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毒理学实验一、 鱼的急性毒性实验
背景知识
急性毒性实验的主要目的是确定化学物质的毒性程度、剂量―反应关系，根据待测化学物质与其它已知毒性化学物质的相对毒性,推定具体的理化性质，测定其急性毒作用,以及提供毒作用模型方面的资料。此外,这种研究也能指出化学物质可能的靶器官及其特异性毒作用,并对亚慢性毒性试验研究中所用剂量提供指南。外源化合物的毒作用往往通过某一染毒持续时间的半致死量/浓度 (LD50/LC50), 或化学物质在空气中某一染毒浓度的半致死时间(LT50)，或用半数效应量 (ED50 或 (EC50) 来估计表示（注：化学物质在水中浓度对水生生物如无脊椎动物、鱼虾的死亡不易鉴别时使用）。水生生物的急性毒性试验广泛应用于水域环境污染监测工作中, 对控制工业废水的排放，保护水域环境，制定水质标准，发展水产品的生产，具有重大意义 。
受试生物的急性实验有下列四种方式进行暴露试验即静态、循环、更新、动态, 但最常用的方法是静态与动态方法。可提供下列的观测指标：①估计产生毒性作用的上限浓度，②估计不同种的水生生物对受试物的相对敏感性，③估计大量受试物的相对毒性，④估计水质对受试物毒性的影响(pH、溶解氧、盐度、硬度、悬浮物)。 ⑤得出浓度―反应关系曲线及暴露时间的意义,动态实验可提高保持令人满意的实验条件的能力, 而且没有时间的限制。因此它能给出暴露时间―反应关系比较完美的估计。水生生物的急性毒性的实验应当设计成为能得到计数标准的反应(有或无,生与死)，受试污染物浓度与暴露生物中受影响生物的百分比之间的关系，可画出浓度―死亡率曲线。急性实验结果可表示每一实验浓度中死亡或不动生物的百分比; 从观察内插法或计算中得出 LC50，或 EC50 及相应的 95% 的置信区间。
实验目的
本实验通过观察在不同受试物浓度处理下，鱼的急性中毒表现和经过，了解和基本掌握测定毒物的半数致死剂量/浓度 （LD50/LC50）的方法，了解受试物剂量和生物反应的关系及计算表示方法。
实验原理
鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，鱼类毒性试验在研究水污染及水环境质量中占重要地位。当水体中的污染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变、直至死亡。在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，实验至少进行24h，最好以96h为一个实验周期，在24 h、48 h．72h、96 h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50％时的受试物浓度。本实验将经过曝气驯化的鱼（保证其初始状态一致），放入不同浓度的重铬酸钾溶液中进行96hr的观察，记录不同浓度组6、24、48、72和96hr的鱼的死亡率，得出剂量-死亡率曲线，求出不同时间的LC50。
通过鱼类急性毒性试验可以评价受试物对水生生物可能产生的影响，以短期暴露效应表明受试物的毒害性。鱼类急性毒性试验不仅用于测定化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理的有效程度，也为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供环境依据。
实验材料与方法
1. 实验材料：
1）待测化学物：使用实验室剂---重铬酸钾溶液K2Cr2O7（Cr6+, 2000mg/L）溶液。配制一系列的浓度梯度溶液，本试验的浓度梯度为四个浓度梯度和一个空白对照，即150，100，63、39、0（mg/L）。每组三个同学，自己配制不同浓度系列的重铬酸钾溶液：
2) 实验动物：野生石纹鱼，金鱼等（从鱼市购买）：用曝气后的自来水驯养3天，补充氧气以保证溶解氧的浓度。
2. 实验条件及处理：静态方法
1） 预试验：一般用 3~5 个动物, 用对数比例形成的系列浓度, 如 0.01, 0.1, 1, 10, l00ppm, 同时做一对照（如受试物为废水, 采用体积百分比浓度, 如 0.01, 01, 1, 10, 100%) 从中寻找理想的范围.因为时间限制，本实验学生不做预试验。
2）正式试验：计算并配制重铬酸钾系列浓度的溶液，选择健康的鱼，放入不同浓度的0、39、63、100和150mg/L的重铬酸钾溶液中，每个浓度的鱼缸里加入10条鱼，设1～3个平行。
经过6，24，48，72，96小时后，在 24 h、48 h、72 h、96 h后检查受试鱼的状况。如果没有任何肉眼可见的运动，如鳃的扇动、碰触尾柄后无反应等，即可判断该鱼已死亡，观察并记录死鱼数目后，观察记录死亡鱼的数量并将死亡个体挑出。应在试验开始后6 h观察各处理组鱼的状况，并记录试验鱼的异常行为（如鱼体侧翻、失去平衡，游泳能力和呼吸能力减弱，色素沉积等）。
（理论上试验开始和结束时要测定pH、溶解氧和温度。试验期间，每天至少测定一次。至少在试验开始和结束时，测定实验容器中试验液的受试物浓度）
试验结束时，对照组的死亡率不得超过10％。
结果与讨论
1．数据处理
1） 以暴露浓度为横坐标，死亡率为纵坐标，在计算机或对数概率纸上，绘制暴露浓度对死亡率的曲线。用直线内插法或常用统计程序计算出 6 h、24 h、48 h、72 h、96 h的半致死浓度（LC50）值，并计算95％的置信限。
如果试验数据不适于计算LC50，可用不引起死亡的最高浓度和引起100％死亡的最低死亡浓度估算LC50的近似值，即这两个浓度的几何平均值。（ √Lmax*Dmin ）
2） 实验开始后24 h、48 h、72 h、96 h时的LC50的值，并进行毒性分级评价（见附录）。
3）实验报告
包括实验目的、材料、方法、步骤、结果，并对结果进行讨论。
附录 鱼类急性毒性实验毒性分级标准
鱼起始LC50（mg/L） 毒性分级
＜1 剧毒
1～100 高毒
100～1000 中等毒
1000～10000 低毒
＞10000 微毒（无毒）
第二篇：毒理学总结
第一章 绪论
一、毒理学：研究所有外源因素对生物系统（living systems）的损害作用、生物学机制（biologic mechanisms）、安全性评价（safety evaluation）与危险性分析（risk analysis）的科学。
二、三个研究领域：描述毒理学（descriptive toxicology）、机制毒理学（mechanistic ）、管理毒理学（regulatory ）
三、展望：A从高度综合到高度分化
B从整体动物实验到替代试验
C从阈剂量到基准剂量
D从构效关系到定量构效关系
E从传统毒理学到系统毒理学
F从危险度评定到危险度管理
四、毒理学实验方法：
1.动物实验。包括体内实验和体外实验，体内实验有一般毒性实验和特殊毒性实验，一般毒性实验根据染毒期限分为急性（24小时内一次或多次染毒）、亚急性（在一个月或短于一个月的重复染毒）、亚慢性（一个月至三个月的重复染毒）、慢性（三个月以上重复染毒）。*重复染毒引起毒作用的关键因素是暴露频率而非暴露期限。特殊毒性实验为致突变、致癌和致畸实验
2.人体观察
3．流行病学调查
第二章 基本概念
1.毒物：在一定条件下，以较小剂量进入机体就能干扰正常的生化过程或生理功能，引起暂时或永久性的病理改变，甚至危及生命的化学物质。毒物可分为九类
2.毒性：化学物质引起机体有害作用的固有能力。其影响因素：接触剂量、方式、途径、时间、速率、频率、物质本身的化学和物理性质
3.毒性作用：影响机体行为的生物化学改变，功能紊乱或病理损伤，或降低对外界环境应激的反应能力。又称毒效应，损害作用。
4.毒作用分类：A速发作用和迟发作用
速发作用：机体与化学毒物接触后在短时间内发现的毒效应
迟发作用：机体与化学毒物接触后，经过一定的时间间隔才表现的毒效应。
B局部与全身作用
局部作用：发生在化学毒物与机体直接接触部位处的损伤作用
全身作用：化学毒物吸收入血后，经分布过程达到体内其他器官（靶器官）所引起的毒效应。（靶器官：多数引起全身作用的化学毒物并非引起所有组织器官的损害，其作用点往往只限于一个或几个组织器官，这样的器官称靶器官）
C可逆与不可逆作用
可逆作用：停止接触化学毒物后，损伤可以逐渐恢复
不可逆作用：停止接触化学毒物后，损伤不能恢复，甚至进一步发展加重。是否可逆取决于被损伤组织的再生能力
D过敏反应（变态反应）
E特异体质反应
F高敏感性
G高耐受性
5危险度：一种物质在具体的解除条件下，对机体造成损害可能性的定量估计。一般根据化学毒物对机体造成损害的能力和与机体的可能接触的程度，以定量的概念进行估计并用预期频率表示。
