萤火虫荧光素酶报告基因的检测

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发布日期：2010-04-08 10:24 文章来源：北京原平皓生物技术有限公司

关键词： 荧光素酶 报告基因

化学发光检测

荧光检测 光吸收检测 点击次数： 680

1. 应用说明

荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是来自北美萤火虫（Photinus pyralis）体内的荧光素酶。萤火虫荧光素酶属于加氧酶（oxygenase），其发光反应需要O2和Mg2+参与；有辅酶A（CoA）存在时能提高反应效率，增加发光时间。萤火虫荧光素酶无需翻译后修饰，即可表现出荧光素酶活性。因此可将萤火虫荧光素酶的基因插入不同载体，作为报告基因，在细胞中表达。

Turner BioSystems的ModulusTM单管型多功能检测仪与Promega's Steady-Glo?的检测试剂盒连用为荧光素酶报告基因系统中的基因表达定量提供了一种非常简便的方法。同时荧光素酶报告基因系统中的转录调控也常常被用于研究细胞的整个培养过程中的生理情况。

Steady-Glo试剂的发光半衰期大约为5小时，光信号能在加入试剂后5min到数小时之间都能检测到。同时Steady-Glo试剂应该与哺乳动物细胞培养基（RPMI 1640, MEMa, DMEM and Ham's F12）相匹配，并且不会受到酚红和有机溶剂的影响。

用具发光检测功能的ModulusTM单管型多功能检测仪检测时，荧光素酶的检测线性范围为1X10-18-1X10-11 mol或几个数量级（图 1）。实验由Steady-Glo荧光素酶检测试剂盒（E2520）来完成，重组的萤火虫荧光素酶纯化，也用Promega产品（E1701）。

图 1 用Modulus单管型多功能检测仪与Promega的Steady-Glo试剂盒和重组荧光素酶检测所得结果。

2. 所需器材

●具有发光检测模块的ModulusTM单管型多功能检测仪(/equip/modulus/modulus.asp)（货号9200-001或9200-002）

●1.5ml 微型离心管

●Steady-Glo荧光素酶检测试剂盒（E2520）

●p200移液器和匹配枪头

3. 实验方案

3.1试剂制备

Steady-Glo底物：使用所提供的底物，-20°C下可稳定储存6个月；4°C下可储存1个月。

Steady-Glo缓冲液：使用所提供的缓冲液，储存在25°C以下的环境条件下。 Steady-Glo试剂：将整瓶Steady-Glo缓冲液加入Steady-Glo底物瓶中，颠倒混匀使底物彻底溶解，使用试验当天配制的试剂，或者将配好试剂储存在-20°C冰箱中，可储存2周。

注：在检测时，Steady-Glo试剂应当维持在室温，因为荧光素酶的活性对温度比较敏感，配制后冻存的试剂应当在低于25°C条件下溶解，以确保试剂的性能，并且融化后还应充分混匀。一种最简单的方法就是将试剂在室温水浴下溶解。

3.2仪器安装

3.2.1关闭ModulusTM单管型多功能检测仪电源，根据操作手册安装发光检测模块。

3.2.1打开ModulusTM单管型多功能检测仪电源，打开后立即倒计时1min，让ModulusTM单管型多功能检测仪预热。

3.2.2预热后，进行样品检测，仪器默认的方案是1s的检测时间。

3.3样品分析

3.3.1从培养箱或其他培养仪器中取出培养的细胞。

注：为了获得最大的实验数据，加入试剂前应将培养细胞平衡至室温

3.3.2 向细胞培养液中加入等体积的Steady-Glo试剂。

3.3.3 静止5min使细胞充分裂解，然后将样品转移到1.5ml离心管中。

3.3.4 将1.5ml离心管插入模块中，点击"Measure Luminescence"菜单开始检测。

3.3.5 记录下相对光强度检测结果，并且仪器能在显示屏上最多可显示出最近20个检测结果。

4. 关于ModulusTM单管型多功能检测仪

ModulusTM单管型多功能检测仪(/equip/modulus/modulus.asp)是Turner Biosystems公司生产的一款单管型多功能检测仪，它具有生物与化学发光检测、荧光检测和光吸收检测三个功能。ModulusTM单管型多功能检测仪采用模块化设计, 可根据实验的需求, 选用相应的检测模块, 来完成生物与化学发光、荧光或光吸收检测.

