反应过程中，结合物被分解，因此游离的吖啶酯的发光不受抑制。3.试剂稳定性好。
酶联发光免疫分析仪
用参与催化某一化学发光或荧光反应的酶来标记抗原或抗体，在抗原抗体反应后，加入底物(发光剂)，由酶催化和分解底物发光，通过光信号的强弱进行被测物定量。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶(ALP)，常用的发光底物有鲁米诺、AMPPD和4-MUP
微粒子化学发光免疫分析：以顺磁性微珠包被抗体，在磁力作用下捕捉抗原，与ALP标记的二抗形成双抗体夹心复合物，抗原抗体包被的微粒子直径只有0.5u,表面多孔,从而大大增大反应的表面积,提高了反
应的灵敏度,缩短了反应的时间。微粒子具有很好的亲水性，比重与水相仿，悬浮性极佳。微粒子可与玻璃纤维不可逆结合，从而提高了反应的特异性。
电化学发光免疫测定ECLI
第一步：三联吡啶钌标记抗体和吸附在磁性微球上的固相抗体与标本中的抗原反应，形成夹心的抗体-抗原-抗体复合物。
第二步：将反应液输入特殊的检测仪器的反应室中，随即用含三丙胺（TPA）的缓冲液冲洗。反应室下有磁铁，含磁性微球的夹心复合物及游离的固相抗体被吸附在电极表面，游离的标记抗体随洗液洗去，此后，反应室中即发生电化学发光反应
ECLI的优点：标记物的再循环利用、敏感度高、线性范围宽、反应时间短、试剂稳定性好
荧光免疫自动化分析
常用类型：时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫测定、荧光酶免疫分析
时间分辨荧光免疫测定TRFIA：利用镧系元素铕螯合物被激活后产生的特异荧光比一般荧光长，寿命短的非特异本底荧光衰退后再测定长寿命的阳性荧光信号。
荧光偏振免疫分析仪FPIA：为一种均相荧光免疫测定方法，其利用荧光物质在溶液中被单一平面的偏振光照射后，可吸收光能而产生另一单一平面的偏振发射荧光，该荧光强度与荧光 标记物质在溶液中旋转的速度与分子大小呈反比，常采用抗原-抗体竞争反应原理，适用于小分子半抗原（如药物浓度）的检测。
自动化免疫比浊分析技术FPIA
采用均相竞争法，形成三种物质，标记抗原-抗体复合物，分子量大，偏振光强，待测抗原-抗体复合物，游离标记抗原，分子量小，偏振荧光弱。偏振荧光强度与待测抗原浓度成反比
TRFIA：蛋白质多肽类激素，肿瘤标志物，反应板集中进行，不能随机急诊检测
FPIA：临床药理分析，血/尿抗原药物浓度测定，是TDM常用方法，敏感性低于TRFIA，易受内源性荧光干扰，标本预处理去除干扰成分
离子捕捉免疫分析法ICIA 主要用于Ghb,叶酸等项目测定
反应孔中的玻璃纤维预先包被高分子四胺复合物，使纤维表面带正电，得以捕捉带负电的反应物，通过静电正负结合的原理，使反应复合物吸附在玻璃纤维上。通过抗原抗体反应的原理，并联以荧光标记物，通过连接带负电的多聚阴离子复合物，使其被吸附到带正电的纤维表面，经过一系列彻底清洗，测定荧光强度变化率，从而测定被测物质的浓度。
感染性疾病与感染免疫检测
病毒性疾病
1）HAV的传播途径(粪—口)，HAV的潜伏期(30天±2周)，免疫学检测指标：HAVAg、抗HAV总抗体、抗HAV-IgM
2）急性期与慢性期的界定,慢性指:(HBsAg和HBVDNA阳性持续6个月以上者)、急性期病毒抗原指标(HBsAg,HBeAg,,HBVDNA早期可检出)、慢性期以检出抗体为主、HBV的传播途径(血源性)
乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）：抗原的特点（最表面标志），常用检测手段（双抗体夹心ELISA、间接ELISA、中和试验验证）
抗乙型肝炎病毒表面抗原（抗-HBs）：抗体的特点（中和抗体，保护性），常用检测手段（双
抗原夹心ELISA、间接ELISA、假阳性的区分） 与HBcAg包裹于完整病毒颗粒内部不易测，抗-HBc的检出（不具保护、病毒复制的信号） 与HBeAg产生于病毒颗粒的核心，HBV复制标志，此期具传染性。HBeAg为可溶性蛋白，游离于血浆中。编码e抗原基因变异，导致HBeAg阴性。抗-HBe的检出（非中和抗体、病程转归的标志、HBeAg-抗HBe复合物）