6生物学标志：针对通过生物学屏障进入组织或体液的化学物质及其代谢产物、以及它们引起的生物学效应而采用的检测指标，可分为接触生物学标志、效应生物学标志和易感性生物学标志。接触生物学标志又分为体内剂量标志和生物效应剂量标志。
7给予剂量，潜在剂量：机体实际摄入、吸入或应用与皮肤的外源化学物的量。
应用剂量：直接与机体的吸收屏障接触的可供吸收的量。
内剂量：化学物质被吸收入血的量。
送达剂量：内剂量中可以到达所关注的器官组织的部分。
靶剂量、生物有效剂量：到达靶器官并与其作用的量
量反应：计量资料，有强度和性质的差别，可以某种测量数值表示。通常用于表示化学物质在个体中引起的毒效应强度的变化
质反应：计数资料，没有强度的差别，不能以具体数值表示，而只能以有无，阴阳等表示。用于表示化学物质在群体中引起的某种毒效应的发生比例。
8剂量——量反应关系：化学物质的剂量与个体中发生的量反映强度之间的关系
剂量——质反映关系：化学物质剂量与某个群体中质反应发生率之间的关系
9一、致死剂量
A绝对致死剂量LD100或LC100：化学物质引起受试对象全部死亡所需要的最低剂量或浓度 B最小致死剂量MLD或MLC：化学物质引起受试对象中的个别成员出现死亡的剂量
C最大耐受剂量LD0或LC0：化学物质不引起受试对象出现死亡的最高剂量
D半数致死剂量LD50或LC50：化学物质引起一半受试对象出现死亡所需的剂量，是评价化学物质急性毒性大小最重要的参数，也是对不同化学物质进行急性毒性分级的基础标准。化学物质的急性毒性越大，LD50的数值越小。为生物学参数，受多种因素影响，如动物敏感性、接触途径、性别、实验室环境、喂饲条件、染毒时间、受试物浓度、溶剂性质、实验者操作技术的熟练程度等。
E观察到损害作用的最低剂量LOAEL：在规定的暴露条件下，通过实验和观察，一种物质引起机体某种有害作用的最低剂量或浓度。
F未观察到损害作用的剂量NOAEL：在规定的暴露条件下，通过实验和观察，一种外源化学物不引起机体可检测到的有害作用的最高剂量或浓度。
G未观察到作用水平NOEL:??与适当的对照机体比较，一种物质不引起机体任何作用（有害作用或非有害作用）的最高剂量或浓度。
10安全限值：为保护人群健康，对生活和生产环境和各种介质（空气、土壤、水、食品等）中与人群身体健康有关的各种因素（化学、物理和生物）所规定的浓度和暴露时间的限制性量值。
每日容许摄入量ADI
最高容许浓度MAC
11参考剂量reference dose RfD
用于非致癌物质的危险度评价，为环境介质中化学物质的日平均接触剂量的估计值。人群（包括敏感亚群）在终身接触该剂量水平化学物质的条件下，预期一生中发生费致癌或非致突变有害效应的危险度可低至不能检出的程度。
12毒作用带（表示化学物毒作用的特点的参数）P31
急性毒作用带：
慢性毒作用带：
第三章 生物转运和生物转化
ADME机体对外源化学物质的处置过程：吸收、分布、代谢、排泄(absorption、distribution、metabolism、
excretion)
生物转运：biotransportation外源化学物穿过生物膜的过程，其本身的结构和性质不发生变化
生物转化biotransfomation：化学物进入机体后，经过一系列酶的催化，形成一些分解产物或衍生物的过程
生物转运方式：主动转运、被动转运（简单扩散、易化扩散、滤过）、膜动转运（胞吞、胞饮、胞吐） 影响生物转运的因素：化学物质本身的结构、分子量大小、脂/水分配系数的大小、带电性、与内源物质的相似性等。
脂/水分配系数：化学物在含有脂和水的体系中，在分配达到平衡是在脂相和水相的溶解度比值。 吸收：外源化学物从接触部位，通常是机体的外表表面或内表面的生物膜转运至血循环的过程。
一、 经胃肠道吸收 特点或影响因素：非解离状态、简单扩散、酸碱度、胃肠蠕动、内容物的质和量、
肠内菌群的影响等。
二、 经呼吸道 血/气分配系数：气体在呼吸膜两侧的分压达到动态平衡时，在血液内的浓度与在空气
中浓度之比
三、 经皮肤 角质层为限速屏障 通透性：阴囊＞腹部＞额部＞手掌＞足底
分布：外源化学物吸收进入血液或淋巴液后，随体循环分散到全身组织器官的过程
对不同器官的分布不均匀，原因：组织器官的血流量和化学物质亲和力
蓄积accumulation：外源化学物以相对较高的浓度富集于某些组织器官的现象
主要贮存库：血浆蛋白、肝和肾、脂肪及骨骼
特殊屏障：血脑屏障、胎盘屏障
排泄：外源化学物及其代谢产物向机体外转运的过程
方式：尿液、粪便、肺脏、汗腺、乳汁
生物转化：外源化学物在机体内经多种酶催化的代谢转化。主要器官为肝脏，其他有肾脏、小肠、肺脏和皮肤等。亚细胞水平在内质网（微粒体）或胞浆，在线粒体、细胞核及溶酶体则较少分布。意义为：水溶性增加、毒性降低
微粒体microsome：组织经细胞匀浆和差速离心后，内质网形成的囊泡和碎片，而非独立的细胞器 代谢解毒metabolic detoxication：经生物转化大部分外源性化学物的代谢产物，毒性降低，易于排出体外，此为解毒反应
代谢活化metabolic activation：经生物转化其毒性被增强的现象。生成亲电子剂、自由基、亲核剂、氧还原剂
生物转化酶的基本特征：底物特异性广泛、多态性、立体选择性、有结构酶和诱导酶之分
Ⅰ相反应：经过氧化、还原和水解等反应使外源化学物暴露或产生极性基团，如羟基，氨基，巯基，羧基等，水溶性增高并成为适合于Ⅱ相反应的底物
一、氧化反应
A细胞色素P-450酶系
B微粒体含黄素单加氧酶（FMO）
C醇、醛、酮氧化-还原系统和胺氧化
D过氧化物酶依赖性的共氧化反应
二、还原反应
A羧基还原反应
B含氮基团还原反应
C含硫基团还原反应
D醌还原反应
E脱卤反应
四、 水解反应
A酯酶和酰胺酶
B肽酶
C环氧水化酶
Ⅱ相反应：具有一定极性的外源化学物与内源性辅因子（结合基团）进行化学结合的反应。包括葡萄糖醛酸化、硫酸化、乙酰化、甲基化，与谷胱甘肽结合以及与氨基酸结合。水溶性明显增高。
影响外源化学物生物转化的因素：遗传因素和环境因素（代谢酶的遗传多态性，诱导与遏制，抑制与激活）
第四章 毒作用机制
多数毒物发挥其对机体的毒性作用至少经历4个过程：①经吸收进入机体的毒物通过多种屏障转运至一个或多个靶部位；②进入靶部位的终毒物与内源靶分子发生交互作用；③毒物引起机体分子、细胞和组织水平功能和结构的紊乱；④机体启动不同水平的修复机制应对毒物对机体的作用，当机体修复功能低下或毒物引起的功能和结构紊乱超过机体的修复能力时，机体即出现组织坏死、癌症和纤维化等毒性损害。（①吸收转运分布；②与靶分子的相互作用/改变器官细胞的生理环境；③细胞功能结构障碍；④修复无能）
毒物的ADME过程与靶器官 毒效应的强度取决于终毒物在其作用靶部位的浓度和持续时间。
终毒物是指与内源靶分子（如受体、酶、DNA、微丝蛋白、脂质）反应或严重地改变生物学（微）环境、启动结构和（或）功能而表现出毒性的化学物。
从接触部位进入血液循环：毒物从接触部位进入血液循环的过程，称为毒物的吸收；毒物从暴露部位转运到体循环的过程中可能被消除（胃肠道，肝脏和肺）。
从血液循环进入靶部位：毒物离开血液循环进入细胞外间隙并进入细胞，经cap内皮经水相细胞间隙和穿细胞孔道（细胞窗孔）和（或）穿越细胞膜而扩散，影响毒物分布的主要因素有脂溶性、分子大小与形状、电离度。促进毒物分部到靶部位的机制（cap内皮的多孔性、专一化的膜转运、细胞器内的蓄积、
可逆性细胞内结合）；妨碍毒物分部到靶部位的机制（血浆蛋白结合、专一化屏障、贮存部位的分布、与细胞内结合蛋白结合、从细胞内排出）；排泄与重吸收（排泄是指外源化学物及其代谢产物从血液中消除并返回外界环境的过程，排泄时消除毒物的物理机制，而生物转化是消除毒物的化学机制。肾、肝） 增毒：一些毒物的毒性主要是由于其代谢物引起，生物转化为有害产物的过程称为增毒（toxication）或代谢活化（metabolic activation）。
终毒物主要分为4类：亲电子剂、自由基、亲核物、氧化还原性反应物。
①亲电子剂：含有一个缺电子原子的分子，带部分或全部正电荷，使其容易与亲核物中的富含电子原子共享电子对而发生反应。
②自由基：在其外层轨道中含有一个或多个不成对电子或分子片段。由于化合物的共价键发生均裂、或接受一个电子、丢失一个电子而产生。顺磁性、化学性质十分活泼、反应性极高、作用半径短而半减期极短。
从还原酶接受一个电子后形成自由基：（百枯草）进一步将额外电子转移给分子氧并生成超氧阴离子自由基（O2-.），其自身重新形成原型化学物（氧化还原循环）（氧化应激，氧中心自由基，这类自由基持续不断地在机体内产生，内源/外源，产生超出了清除能力）
亲核外源化学物在过氧化酶催化作用下丢失一个电子形成
电子向分子转移引起的还原性键均裂过程也可形成自由基
③亲核物：少见 苦杏仁——氰化物
④活性氧化还原反应物：引起高铁血红蛋白的亚硝酸盐??