第二篇：常见的报告基因

常见的报告基因

报告基因必须具备的特点：①由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别；

②细胞内其他基因产物不会于扰报告基因产物的检测；③报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高，

而且重现性好。到目前为止，报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连，

先让质粒在大肠杆菌中进行增殖，再提取质粒，转染人感兴趣的真核细胞中。与此同时还要将有真核启动子和增强子的 另一种报告基因质粒共转染同一细胞，作为转染率的内对照。

(1)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)：该报告基因来源于大肠杆菌转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。 氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。CAT在哺乳细胞无内源性表达， 性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(enzyme—linkedimmunosorbantassay， ELISA)检测其活性，也可进行蛋白质印迹(Westernblotting)和免疫组织化学分析。CAT与其他报告基因相比，

线性范围较窄，灵敏性较低。

(2)β半乳糖苷酶：β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。最大优势是易于用免疫组织化学法 观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。以邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用 标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红—β—D—半乳吡喃糖苷(CPRG)是另一个可用比 色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和荧光素二半乳糖苷(FDG)为底物则可用荧光法检 测其活性。此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学(FACS)分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学 发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。

(3)荧光素酶：荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有 细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。 萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范围宽达7～8个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因，用荧光比色计即

可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞 即可检测酶活性。Renilla荧光素酶催化肠腔素(coelenterazine)氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报 告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。

自19xx年起，萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得了广泛的应用。Promega公司的pGL3及pGL2系列 载体，含SV40启动子及增强子的不同组合，有助于分析DNA片段的转录活性。

荧光素酶报告基因有许多优点：①非放射性；②比CAT及其他报告基因速度快；③比CAT灵敏100倍；④荧光素酶 在哺乳细胞中的半衰期为3小时，在植物中的半衰期为3．5小时。由于半衰期短，故启动子的改变会即时导致荧光素酶 活性的改变，而荧光素酶不会积累。相反，CAT在哺乳细胞中的半衰期为50小时。荧光素酶浓度在10—16mol／L(10pS／L )到10-8mol／L(1mg／L)范围内，荧光信号强度与酶浓度成正比。在理想条件下，可检测到l0-20mol／L的荧光素酶。 Promega公司的荧光素酶检测系统比一般的方法灵敏及简单，产生的光稳定。

(4)分泌型碱性磷酸酶(SEAP)：SEAP是人胎盘碱性磷酸酶的突变体，无内源性表达。SEAP缺乏胎盘碱性磷酸酶羧基末端 的24个氨基酸。其优点是无需裂解细胞，只用培养介质即可检测酶活性，便于进行时效反应试验。以间硝基苯磷酸盐(PNPP) 为底物时可用标准的比色法测定酶活性，操作简单，反应时间短，价格廉价，但灵敏度低。以黄素腺嘌呤二核苷酸磷酸 为底物进行比色测定，其灵敏度增高。SEAP可催化D—荧光素—O—磷酸盐水解生成D—荧光素，后者又可作为荧光素 酶的底物，此即两步生物发光法检测酶活性的原理。此方法灵敏度高，接近于荧光素酶报告基因的检测。还可用一步化学 发光法检测酶活性。

(5)荧光蛋白家族：荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为20 000～30 000的同源蛋白。绿色荧光 蛋白(GFP)是应用最多的发光蛋白。GFP存在于发光水母(AequoreaVictoria)中。用395 Bin的紫外线和475 nm的蓝光激发， GFP可在508nm处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物。GFP最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内事件。 19xx年克隆了GFP基因，目前已获得几个突变体，如“红色迁移”突变体(red—shiftmutant)，其荧光更强。其他突变体还有 蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型GFP(EGFP)和去稳定EGFP(destabilizedEGFP)等。红色荧光蛋白(RFP)是从珊瑚(Discosoma sp．) 中分离的发光蛋白(drFP583或DsRed)，可发射明亮的红色荧光。这些常用的报告基因也可被联合应用，同时检测2个甚至

3个基因的表达。报告基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围。稳定性好的报告基因适于基因转录动力学 研究和高通量筛选，尤其适用于基因转移的定性研究。