3）HCV的传播途径（血源性），HCV具广泛嗜性，妨碍机体清除，易变异。，HCV为RNA病毒，HCV的实验室诊断—测病毒RNA、相应抗体
4）HDV为缺陷病毒与HBV同时感染（共同/联合）的特征，免疫学检测指标：抗-HDV总抗体、抗-HDV IgM型抗体
5）庚型肝炎病毒（HGV)：ssRNA+，属黄病毒科。经血源传播为主，与HBV、HCV、HDV同时或重叠感染，母-婴间垂直传播 或 性接触传播。微生物学检查：测抗-HGV，HGV-RNA
ToRCH感染：疹病毒 (HSV) 一组优生优育筛选常用检测对象
人巨细胞病毒传播途径的特点：血行传播 ①输注血液或血制品②母-婴间（垂直传播）③脏器或组织移植、唾液腺传播（人-人，水平传播）、乳汁传播（哺乳期传播）、精液传播（性接触传播）
检测直接法---病毒分离、病毒核酸检测(PCR)、病毒抗原检测(包涵体)
间接法(血清学反应)---测病毒相应抗体IgG、IgM、IgA
1. IgG(-)IgM(-) (未感染, 需排除窗口期、以及变异等)
2. IgG(-)IgM(+) (感染早期, 观察抗体转归、排除非特异性等)
3.IgG(+)IgM(-) (继往感染, 免疫功能受损的、无反应能力者等)
4.IgG(+)IgM(+) (激活感染, 再感染, 非特异性、少数高免疫状况等)
EB病毒特异性抗原
病毒潜伏感染时表达的抗原：EB病毒核抗原（EBNA）、EB病毒潜伏感染膜抗原（EBLMP） 病毒增殖感染相关抗原：EB病毒特异性抗原EB病毒早期抗原（EA）、EB病毒衣壳抗原（VCA）、EB病毒膜抗原（MA）
梅毒感染的实验室诊断
非梅毒螺旋体血清学试验：性病研究实验室试验（VDRL）、不加热血清反应素试验（USR）、快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）、甲苯胺红试验（TRUST）
梅毒螺旋体抗原血清试验：梅毒螺旋体血细胞凝集验（TPHA）、梅毒螺旋体明胶凝集实验（TPPA）、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（TP-WBA）
TPHA（RBC凝集）、TPPA（乳胶(炭)颗粒凝集）、FTA-ABS (金标准)、TP-ELISA（适宜批量且灵敏）、TP-WB（分析抗体谱易确认）
超敏反应性疾病及其免疫检测
超敏反应：机体对某些抗原初次应答致敏后，再次接触相同抗原刺激时所出现的一种以生理功能紊乱或组织细胞病理损伤为主的异常免疫应答。超敏反应又称为变态反应，引起超敏反应的抗原成为变应原 Ⅰ型超敏反应
临床特点１发生快（速发型）２由IgE介导３具有明显的个体差异和遗传背景4多为生理功能紊乱，无组
织细胞损伤 变应原(allergens)是指能够选择性诱导机体产生特异性IgE抗体的免疫应答，引起速发型变态反应的抗原物质。 参与Ⅰ型超敏反应的成分：抗原、抗体（IgE）、IgE Fc段受体（FcεR）、肥大细胞和嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞
发生机制：1）致敏阶段 无任何临床症状，一般需1-2周2）激发阶段 1.细胞活化释放生物活性介质IgE交联? FcεRⅠ的微集聚 ? 肥大细胞及嗜碱性粒细胞活化 ? 释放生物活性介质及细胞因子等；2.生物活性介质的种类和作用3）效应阶段
储存介质：组胺、激肽原酶、嗜酸性粒细胞趋化因子(ECF-A)
细胞内新合成的介质：白三烯（LTs）、前列腺素D2（PGD2）、血小板活化因子(PAF) 特异性IgE测定：常用的方法仍然是放射免疫技术和酶联免疫技术
Ⅱ型超敏反应(溶细胞型,细胞毒型)
由IgG或IgM类抗体与细胞表面的抗原结合，在补体、吞噬细胞及NK细胞等参与下，引起的以细胞裂解死亡为主的病理损伤。