解毒：排除终毒物或阻止其形成的生物转化过程成为解毒。解毒可以几种途径进行，取决于有毒物质的化学特征。某些情况下，解读过程与代谢活化过程竞争同一外源化学物。
①无功能基团毒物的解毒：无功能基团的化学物如苯、甲苯以两相方式解毒
②亲核物的解毒：通过在亲核功能基团上的结合反应来解毒
③亲电子剂的解毒：一般是与巯基亲核物谷胱甘肽结合而解毒。这种反应可自发地发生，也可由谷胱甘肽－S－转移酶催化。金属离子如Ag+、Cd2+、Hg2+和CH3Hg+易于与谷胱甘肽反应并通过谷胱甘肽来解毒。
④自由基的解毒：机体虽有多种途径产生自由基，但并不是自由基产生即对机体有损害作用。自由基产生只有超过抗氧化能力或机体抗氧化能力降低时，才会造成损害作用。这是因为机体有相应的防御系统，包括非酶性和酶性抗氧化系统。
清除O2-.是一种重要的解毒机制，依赖于超氧物歧化酶（SOD）的作用。没有一种酶能有效清除HO.。预防HO.毒作用的最有效方法是阻止其生成。ONOO-解毒：清除两种ONOO-前体（O2-.和NO.）、阻止ONOO -生成是预防ONOO -毒性作用的有效机制。谷胱甘肽在亲电子剂和自由基的解读过程中起重要作用。
⑤蛋白质毒素的解毒：细胞外和细胞内的蛋白酶参与有毒多肽的失活作用。硫氧还蛋白
⑥解毒过程失效：解毒能力耗竭、解毒酶失活、某些结合反应可被逆转、解毒过程有时产生潜在有害副产物。
靶分子的反应：实际上所有的内源化合物都是毒物潜在的靶标，然而毒理学上相关的靶标是大分子，如核酸（特别是DNA）和蛋白质。在小分子中，膜脂质最为常见，此外，辅因子如辅酶A和砒哆醛也被涉及。并非所有化学物与靶分子的结合都发生毒性效应。
终毒物与靶分子的交互作用触发毒性效应需考虑以下一个方面：靶分子的属性；终毒物与靶分子之间反应的类型；毒物对靶分子的效应。最后，一些并非直接由终毒物与靶分子反应所启动，而是由于生物学微环境改变所引起的毒性。
反应的类型：
①非共价结合：非共价结合可能是通过非极性交互作用或氢键与离子键的形成，具有代表性的是毒物与膜受体、细胞内受体、离子通道以及某些酶等靶分子的交互作用。
②共价结合：化学毒物与细胞大分子的共价结合指化学毒物或其具有活性的代谢产物与机体的一些重要大分子发生共价结合，从而改变核酸、蛋白质、酶、膜脂质等生物大分子的化学结构与其生物学功能。
不可逆
加合物：指活性化学物与细胞大分子之间通过共价键形成的稳定复合物。为重要的生物标志物之一。共价加合物的形成常见于亲电毒物，如非离子和阳离子亲电物以及自由基阳离子。③去氢反应：自由基可迅速从内源化合物去除氢原子，将这些化合物转变为自由基。从巯基化合物（R-SH）去除氢形成巯基自由基（R-S），这种自由基是其他巯基氧化产物如次磺酸和二硫化物的前身。从脂肪酸去除氢产生脂质自由基并启动脂质过氧化。
④电子转移：化学物能将血红蛋白中的Fe2+氧化为Fe3+，形成高铁血红蛋白血症。
⑤酶促反应：少数一些毒素通过酶促反应作用于特定靶蛋白。蓖麻蛋白诱发核糖体的水解断裂，阻断蛋白质的合成。
毒物对靶分子的影响：
①靶分子功能失调：模拟内源性配体，活化靶蛋白分子；抑制靶分子的功能；对蛋白质的影响；对DNA的影响
②靶分子的破坏：除了加合物形成以外，毒物还可通过交联和断裂而使内源分子的初级结构改变。 脂质过氧化，指主要由自由基引起的多不饱和脂肪酸的氧化作用对生物膜具有强烈的破坏作用。自由基引起脂肪酸脱氢而启动脂质的过氧化降解，形成的脂质自由基经氧固化作用变为脂质过氧自由基。 毒物导致几种形式的DNA链断裂和交联。 ③新抗原形成：
细胞功能障碍与毒性：
毒物引起的细胞调节功能障碍：基因表达调节障碍（转录调节障碍；信号转导调节障碍；细胞外信号产生的调节障碍）；细胞瞬息活动的调节障碍
毒物引起的细胞维持功能改变：细胞内部维持自身功能的损害（危害细胞存活的原发性代谢紊乱：ATP耗竭；细胞内Ca2+持续升高；ROS与RNS的过度产生。原发性代谢紊乱之间的相互影响。线粒体渗透性转变及其后果，坏死、凋亡。ATP的利用度决定细胞死亡的形式。由未知机制诱发细胞死亡）；细胞外部维持的损害。
细胞内Ca2+持续升高：毒物促进Ca2+向胞浆内流或抑制Ca2+从胞浆外流而引起胞浆Ca2+水平升高。配体或电压门控Ca2+通道开放或质膜损伤均可引起细胞外液于胞浆之间Ca2+浓度梯度降低。毒物也可诱导Ca2+从线粒体或内质网漏出而增加胞浆Ca2+，也可通过抑制Ca2+转运蛋白或耗竭其驱动力而减少Ca2+的外流。细胞Ca2+的持续升高可导致：能量储备的消耗；微丝功能障碍；水解酶的活化；ROS和RNS的生成。
凋亡：细胞能量代谢、Ca2+稳态和氧化还原状态造成不良影响并最终引起细胞坏死的外源化学物也可诱发另一种形式的细胞死亡——凋亡。坏死细胞出现肿胀溶解，而凋亡细胞则出现皱缩、核和胞质物质浓缩并形成凋亡小体。细胞坏死所涉及的多种代谢紊乱是互为因果的，但在次序上是随机的。然而，凋亡过程是有序的。引起细胞凋亡的机制有3种途径：线粒体途径、死亡受体途径和内质网应激途径。 修复障碍
第五章 毒作用的影响因素
毒作用的影响因素：1化学物因素2机体因素3化学物与机体所处的环境条件4化学物的联合作用
一、 化学物因素
1化学结构：改变代谢转化类型和生化过程从而影响毒作用的性质和大小。例：取代基的影响、异构体和立体构型、同系物的碳原子数和结构的影响、分子饱和度、与营养物和内源性物质的相似性 2理化性质：对进入机体的机会和在体内的代谢转化过程有影响
例：脂水分配系数（系数大，脂溶性高，毒性小）、微粒大小（与分散度成反比）、挥发性、气态物质的血气分配系数（系数越大，越容易吸收入血）、比重、电离度和荷电性
3不纯物和化学物的稳定性
二、 机体因素
1物种间遗传学的差异
A解剖、生理差异：人比小鼠对毒物更敏感
B代谢差异：质、量
C修复能力的个体差异
2个体间遗传学的差异、
3机体的其他因素（健康状况、年龄、性别、营养条件）
三、 化学物与机体所处的环境条件
1气象条件a温度b气湿c气压
2季节或昼夜节律a某些功能活动的周期性波动b昼夜节律受体内某些调节因素所控制c给药时间/季节不同，毒性不同
3动物笼养方式
4化学物的接触特征和赋形剂a接触途径（静脉＞腹腔≧肌肉＞皮下＞皮内＞口服＞经皮）b接触时间c接触频率d溶剂或助溶剂
四、 化学物的联合作用
联合作用：同时或先后接触两种或两种以上外源化学物对机体产生的毒性效用
分类：1非交互作用：a相加作用b独立作用
2交互作用：a协同作用b加强作用c拮抗作用
相加作用：每一化学物以同样的方式、机制，作用与相同的靶器官，仅仅它们的效力不同。它们对机体产生的毒作用等于各个化学物单独对机体产生效应的算术总和。（多氯联苯PCBs和二噁英）
独立作用：化学物不相互影响彼此的毒性效应，作用的模式和作用的部位可能不同，各化学物表现出各自的毒性效应。
交互作用：两种或两种以上化学物造成比预期的相加作用更强（协同，增强）或更弱的（拮抗作用）联合效应。
协同作用：化学物对机体所产生的总毒性效应大于各个化学物单独对机体的毒性效应总和，即毒性增强。（四氯化碳和乙醇）
加强作用：一种化学物对某器官或系统并无毒性，但与另一种化学物同时或先后暴露时使其毒性效应增强。（异丙醇可以明显增强四氯化碳的肝脏毒性）
拮抗作用：化学物对机体所产生的联合毒性效应低于各个化学物单独毒性效应的总和。（例：用阿托品治疗有机磷中毒）
第六章 外源化学物的一般毒性作用
一般毒性作用也称基础毒性，是全身各系统对外源化学物的毒作用反应，与特殊毒性（致畸、致突变、致癌）相对而言。化学毒物在一定剂量下，一定接触时间、一定接触方式下，对实验动物产生综合毒效应的能力。根据接触毒物的时间长短，一般毒性作用可分为急性毒性、重复剂量毒性、亚慢性毒性和慢性毒性作用。
急性毒性作用
急性毒性：是指机体(人或实验动物)一次接触或24小时内多次接触化学物后在短期(最长到14天)内所发生的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。国内多数规范规定24小时内一般不超过3次（分次染毒）。
急性毒性实验的目的：评价化学物急性毒作用的试验，是了解和研究外源化学物对机体毒作用的第一步： ①测试和求出化学毒物对一种或几种实验动物的致死量(以LD50表示)以及其它的急性毒性参数，了解急性毒作用强度，根据LD50进行急性毒性分级。
②通过观察动物中毒表现和死亡的情况，了解急性毒作用性质、可能的靶器官和致死原因，提供化学毒物的急性中毒资料、初步评价对人体产生损害的危险性，探求化学毒物急性毒性的剂量—反应关系与中毒特征。
③为亚慢性、慢性毒性作用试验的研究及其他毒理试验提供接触剂量和观察指标的选择提供参考依据。 ④为毒理学机制研究提供线索。
急性毒性试验方法的要点
经典的急性毒性试验：
以死亡为其观察重点、概率单位法、改进寇氏法（LD50稳定较好）、霍恩（Horn法），固定剂量法、急性毒性分级法、上-下移动法，3R
(一)实验动物
[原则]：①急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的实验动物；②动物易于获得；③品系纯化；④价格较低和易于饲养等条件。
1．实验动物的种属 不同种属的动物对化学物的反应可能有很大的差别，最好用两种种属的动物，包括啮齿类和非啮齿类。实际工作中啮齿类多选用小鼠和大鼠，有些试验也可选用豚鼠或家兔，非啮齿类一般选用狗或猴。一般来说，急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔．而急性吸人毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑大鼠。
2．实验动物的年龄 急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行实验，而且须是未曾交配和受孕的动物。由于小动物年龄与体重相关．一般用体重表示。例如：大鼠180—240g、小鼠18—25g、家兔2—2.5kg、豚鼠200—250g、狗10—15kg。同一批实验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20％。
3．实验动物的性别 急性毒性试验的主要内容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为雌雄各半。如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。如果试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物的LD50测试。
4．动物数量与随机分组 急性毒性试验要求大鼠、小鼠等小动物数量为每组10只．狗等大动物也应每组6只。由于实验动物对化学毒物的毒效应存在个体敏感性差异，即使同窝动物也可能存在这种差异，因此在动物分组中应严格遵循随机化的原则，尽可能减少非处理因素对试验结果的干扰，使非处理因素最大限度地保持一致，从而提高每组动物间的均衡性。
5．禁食 经口染毒的试验，要求动物实验前禁食，以免胃内残留食物对化学毒物毒性产生干扰。小鼠和大鼠主要在夜间进食，所以要求染毒前应隔夜禁食。大动物可在染毒前不喂食，染毒后继续禁食3—4
小时。
6．健康状况的选择 在选择了实验动物后，应先进行动物的检疫。在检疫期内出现临床异常者应予放弃，不可用于实验。一般来说，大鼠、小鼠、兔的检疫期为1—2周，实验用狗应先进行肠道寄生虫检查或直接进行驱虫治疗。检疫期以及试验期内雌雄动物必须注意分笼喂养，防止交配和受孕。
（二）实验动物的饲养环境 动物需经7天-两周适应期，有恒定的温度：22±3℃湿度：30-70%照度：昼夜各半，最好能人工控制，饲料合格，垫料合格，饮水合格等。
（三）染毒途径的选择 染毒方式要求尽量选择和人类接触途径相似方式。等容量灌胃法。观察期限一般为14天。
（四）染毒剂量与分组
1．查阅文献
①了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、比密、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。
②确定使用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂量分组。LD50的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍恩法等。
③找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。
2．预试验
①设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计l一2个剂量组作为预试验剂量。②根据确定的剂量组进行染毒。③根据预试验的死亡资料确定组距。
可根据以下公式计算出剂量分组： i=(lgLD90-lgLD10)／(n-1)或：i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1)式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)；n为设计的剂量组数。
3．正式试验一般来说、根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定组数。例如几率单位法、寇氏法一般设6～10个剂量组；霍恩法固定设4个剂量组。求得i值后．以最低剂量组(LD0或LD10)的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。
改良寇氏法应用条件：每组数量相同；各组距等比级数；死亡率呈等比级数；最低剂量组死亡率<20%，最高剂量组死亡率>80%
急性毒性替代试验：
1、固定剂量法：不以动物死亡为观察终点，预先选定的或固定的一系列剂量染毒，从而观察化学物的毒性反应来对化学物的毒性进行分级。试验剂量选择范围是5、50、500mg/kg；高毒（LD50<25mg/kg）、有毒（LD50为25-200mg/kg）、有害（LD50为200-2000mg/kg）、不分级（LD50>2000mg/kg）。
2、急性毒性分级法：以死亡为终点的分段试验法，每阶段3只动物，根据死亡动物数，平均经2-4阶段即可判定急性毒性。动物少，啮齿类，大鼠，25、200、2000mg/kg。
3、上-下移动法：以死亡为其观察终点，也可用于观察不同的终点，单性别动物6-10只
毒性作用观察：中毒体征及发生过程、体重和病理形态学变化、死亡情况和时间分布、死亡动物数??14天
LD50概念
LD50试验意义：①标准化药物毒作用强度，评价比较毒性大小；②计算药物治疗指数，药效剂量和毒性剂量的距离；③为后续的重复给药毒理学试验剂量的选择提供参考；④通过比较不同途径的LD50值，获得生物利用度的信息；⑤试验结果可用来推测人类的致死剂量以及中毒后的体征，为临床毒副作用提供监测参考。
LD50局限性：①给予有效信息较少，实用性有限；②波动性很大，影响因素多；③物种差异大，人和动物对药物的敏感性差别很大；④动物量大。
急性毒性分级和评价：急性毒性试验主要目的之一就是对化学物的急性毒性进行分级。评价化学物的急性毒性强弱，用于比较其急性毒性大小。
局部刺激试验：
目的：了解化学物对皮肤、眼睛的局部刺激性和腐蚀性；实验结果为制定化学物对眼睛和皮肤防护措施提供依据。
眼刺激试验：终点为眼刺激（可逆性炎症变化）和眼腐蚀（不可逆）。单侧暴露、家兔4只、左右对比、结膜、角膜、虹膜、按规定的分级标准进行评分、7天、可延长至21天（看有无可逆）。24h、48h、72h、4d、7d
皮肤原发性刺激试验：单次和多次、完整皮肤和破损皮肤、终点为皮肤刺激和皮肤腐蚀。家兔豚鼠、红斑、按红斑和水肿的严重程度评分，24h、48h、72h，一般不超过14天
皮肤致敏试验：目的是通过动物实验预测化学品经皮肤接触对人类引起皮肤致敏反应的危害。福氏完全佐剂（FCA）的方法、不加佐剂的方法。豚鼠、诱导接触、24h和后6h，间隔10-14天后，激发阶段，激发剂，观察24h，评分
短期、亚慢性和慢性毒性作用：
蓄积作用：具有蓄积作用是发生慢性毒作用的前提。化学毒物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物连续的、反复的、多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的蓄积作用。
蓄积于体内的化学物质可以原形或代谢转化产物的形式，或与机体中某些物质结合的形式存在。
当实验动物反复多次接触化学毒物后可以用分析方法在体内测出物质的原形或其代谢产物——物质蓄积。如果在机体内不能测出其原形或代谢产物，却出现了慢性毒性作用——损伤蓄积。
蓄积系数：K=ED50（n，多次染毒）/ED50（1.，单次染毒）=LD50（n）/LD（1）
蓄积评价：K分级标准，K<1高度蓄积，1-3明显蓄积，3-5中毒蓄积，>5轻度蓄积
短期重复剂量毒性：实验动物或人连续接触外源化学物14-30天所产生的中毒效应。
亚慢性毒性作用：实验动物或人连续较长期接触外源化学物质所产生的中毒效应。所谓“较长期”通常为1～6个月。
慢性毒性作用：指实验动物或人长期（甚至终身）反复接触外源化学物所产生的毒性效应。所谓“长期”，并没有统一的严格的时间界限，可以是终身染毒。
重复染毒毒性试验、亚慢性毒性作用和慢性毒性作用的目的：
1、观察受试物亚慢性毒性效应谱、毒作用特点和毒作用靶器官，了解其毒性机制。
2、观测长期接触受试物毒性作用的可逆性。
3、研究重复接触受试物毒性剂量-反应（效应）关系，从初步了解到确定未观察到有害作用的剂量（NOAEL）和其观察到有害作用的最低剂量（LOAEL），提出安全限量参考值。