参与Ⅱ型超敏反应的成分：抗原（细胞性）、抗体（调理性抗体，主要为IgG和IgM）、效应细胞和分子（补体、吞噬细胞、NK细胞）
损伤细胞机制：激活补体的经典途径、促进吞噬细胞的吞噬作用(调理作用)、ADCC作用 Ⅱ型超敏反应的常见疾病：输血反应、新生儿溶血症、自身免疫性溶血性贫血、药物过敏性血细胞减少症、血细胞减少症、链球菌感染后肾小球肾炎、肺出血—肾炎综合征(Goodpasture’s综合征)、甲状腺机能亢进(Grave病)
Ⅱ型超敏反应的特点1.产生的抗体是IgG、IgM2.抗原存在于细胞膜上3.结果是靶细胞的溶解、破坏（细胞毒型）4.有补体参与
Ⅲ型超敏反应 (免疫复合物型,血管炎型)
血液循环中的可溶性抗原与相应的抗体（IgG、IgM类）结合形成可溶性的免疫复合物，在一定条件下沉积于组织，通过激活补体并在血小板、中性粒细胞等其它细胞的参与下，引起组织损伤的过程。抗原成分在体内长期滞留（先决条件）、形成IC的大小、抗原抗体的比例、组织的解剖学及血流动力学、IC易沉积于静脉压较高的毛细血管迂回处，如肾小球基底膜及关节滑膜、肝、脾、血管等部位。影响免疫复合物沉积的其他因素
产生趋化因子（C3a、C5a、567)，吸引中性粒细胞聚集，释放溶酶体酶，引起局部组织损伤；产生过敏毒素（C3a、C5a)，使肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放组胺，加重局部水肿； IC激活血小板：使血小板凝聚，局部出现微血栓，造成局部组织缺血、出血、坏死；易沉积部位：肾小球、关节滑囊、心肌、血管壁等处。
Ⅲ型超敏反应特点1.抗体为IgG、IgM2.形成的中等大小IC（CIC）沉积在小血管壁，由肾小球基底膜引起3.有补体参与4.局部产生以中性粒细胞浸润为主的炎症。
组织损伤特点：血管扩张、渗出、中性粒细胞浸润、出血坏死及血栓为特征的血管炎
常见疾病 (一)局部免疫复合物病1.Arthus反应（马血清）2.人类局部免疫复合物病（过敏性肺炎、糖尿病人）（二）全身免疫复合物病：血清病、.链球菌感染后肾小球肾炎（免疫复合物型肾炎）、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎（变性IgG刺激机体产生抗体称为类风湿因子， IgM类）
Ⅳ型超敏反应(迟发型)
由致敏T细胞再次接触相同抗原24-72小时后发生的，形成以单个核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎症反应。1.抗原（胞内寄生菌、病毒、寄生虫和化学物质）2.效应细胞（CD4+Th1细胞和CD8+CTL、单核巨噬细胞）3.T细胞介导的炎症反应和组织损伤。CD8+CTL与靶细
胞表面相应抗原结合通过脱颗粒，释放穿孔素、颗粒酶，使靶细胞溶解、凋亡。 常见疾病1）传染性迟发型超敏反应2）接触性皮炎3）移植排斥反应4）脏器特异性自身免疫病
Ⅳ型超敏反应的特点1.由T细胞介导引起的细胞免疫过程2.无抗体、补体参与3.反应发生
1.I、Ⅱ和Ⅲ型超敏反应由抗体介导。
2.补体参与Ⅱ、Ⅲ型超敏反应，但必须依赖补体才能致病的只有Ⅲ型超敏反应。 3.同一变应原在不同个体或同一个体可引起不同类型的超敏反应。 4.在同一个体可能同时存在两种或两种以上的超敏反应 5.有时同一疾病也可由不同类型的超敏反应引起。 Ⅰ型（寻找过敏原和检测IgE）、Ⅱ型（抗血细胞抗体的检测）、Ⅲ型（检测循环免疫复合物）、Ⅳ型（局部皮试）
选择题：
1． 临床免疫的室内质量控制
A． 可以提高实验室常规工作中批内、批间样本检验的一致性 2． 免疫测定中血清样本的收集应注意下列问题，除了
A． 必须使用密闭的一次性无菌容器 3． 下述有关质控规则的论述错误的是
E．22S表示在质控测定中，有两个测定值在X±2S范围之外，则该批测定失控 4．下列哪项是室内质控所监测不到的
A．标本鉴别错误
5．Levey_Jennings质控图方法的质控规则是
D．12S，13S和22S