4、比较不同动物物种毒效应的差异，为受试物毒性机制研究和将研究结果外推到人提供依据。 亚慢性毒性试验的实验方法的要点：
1、实验动物的选择：
①物种和品系：啮齿类和非啮齿类，小鼠、昆明系，易养，方便，繁殖强
②性别、年龄和动物数：雌雄各半，特殊实验可选单性别。6-8周龄大鼠，每组不少于20只，刚断乳，刚成年，未交配未受孕，体重差异不超平均体重20%
③微生物学寄生虫学等级和饲养环境：尽可能选择高等级实验动物，在符合国家实验动物标准试验环境中进行。清洁级及以上。屏障环境内试验
2、染毒方式要求尽量选择和人类接触途径相似方式；应当与预期进行的慢性毒作用研究的接触途径相一致。经口、呼吸道
3、剂量选择和分组：设3个剂量组和1个阴性对照组，必要时可加1个溶剂对照组。最高剂量组剂量的确定可以该化学物急性阈剂量或该化学物的1/20～1/5LD50作为最高染毒剂量。最低剂量组的的动物应无中毒反应或仅有轻微反应，相当于亚慢性的阈剂量或NOAEL水平。在低、高剂量组间再设一个中间剂量组：LOAEL，各个剂量组间剂量差至少大于2倍。高剂量组能引起明显的毒性或少量动物的死亡（少于10%），低剂量组应物中毒反应，相当于NOAEL。
4、观察指标：①一般性指标（外观体征、行为活动，动物体重，饲料消耗量、食物利用率）；②实验室
检查（血液学检查，血液生化检查）；③系统尸解和组织病理学检查（脏器重量和脏器系数）；病理学检查（目的是确定化学毒物对机体毒作用的靶器官、损害的性质和程度，从病理学角度找出化学毒物与病理改变的剂量-效应关系，为了解化学毒物的毒效应和机制提供依据。分别从大体、组织、细胞、亚细胞、甚至分子水平多方面进行检查，一般选择对受试物敏感的脏器，如：肝、肾、脑等）；④其他指标的检查 脏器系数：脏器相对重量，指某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常是每100g体重中某脏器所占的质量，表示为脏器质量（g）/体重（100g），适用于实质性脏器，系数增大，增生充血水肿；系数减小，发育不良或萎缩。
慢性毒性试验的实验方法要点：
1、实验动物的选择：2种哺乳动物。小鼠出生后3周，大鼠出生3～4周。
2、染毒途径和时限：染毒方式要求尽量选择和人类接触途径相似方式。一般每周染毒5～6天。工业毒物至少6个月，环境毒物与食品是一年或两年，终生染毒
3、剂量分组：设3个染毒剂量组和1个对照组，必要时另设1个溶剂对照组。以亚慢性毒性实验的LOAEL1/5～1/2为高剂量组，以1/50～1/10为中剂量组，1/100为低剂量组。亚慢性毒性的最大耐受剂量MTD为最高剂量。或以1/10LD50为高剂量组，1/100LD50为中剂量组，1/1000LD50为低剂量组。各剂量差一般为5～10倍，最低不小于2倍。
4、观察指标：一般性指标、实验室检查、病理学检查及其他特异性指标的检查。
结果评价：
1、剂量相关趋势
2、反应重现性
3、相关指标变化
4、差异大小和性别差异
5、历史性对照的作用
第七章 致突变作用
1变异ariation：生物个体和各代之间出现不同程度的差异
2.生物变异的原因：A亲代个体杂交产生子体，由基因重组而发生。B基因突变而发生，是新基因产生的根本；来源。C生物的染色体组成或细胞质发生改变。
3遗传毒理学的概念及目的：应用生物遗传学方法研究化学物质及其他环境因素对机体遗传物质的有害作用及机制的一门毒理学分支学科。其目的为：A检测在亚毒性暴露水平既能特异地引起基因损伤，造成机体遗传特性改变的物质。B研究其毒作用特点及对人类的潜在有害作用。
4遗传毒性genetic toxicology：化学物或其他环境因素对基因组的损害能力，包括对基因组的毒作用引起的致突变性及其他各种不同效应。
5突变mutation：生物体遗传物质发生可遗传的变化。
突变的类型：A自发突变B诱发突变
致突变物或诱变剂mutagen：也称遗传毒物genotoxic agent：能损伤遗传物质，从而诱发突变的外源化学物。分为：直接致突变物（原型可引起生物体突变）和间接致突变物（经代谢活化后可具有） 致突变性mutagenicity：化学物或其他环境因素引起遗传物质发生突变的能力。
致突变作用mutagenesis：化学物或其他环境因素引起生物体遗传物质的突变效应。
突变体mutant：当遗传物质突变后，其子代可形成不同于亲代遗传性状的生物体。
6致突变的类型
根据遗传物质的受损程度能否在显微镜下直接观察到分为：a基因突变（点突变）b染色体畸变（基因组突变）
7基因突变：分子水平遗传物质的改变，包括碱基置换、移码突变、密码子插入或缺失。
碱基置换：DNA多核苷酸链上某个碱基为为另一个碱基取代，引起DNA碱基序列的异常。有碱基转换和颠换两种类型。后果：a同义突变b错义突变c无义突变d终止密码突变
移码突变：在DNA碱基序列中，插入或缺失一个或几个（除了3或3的倍数）碱基，按三联密码连续阅读的规则，该部位以后的密码子组成全部改变，指导合成的多肽链也全部发生改变。其后果为：致死性突变
密码子插入或缺失：DNA碱基序列中插入或缺失的碱基数恰好为一个或多个三联体，指导合成的多肽链增加或减少一个或多个氨基酸，但此部位之后的氨基酸序列无改变。不属于移码突变。
8染色体畸变：染色体机构的改变。在有丝分裂的中期相染色体中可见，对精子细胞在减数分裂期的中期Ⅰ期进行观察。
断裂作用clastogenesis：染色体或染色单体受损而发生断裂，且断段不发生重接或虽重接却不在原处，这种作用的发生及其过程
断裂剂clastogen：使染色体发生断裂的物质。
染色体机构异常的类型：染色体型畸变和染色单体型畸变
染色体型畸变：染色体中两条染色单体同一位点受损后所产生的机构异常。常发生在细胞周期的G0或G1期。分为内互换和间互换。
（1） 末端缺失
（2） 微小体
（3） 无着丝点环
（4） 着丝点环
（5） 倒位，包括臂间和臂内
（6） 易位，包括对称和不对称
染色单体型畸变：在某个染色体的一条单体上发生的畸变。常发生在细胞周期的S或G2期。 染色单体交换包括内换和互换
9基因组突变-染色体数目异常
不同物种体细胞染色体数目不同：人46,大鼠42，小鼠40
类型：整倍性畸变和非整倍性畸变
10致突变作用的因素：化学、物理、生物
分子机制：A直接诱变：基因突变和染色体畸变——以DNA为靶
B间接诱变：基因组突变——靶位常为有丝分裂和减数分裂的成分，常见有丝分裂毒物，作用于纺锤丝。
一、 直接诱变
1碱基损伤：a碱基类似物的取代b碱基错配c致突变作用改变或破坏碱基的化学结构d平面大分子嵌入DNA链
2DNA链受损：a共价结合形成DNA加合物bDNA-蛋白质交联物c二聚体的形成
二、 间接诱变1对纺锤体作用2干扰与DNA合成和修复有关酶系统
突变
11突变的结果：据靶细胞不同分为体细胞突变和生殖细胞突变
体细胞突变的后果：a致癌b致畸c可能与动脉粥样硬化症有关d有衰老有关
生殖细胞突变的后果：致死性突变（早起胚胎死亡或不孕、死亡效应或不出现死亡效应）、非致死性突变（先天性畸形和基因库负荷增加）
基因库gene pool：一种物种的群体中生殖细胞内具有的、并能传给后代的基因总和。
遗传负荷genetic load：一种物种群体中每一个体携带的可遗传给后代的有害基因的水平。
一、 DNA损伤的修复
遗传信息长期保持高度保真即重现精度的原因：1DNA损伤的修复保护亲代DNA链2在复制中发生的错误及时修复已达到高度保真性
分类：1.DNA修复——切除损伤片段并修复DNA双链的连续性。
2．转录应答——DNA损伤激活特定基因转录，使其有利于细胞生存
3.激活DNA损伤关卡——组织细胞周期使其完全修复，并且可以防止损伤或不完整染色体信息的传递。
4.凋亡——由细胞死亡配体或DNA损伤引起，可以清除损伤严重的细胞或不受调控机制约束的细胞。 小结：诱发突变是一个受控制的过程，失控才真正发生突变。
遗传因素对致突变作用的影响：1代谢酶遗传多态性2修复功能的个体差异
致突变性的检测目的：1对体细胞的致突变性：预测其对哺乳动物和人的致癌性2对生殖细胞的遗传毒性：预测其对人体的遗传危害性
观察混血儿致突变作用的方法
一、 观察项目的选择
1. 遗传重点genetic endpoint：致突变试验观察到的现象所反映的各种事件，即致突变试验的观察终点。
2. 致突变试验的遗传学终点分为4类：a基因突变——DNA碱基序列改变b染色体畸变——染色体完整性改变c染色体组畸变——非整倍体d原发性DNA损伤
基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性，是评价化学毒物致突变唯一可靠的方法。
3. 试验配套
原则：一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点
细胞回复突变试验——基因突变
微核试验——染色体畸变或分离异常
SCE——染色体畸变和原发性DNA损伤
实验资料要求：包括多种进化程度不同的物种，如原核细胞、低等和高等真核细胞。
重要的致突变试验：1.细菌回复突变试验
使用鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌进行，分别称为Ames试验和大肠杆菌回变试验
2微核试验MNT
微核：染色体和染色单体的无着丝粒片断，或纺锤丝受损上而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内。
3染色体畸变分析
4姐妹染色单体交换试验
第八章 外源化学物致癌作用
肿瘤的发生是由环境因素和机体的遗传易感性共同决定的。
遗传因素和环境因素（化学性、物理性及生物性因素）等。
化学致癌作用：是指化学物质引起正常细胞发生恶性转化并发展成肿瘤的过程，具有这种作用的化学物质称为化学致癌物。
化学致癌作用至少包括3个阶段：引发阶段（initiation）、促长阶段（promotion）和进展阶段（progression）。
★多阶段致癌的形态学和生物学特征★
引发 促长
1、不可逆性
（DNA损伤→损伤固定1、在基因表达和细胞水
遗传性状改变→突变细平上有可逆性
胞）
2、持续给以促长剂（非2、经引发的“干细胞”致突变物）才可维持促长在形态学上无法识别 细胞群（在引发之后） 进展 1、不可逆性 2、核型不稳定性导致细胞基因组结构的形态学改变
3、在进展阶段早期，已3、对外源化学物及其他3、对衰老、饮食和激素改变的细胞对环境因子化学因子敏感 因子敏感 敏感
4、引发细胞可能自发
（内源性）启动 4、内源性促长剂可引起4、在进展阶段可以观察
（引发必在促长之前，无“自发”促长作用 到良性或恶性肿瘤
促长不致癌）
5、进展剂使已促长的细5、需经细胞分裂“固定5、剂量-反应关系显示有胞进入此期（但可不是引突变” 可测阈值和最大作用 发剂，自体可进展，自发）
6、以能否有效地扩大引
6、剂量-反应关系良好，发细胞群来确定促长剂 但很难确定阈值 的相对强度（最大效应时
间和剂量速率）
7、引发剂的强度以经一
定的促长阶段后发生的
癌前病变来定量
肿瘤发生是指致癌剂诱导细胞的基因突变或表观遗传变异，导致异常增生的单个克隆癌细胞的生成，从而引发致癌过程。遗传性、散发性
致癌过程有多个与癌肿有关的基因参与：癌基因、抑癌基因、细胞周期调节基因、细胞凋亡基因、维持细胞基因组稳定性的基因，从正常细胞到恶性转化细胞的过程至少涉及4-5个基因的突变。
●引发阶段：为化学致癌作用的第一步骤。它通常是一相对迅速的过程，化学致癌物对靶细胞DNA产生损伤作用，经细胞分裂增殖固定下来，造成单个或少量细胞发生永久性不可逆转的遗传性改变，成为启动细胞。这就是引发阶段。具有引发作用的化学物质，称为引发剂。●促长阶段：为化学致癌作用的第二阶段，是单克隆的癌细胞在一种或多种促癌物质的不断作用下，表型发生了改变，恶性肿瘤细胞的各种性状得以表达的过程。引发产生作用是不可逆改变，促长在早期阶段的改变是可逆的。
●进展阶段：为化学致癌作用的第三阶段，癌症的进展阶段是指由良性肿瘤转变为恶性肿瘤，并进一步演变成更具恶性表型或具有侵袭特征的肿瘤的过程，自主性和异质性增加、生长加速、侵袭性加强、出现侵润和转移的恶性生物学特征。核型稳定破坏、染色体畸变、赋予肿瘤逃避??
遗传易感性与化学致癌：单核苷酸多态性SNP
化学致癌机制：
1、体细胞突变学说：
与DNA碱基的共价结合所形成的DNA加合物（DNA adduct），是DNA损伤的主要形式。致癌物与DNA大分子的结合具有位点特异性；致癌物引起细胞原癌基因（正常无害、靶分子）激活或使抑癌基因失活的遗传学改变，包括基因突变、基因扩增、染色体重排和非整倍体。
肿瘤抑癌基因或抗癌基因，使细胞内一类能对抗肿瘤作用的基因。抑癌基因往往在细胞癌变或恶变的过
程发生失活或纯合缺失。通常抑癌基因在控制细胞生长、增殖等过程起负调控的作用，而在诱导细胞分化及诱导细胞凋亡的过程则发挥正向调节的功能。抑癌基因的失活一般涉及两个等位基因。重要的一个：p53，人类肿瘤中50%以上存在p53基因的异常，p53参与细胞周期调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等过程，在细胞内的核心作用是介导DNA损伤后的应激反应，使细胞阻滞于G1期以修复损伤，维持基因组的稳定性。突变p53使细胞失去监控而发生恶变。
2、非突变致癌机制：DNA的序列并没有发生变化，而是发生了基因外的变化，影响到基因调控，使基因出现不正常的关闭和开放。
①表观遗传调控失常导致肿瘤发生：整个基因组的甲基化、某些抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化及印记丢失等。
②细胞异常增生
③免疫抑制
④内分泌激素失衡
⑤过氧化酶体增殖剂激活受体
化学致癌相关的分子事件：
4、基因突变
5、端粒调控与细胞永生化：细胞永生化过程使细胞恶性转化的必经阶段，因为所有的肿瘤细胞都具备无限分裂的特性。抑癌基因p53和Rb的失活以及端粒酶的激活是人体细胞获得永生化的必要条件。
6、细胞周期调控紊乱：细胞周期素，G1-S转换（肿瘤形成关键）和G2-M转换。细胞调控依靠两大机制：细胞周期驱动机制；细胞周期监控机制。细胞周期监控包括DNA损伤感应、细胞生长阻滞、DNA修复和细胞凋亡启动四种功能。一些癌基因或抑癌基因也是细胞周期调控过程的重要成分：p53。
7、细胞凋亡与肿瘤发生：细胞凋亡（细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程，是一种自然的生理过程，是机体为了清除多余的、有害的、已经完成使命的细胞，维持机体的稳态所启动的系统）。诱导细胞凋亡的因素分内源性和外源性，一些基因也能促进细胞凋亡。 化学致癌物的分类：
1、根据对人类和动物致癌作用分类：
在动物诱癌实验中证据是否充分把致癌物分为：①致癌性证据充分；②致癌性证据有限；③致癌性证据不足；④致癌性证据阴性；⑤无证据可引用。
19xx年IARC????将环境因子和类别、混合物极暴露环境与人类癌症的关系分为4组：
组1，对人类是致癌物。对人类致癌性证据充分这属于本组。95种
组2，分为两组，组2A和组2B。组2A（66种）对人类很可能是致癌物，指对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分。组2B（241种）对人类是可能致癌物，指对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据并不充分；或指对人类致癌性证据不足，对实验动物致癌性证据充分。
组3，现有的证据不能对人类致癌性进行分类。497种
组4，人类可能非致癌物。1种，己内酰胺
2、按化学致癌作用模式分类：
Ⅰ、遗传毒性致癌物：进入细胞后与DNA共价结合??损伤遗传物质
①直接致癌物：本身有直接致癌作用，在体内不需要经过代谢活化即可致癌。亲电子反应物
②间接致癌物：本身并不直接致癌，必须在体内经代谢转化，其所形成的代谢产物才具致癌作用。代谢活化前——前致癌物；在活化过程的中间产物——近致癌物；近致癌物进一步代谢活化——终致癌物。终致癌物是体内不需经代谢活化的直接致癌物和在体内代谢活化产生活性代谢产物的间接致癌物的总称，通常是带正电荷的亲电子物质。
③无机致癌物：亲电子剂，选择性改变DNA复制保真性，导致DNA的改变。
Ⅱ、表观遗传毒性致癌物：不作用于机体遗传物质的化学致癌物。
①促长剂；②内分泌调控剂（起促长剂作用）；③免疫抑制剂（对病毒诱导的恶性转化起增强作用）；④细胞毒剂（引起细胞死亡，导致增殖活跃及癌发展）；⑤过氧化物酶体增殖剂（氧自由基过量生成）；⑥固态物质（物理状态是关键性因素）。
Ⅲ、未分类
助致癌物：本身既不具有引发作用，也不具有促长作用，但可以促进引发作用和增强促长作用，即能促进或增强全部致癌过程。乙醇、二氧化硫
化学致癌物筛查的基本方法：
1、定量构效关系分析
2、遗传毒性试验
3、细胞恶性转化实验
细胞恶性转化指外源因素对体外培养的细胞所诱发的恶性表性改变，包括细胞形态、细胞增殖速度、生长特性、染色体畸变等变化，当细胞接种在裸鼠皮下可形成肉眼可见的肿瘤。
4、哺乳动物致癌试验
终身试验/有限动物试验
Ⅰ、动物短期致癌试验
●小鼠皮肤肿瘤诱发试验：于小鼠皮肤局部连续涂抹受试物，以观察皮肤乳头瘤和癌的发生，一般20周可结束实验，较敏感的小鼠为SENCAR小鼠。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为致癌性多环芳烃，促长剂为佛波醇酯（TPA）。
●小鼠肺瘤诱发试验：染毒途径常用腹腔注射，也可灌胃或吸入，一般30周可结束实验，观察肺肿瘤的发生。较敏感的小鼠为A系小鼠。此试验也可设计检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为乌拉坦，促长剂为丁基羟甲苯。
●大鼠肝转化灶诱发试验：对大鼠进行肝大部切除术后，给以受试物，一般可在8-14周结束实验，观察肝转化灶生成。肝转化灶是癌前病变，有Y—谷氨酰转移酶（Y—GT）活性升高。转化灶可用组织化学或免疫化学方法鉴定。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为二乙基亚硝胺（DEN），促长剂为苯巴比妥（PB）。
●雌性大鼠乳腺癌诱发试验：一般可用SD大鼠，实验周期为6个月。
Ⅱ、哺乳动物长期致癌试验
●受试化合物的有关资料
●试验动物物种和品系：常规选用大鼠和小鼠，雌雄各半，使用刚断乳的动物。
●剂量选择和动物数量：
致癌试验一般设三个试验组。以最大耐受剂量（Erm）为高剂量。最大耐受剂量是由90天毒性试验来确定的，此剂量应使动物体重减轻不超过对照组的10％，并且不引起死亡及导致缩短寿命的中毒症状或病理损伤。中及低剂量组则按等比级数下推，如分别为上一个剂量水平的1／2或1／3。低剂量组应不影响动物的正常生长、发育和寿命，即不产生任何毒性效应。但低剂量组应高于人的接触剂量，一般不低于高剂量的10％。中剂量组介于高、低剂量之间，如有可能按受试物的毒物动力学性质来确定。对照组除不给受试物外，其他条件均与试验组相同。同时应设阴性（溶剂或赋形剂）对照组。必要时可设阳性对照组，阳性致癌物最好与受试物的化学结构相近。
每组至少有雌雄各50只动物，希望在出现第一个肿瘤时，每组还有不少25只动物。肿瘤自发率越高，则要求试验组肿瘤发生率超过自发肿瘤率越高。
●染毒途径及染毒时间：应尽可能模拟人体可能的暴露途径。
●试验期限：一般情况下，试验期限小鼠和仓鼠应为18个月，大鼠为24个月；然而对于某些生命期较长或自发肿瘤率低的动物品系，小鼠和仓鼠可持续24个月，大鼠可持续30个月。 ●观察和结果分析：
一般观察每天观察受试动物一次，观察时要注意有无肿瘤出现、肿瘤出现时间及死亡时间。病理检查动物自然死亡或处死后必须及时进行病理检查。
肿瘤发生率（％）＝（实验结束时患肿瘤动物总数／有效动物总数）×100％，
肿瘤多发性指一个动物出现多个肿瘤或一个器官出现多个肿瘤。应对试验结果进行仔细的统计学分析，并研究剂量—反应关系。
致癌试验阳性的判定标准：
（1）对于对照组也出现的一种或数种肿瘤，试验组肿瘤发生率增加；
（2）试验组发生对照组没有的肿瘤类型；
（3）试验组肿瘤发生早于对照组；
（4）与对照组比较，试验组每个动物的平均肿瘤数增加。
在进行试验的两个物种两种性别动物中，有一种结果为阳性，即认为该受试物有致癌性。两个物种两种性别动物试验结果均为阴性时，方能认为未观察到致癌作用。
5、促癌剂的检测
6、转基因或基因敲除动物在致癌物筛查中的应用
7、人群肿瘤流行病学研究：化学致癌的潜伏期很长。基本条件：足够量的接触人群、一定的接触史（20年左右）、能推算出接触剂量、对照组选择合理（干扰因素的控制）。
第九章 发育毒性与致畸作用
一、基本概念：
1发育毒理学developmental toxicology：研究出生前暴露于环境有害因子导致的异常发育结局及其有关的作用机制、发病原理。影响因素和毒理动力学等。
2畸形malformation发育生物体解剖学上形态结构的缺陷。引起急性的环境因子叫致畸物或致畸原teratogen，致畸物引起畸形的过程和特性叫做致畸作用teratogenesis或致畸性teratogenicity
3变异variation：是由遗传和遗传外因素控制的外观变化，或由于分化改变引起的差异deviation。指同一种属的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，一般是小的或次要的机构改变。
4胚体-胎体毒性：外源性理化因子对孕体着床前后知道器官形成期结束时的有害影响叫做胚体毒性。对孕体器官形成期结束后的有害影响叫做胎体毒性或胎儿毒性。在实验动物发育毒性实验中，笼统称为胚胎毒性。
5发育毒性：出生前后接触有害因素，子代个体发育为成体之前诱发的任何有害影响。发育毒性主要表现为：a发育生物体死亡b生长改变c结果异常d功能缺陷
6出生缺陷birth defect：婴儿出生前即已形成的发育障碍，包括畸形和功能缺陷。
7不良妊娠结局：妊娠后不能产生外观和功能正常的子代，包括所有的不良后果，如流产、死胎、死产、宫内发育迟缓、发育异常、新生儿和婴幼儿期死亡等。
二、发育毒性作用的特点和影响因素
（一）发育各阶段发育毒性作用的特点和知己敏感性
1着床前期：又称分化前期，从受精时算起，到完成着床之前。其期限在人类为妊娠11-12天，啮齿动物是妊娠前6天。此时细胞迅速分裂，分化很少，受损的是相对未分化细胞。较少发生特异的致畸效应
（例外：小鼠子代发生神经管畸形和腭裂），通常发生着床前丢失。
2器官形成期：着床后直到硬腭闭合。人是妊娠3-8周，大、小鼠为妊娠6-15天。此期细胞增值、移动，细胞与细胞间交互作用和形态发生组织改造，其中细胞增值的速度极为重要。是反生机构畸形的关键期critical period即致畸敏感期。外源化学物发育毒性的主要表现为结构畸形，也可以有胚胎畸形和生长迟缓。不同器官有不同的敏感期，即所谓的时间“靶窗”target window。
3胎儿期：硬腭闭合到分娩，人类从妊娠56-58天开始。此期以组织分化、生长和生理学的成熟为主。外源化学物的不良作用表现为：生长迟缓、特异的功能障碍、经胎盘致癌、偶见死胎。
4围生期和出生后的发育期：一些功能方面的缺陷出生时不易发现，需要出生后继续观察一段时间，研究较多的是发育免疫毒性、神经行为发育异常和儿童期肿瘤。此期是一生中对致癌物最敏感的时期。
（二）发育毒性的剂量-反应模式和阈值问题
剂量-反应模式影响因素：化学物的类型、暴露的时间和剂量
1正常胎、生长迟缓、机构畸形和胚胎死亡同时存在，低剂量可先引起生长迟缓、胚胎吸收和畸形，剂量增加，胚胎死亡占优势，甚至整窝胚胎死亡。
2在远低于胚胎致死剂量下即可发生致畸，甚至全窝致畸，畸形胎儿常有生长迟缓。生长迟缓曲线常平行于致畸曲线。
3只有胚胎生长迟缓和胚胎死亡，但没有畸形发生。
（三）发育毒性的物种差异
原因：代谢变化、胎盘种类、胚胎发育的速度和方式等
一种化学物对不同物质的致畸作用可能不一致，对不同动物不一定都具有致畸作用，引起畸形的类型也可能不同。
三、 母体毒性和发育毒性
（一） 母体因素对发育毒性的影响
母体毒性maternal toxicity：化学毒物对妊娠母体的有害效应，表现为增重减慢、功能异常、临床症状甚至死亡。
影响发育的母体因素：1遗传学2疾病3营养4应激5对胎盘的毒性
（二） 母体毒性与发育毒性的关系
1具有发育毒性，但无母体毒性，表示发育毒性有特定的机制，与母体毒性无关。如沙利度胺
2出现发育毒性也出现母体毒性，尤其是当发育毒性只在母体毒性存在时才能被观察到的时候，发育效应可能是间接的，往往不具有特定的致畸机制。如乙醇和可卡因
3具有母体毒性，但不具有致畸作用。
4在一定剂量下，既无母体毒性，也不表现发育毒性。
四、 父源性发育毒性
五、 致畸（发育毒性）作用机制
1基因突变与染色体畸形
2干扰基因表达
3细胞损伤与死亡
4干扰细胞-细胞交互作用
5通过胎盘毒性引起发育毒性
6干扰母体稳态
六、 发育毒性和致畸作用试验与评价
（一） 动物发育毒性试验
三段生殖毒性试验
人为将生殖发育过程分为：
A从交配前到受孕
B从受孕到着床
C从着床到硬腭闭合
D从硬腭闭合到妊娠结束
E从出生到断乳
F从断乳到性成熟
三段生殖毒性试验分别为：
Ⅰ段：生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验） Ⅱ段：胚体-胎体毒性试验（致畸试验）
Ⅲ段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验） 试验方案要点：
Ⅰ段 Ⅱ段
交配前和妊娠前期给药
评价化学物对配子发生
和成熟、交配行为、生育
力、胚体着床前和着床的
影响 敏感期给药 Ⅲ段 妊娠后期和哺乳期给药 评价母体自着床至断乳试验名称 研究目的 期间接触化学物对妊娠/评价母体自胚泡着床到硬腭闭合期接触受试物哺乳母体、孕体及子代发
育直至性成熟的影响
实验动物
至少1种，首选大鼠。每对妊娠雌体和胚体-胎体至少1种，首选大鼠。每发育的影响 组动物数应足以对数据进行有意义的解释，建议 种动物数应足以对数据每组16-20（窝） 进行有意义的解释，建议通常两种，一种啮齿类，首选大鼠，另一种非啮齿每种性别16-20只（窝） 类，最好是家兔。建议每雌性从着床到哺乳期结交配前雄性4周，雌性2组16-20（窝） 束，大鼠孕15-产后28周，交配期（2-3），雌性 天 着床前（大鼠孕6天） 大、小鼠孕6-15天，家
兔孕6-18天
给药时间
（二） 流行病学研究和人类发育毒物的确定
确认人类致畸物的标准：
1一种特殊的缺陷或几种缺陷并发（综合征）的频率突然增加。
2缺陷的增加与某种已知的环境改变（如一种新药的广泛使用）相关联。
3在妊娠的特殊阶段已知暴露于某种环境的改变，产生有特征性的缺陷的综合征。
（三） 发育毒性的初筛和替代试验
1体外初筛试验a大鼠全胚胎培养b胚胎细胞微团培养c小鼠胚胎干细胞试验 2体内初筛试验
第十一章 管理毒理学
管理毒理学：是现代毒理学的重要组成部分，管理毒理学包括收集，处理和评价流行病学和试验毒理学
数据，以及基于毒理学针对化学物有害效应保护健康和环境的决策。而且，管理毒理学支持标准方案和新测试方法的发展，改进决策程序的科学基础。
3R原则：替代replacement、减少reduction、优化refinement
危险度（risk）指在特定暴露条件下，因接触某种水平的化学毒物而造成机体、系统或（亚）人群产生有害作用的概率。分为绝对危险度和相对危险度。
安全性（safety）指化学物质在规定暴露条件下对人体和人群不引起健康有害作用的实际确定性。
危险度评定risk assessment 是指特定的靶机体、系统或（亚）人群暴露于某一危害，考虑到有关因素固有特征和特定靶系统的特征，计算或估计预期的危险的过程，包括评定伴随的不确定性。四步组成：危害识别、危害表征（剂量-反应评定）、暴露评定、危险性表征（包括定量的和定性的危险度和不确定性）。 危险度评价（risk assessment）是在综合分析人群流行病学调查、毒理学试验、环境监测和健康监护等多方面研究资料的基础上，对化学物损害人类健康的潜在能力作定性和定量的评估，对环境评价过程中存在的不确定性进行描述与分析，进而判断损害可能发生的概率和严重程度。目的是确定可接受的危险度和实际安全剂量，为政府部门正确的作出卫生和环保决策、制定相应的管理法规和卫生标准提供科学依据。
安全性评价（safety evaluation）是通过动物实验和对人群的观察，阐明待评物质的毒性及潜在的危害，决定其能否进入市场或阐明安全使用的条件，以达到最大限度的减小其危害作用、保护人民身体健康的目的。安全性评价须按一定的程序进行，通过一系列的毒理学试验，获得NOAEL和LOAEL并外推和评价在规定条件下化学物暴露对人体和人群的健康是否安全。在此基础上，根据待评物质的毒作用性质、特点、剂量反应关系及人群实际接触情况等，进行综合分析，确定安全系数。用NOAEL和LOAEL除以安全系数，可以制定安全限值，即化学物的卫生标准。
可接受危险度（acceptable risk）指公众和社会在精神、心理等各方面均能承受的危险度。一般认为某化学物终生暴露所致的危险度在百万分之一（10-6）或以下。
实际安全剂量（virtual safe dose VSD）指与可接受危险度相对应的化学毒物的接触剂量。
●危害识别：是指识别具有引起机体、系统或（亚）人群固有能力的因素的有害作用的种类和性质，是危险度评定的第一阶段。
目的是确定待评化学毒物在一定条件下与机体接触后，能否产生损害效应；效应的性质、特点和强度如何；化学毒物和损害效应之间有无因果关系。在进行研究之前，首先要获得足够的相关科学资料作为依据，这是认定的基础。如待评化学物的资料----化学结构、理化特性、用途、使用方式及范围、环境中的稳定性及活性；人群流行病学调查资料、毒理学试验资料等。
●危害表征：定性或定量的描述具有引起有害作用能力的某因素或某情形固有的性质，包括剂量-反应关系评定及其伴随的不确定性，是危险度评价的第二阶段。
目的是在认定待评物质具有危害性的基础上，阐明不同剂量水平的待评物质与接触群体中出现的最为敏感的关键性的有害效应发生率之间的定量关系，确定特定接触剂量下评价人群危险度的基准值。
可用于危险度评价的人类资料往往很有限，常要用到动物试验的资料，而危险度评价最为关心的是处于低剂量接触的人群，这一水平往往要低于动物实验观察的范围。这就要求要从高级两项低剂量外推及从动物性资料向人的危险性外推的方法，这也构成了剂量-反应关系评价的主要方面。
阈值法：实验获得的NOEL或NOAEL值除以合适的不确定系数等于安全水平或者每日允许暴露量。 参考剂量RfD和参考浓度RfC为日平均暴露剂量或浓度的估计值，人群（包括敏感亚群）终生暴露于该水平，预期发生非致癌或非致突变的有害效应的危险度可以忽略。
RfD=NOAEL或LOAEL/（UF*MF） UF为不确定系数，MF为修正系数。
基准剂量BMD是依据动物试验剂量-反应关系的结果，用统一的统计学模式求得的引起一定比例动物出现阳性反应剂量的95%可信限区间的下限值。计算时必须把实验组数、实验动物数及指标观察值的离散度等作为参数纳入。RfD=BMD/UF*MF
非阈值法：遗传性致癌物。无阈化学物主要指遗传毒性致癌物及致突变物。
概率分布模型，机制模型
●接触评定：评价机体、系统或（亚）人群对一种因子（和其衍生物）的评价，是危险度评价的第三阶段。
目的是确定危险人群接触的总量并阐明接触特征，为危险度评价提供可靠的接触数据或估测值。如经此阶段认定待评化学物与人群无接触或有接触但不能引起健康危害，则危险度评价科不再继续进行。 ●危险度表征：在规定的条件下定性或定量地确定某规定机体、系统或（亚）人群发生已知的和潜在的有害作用的概率，及其伴随的不确定性，第四阶段。
EED、超额危险度（终生、人均）、超额病例数、POD、MOE??
●危险度管理：依据危险性评估的结果，权衡出管理决策的过程，必要时，选择并实施适当的控制措施，包括制定法规等措施。包括三个要素：危险度评定（危险-效应评价）、扩散和暴露控制、危险性监测。
毒理学安全性评价遵循分段试验的原则。
●毒理学试验前的准备工作（基本资料??）
●毒理学评价程序
第一阶段：
包括急性毒性试验----主要是测定LD50和LC50，对受试物的急性毒性进行分级，为进一步实验的剂量设计和毒性判断指标的选择提供依据。
局部毒性试验----包括皮肤刺激试验、眼刺激试验、呼吸道刺激实验和皮肤变态反应试验。凡是有可能与皮肤或眼接触的化学物质应进行这些项目的实验。
第二阶段：
包括重复剂量和致突变试验、遗传毒性、发育毒性。了解受试物与机体多次暴露后可能造成的潜在危害，并研究受试物是否具有遗传发育毒性。
蓄积试验----以死亡为指标，有一定局限性有些程序对此已不再要求。
致突变试验----估测其致癌危险性。包括原核细胞基因突变试验、真核细胞染色体畸变实验、微核试验或骨髓细胞染色体畸变分析等，几个试验需联合使用，以观察不同的遗传学终点。
第三阶段：
包括亚慢性毒性试验、生殖与发育毒性试验和代谢试验。
亚慢性毒性试验----为了确定较长时间内反复接触受试物所引起的毒性效应强度、性质和靶器官，初步估计NOAEL和LOAEL，预测对人体健康的危害性，并为慢性毒性试验和致癌试验的剂量设计和指标选择提供依据。
生殖与发育毒性试验----包括致畸试验和繁殖试验，判断受试物能否使用，判断受试物的胚胎毒作用及对胎仔是否有致畸作用。观察受试物对生殖过程的不利影响。
代谢试验----了解受试物在体内的吸收、分布和消除情况，判断蓄积性的大小，寻找靶器官和剂量反应关系。
第四阶段：
包括慢性毒性试验和致癌试验。
慢性毒性试验----确定外源化学物的毒作用的NOAEL和LOAEL，并综合上述试验结果对受试物的安全性做出评价并加以一定的安全系数，提出人体接触的ADI和MAC。
致癌试验----确定其对实验动物的致癌性。
●人群接触资料
由于存在毒理学试验资料外推到人群接触安全性时的不确定性，故人群接触资料有特殊的意义。人群接触资料能直接反映受试物与机体接触后所造成的损害作用，一旦确定，即具有决定性意义。 安全性评价注意问题：
1、实验方法和操作技术的标准化
2、3R原则
2、注意毒理学试验方法的局限性、综合分析
每一项毒理学试验都有其自身的特点和观察终点，但都不能反映其全部的毒性特征。
第十四章 生殖毒理学
生殖毒理学reproductive toxicology：是生殖医学与毒理学结合而形成的一门重要交叉学科，主要研究对生殖系统产生损害作用的原因、机制和后果。这些损害作用包括生殖器官、相关的内分泌系统和妊娠结局的改变，表现为对性成熟、配子发生及其转运、性周期、性行为、受精、着床、胚胎形成和发育、妊娠、分娩和哺乳等的不良影响或依赖于生殖系统完整性的其他功能的改变。
一代和多代生殖毒性（或繁殖）试验
一代生殖毒性试验：亲代（F0代或P代）动物直接染毒受试物，子一代（F1）在宫内和哺乳期接触受试物，其交配只在P代间进行，主要评价受试物对P代青春期前后和成年动物亚慢性暴露的影响。 两代（多代）生殖毒性试验：子代（如F1和F2）从怀孕到出生前的宫内持续暴露和断奶前的持续暴露，即P代直接染毒受试物，F1代既有直接接触，也有经母体的间接接触，子二代（F2）在宫内和哺乳期接触受试物，其交配在P代和F1代间进行，主要评价从染毒到发育全过程受试物对生殖功能的影响。