实验一 凝集反应
实验目的： 1. 掌握凝集反应的原理
2. 直接凝集反应
3．间接凝集反应
实验内容： 1. 直接凝集反应
2．间接凝集反应
实验原理：当颗粒性抗原与其相应的抗体特异结合时，在电解质存在下，两者比例合适时，可出现凝集颗粒，此现象称凝集反应。
一、直接凝集反应一血型鉴定
人类血型是以红细胞表面所带抗原的不同而命名。红细胞表面主要带A、B两种抗原，人类血清中主要含有两种抗体（抗A或抗B抗体），用抗 A或抗B标准血清可以鉴定四种不同的血型，既A、B、AB、O表型。现介绍玻片直接凝集法。
（一）材料：人抗A和抗B标准血清、被检者红细胞、采血针、试管、载玻片、滴管、皮肤消毒剂。
（二）方法
1、 取清洁载玻片，用记号笔划分两半，左角上注 A字，右角上注B字
2、 用酒精棉球消毒指端皮肤，针刺受检者指端，取血分别滴在载玻片左右两端
3、 于玻片 A侧中央加抗 A型标准血清一滴，于玻片B侧中央加抗B血清一滴，充分混匀。
4、 5~10min后肉眼或低倍镜观察结果，以凝集现象的有无，按下表报告结果。
血型 凝集现象
抗 B标准血清 抗 A标准血清
O － －
A － ＋
B ＋ －
AB ＋ ＋
二、间接凝集反应
将可溶性抗原吸附在惰性颗粒载体上，与其相应抗体可发生凝集，称为间接凝集反应。本实验用猪乙型脑炎乳胶凝集实验抗体检测试剂盒进行验证试验。
（一）材料：阴性对照血清、阳性对照血清、乳胶抗原、载玻片等。
（二）方法
1、取洁净载玻片，用记号笔分为两格。
2、分别取阴性对照血清和阳性对照血清于载玻片两端。
4、然后各加一滴乳胶抗原，分别混匀。
5、缓慢摇动2～5min，并观察结果。
思考讨论
1、直接凝集反应与间接凝集反应的区别。
实验二 免疫沉淀反应
实验目的： 1. 掌握免疫沉淀反应的原理
2. 琼脂糖双向免疫扩散
实验内容： 1. 琼脂糖双向免疫扩散
实验原理： 当可溶性抗原与其相应抗体相遇，在有电解质存在的条件下，二者比例合适可出现肉眼可见的白色沉淀，故名沉淀反应。
一、琼脂糖双向免疫扩散
在含有电解质的琼脂中，抗原抗体分子互相弥漫扩散，当比例合适时可出现沉淀带。此法可用于分析抗原成分，以及鉴定抗体的纯度等。
（一）材料：1％生理盐水琼脂糖、人IgG、抗人IgG、载玻片、打孔器等。
（二）方法
1、将1％盐水琼脂糖加热溶化。
2、取一洁净载玻片，放水平台上，将已熔化的琼脂3～4ml趁热倾注在玻片上制成厚薄均匀的琼脂糖凝胶板。
3、待琼脂凝固后，按图2．1打孔。
4、在中心孔内加入人IgG。
5、于周围各孔中分别加入不同稀释倍数的抗人IgG。
6、将琼脂糖凝胶板放湿盒中，置37℃温箱中24h后，取出观察结果。
图 2.1
实验三 免疫酶技术ELISA
实验目的： 1. 掌握免疫酶技术ELISA的原理
2. 掌握免疫酶技术ELISA的技术
实验内容： 免疫酶技术ELISA之双抗夹心法
实验原理：
免疫酶技术是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。其原理是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗原的特异性及免疫反应性，也不影响酶的催化效能。当存在相应酶底物时，酶能催化产生有颜色的产物，颜色的有无及深浅能反映相应的抗原或抗体是否存在及其量的多少。
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一类常用的免疫酶技术，可用于测定抗体，也可用于检测抗原。该实验常用的酶为辣根过氧化物酶，底物为邻苯二胺（OPD）。实验方法有间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。
本实验采用双抗夹心法（抗体-抗原-酶标抗体）
一) 材料和试剂：羊抗人IgG抗体、不同浓度的人IgG、辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG；包被液：pH 9.6 0.05mol/L碳酸钠缓冲液；稀释液：1%BSA（PBS稀释）；洗涤液：pH 7.4 0.01mol/L PBS-吐温20、底物溶液：OPD-H2O2、终止液：2mol/L H2SO4、96孔酶标反应板等。
二) 操作步骤
1、包被：将羊抗人IgG抗体用包被液适当稀释，在96孔板的1-5孔中每孔加100微升，置37℃两小时后再移置4℃过夜
2、 洗涤：倾去包被液，用洗涤液PBS-吐温20加满各孔，振洗3min，倾去，如此反复3次。
3、加样：将不同浓度的人IgG分别加入1-4孔（1；1:2；1:4；1:8），5号孔做阴性对照，人IgG用PBS-T20代替，6号孔做空白对照（第一步不用羊抗人IgG抗体包被，仅检测试剂）
4、37℃孵育1h
5、 洗涤3次（同上）
6、 加辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG（其稀释度根据预试结果而定）每孔100ml，（PBS-T20稀释）
7、 37℃孵育1h。
8、 洗涤3次（同上）。
8、 显色：加新鲜配制的底物溶液，每孔100ml，在室温下避光放置10min。
9、 终止反应：每孔加2mol/L H2S04 50ml。
10、用肉眼观察每孔颜色深浅。
三）结果观察与分析
空白对照及阴性对照应无色。
参考蛋白各孔呈棕黄色，并呈明显的颜色深浅梯度。
四）注意事项
1、 在加已稀释的标准抗体时，注意更换枪头，避免将高浓度的抗体带入低浓度的孔中引起误差。
2、 应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
思考讨论：
1、ELISA操作中的注意事项。
2、什么是假阳性与假阴性？ELISA的假阳性与假阴性发生的原因有那些？
实验四 小鼠脾细胞分离、形态观察及计数
实验目的： 1. 掌握小鼠脾细胞分离技术
2. 观察小鼠脾细胞的形态并计数
实验内容： 1. 小鼠脾细胞分离
2．观察小鼠脾细胞的形态并计数
一）材料和试剂：小鼠、帆布手套、酒精、无菌剪刀、镊子及注射器活塞、一次性小号无菌培养皿、无菌PBS液、无菌红细胞裂解液、带盖的无菌离心管、计数板、显微镜、离心机、超净工作台(带紫外灯)、灭菌锅、移液枪及无菌枪头等。
二) 操作步骤
1、小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌超净台上，肚皮朝上。
2、在小鼠肚皮中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，先找到胃，再找到紧贴胃的红色长条状脾脏。
3、取出脾脏，放入盛有PBS液的一次性小号无菌培养皿中。
4、用镊子将脾脏表面的粘液等洗去，然后用镊子将脾脏转移到另一盛有少量PBS的一次性小号无菌培养皿中，用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，尽量研碎并反复用适量PBS清洗。
5、弃去PBS，加适量红细胞裂解液继续研磨。
7、弃去红细胞裂解液，用PBS重悬细胞后1000r离心5分钟。
8、用1mlPBS重悬后滴加适量在载玻片上。
8、用显微镜观察细胞形态。
注：
1.一般6-8周龄小鼠
2.手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械，在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌，此法较为简便。
思考讨论
1、如何保证分离小鼠脾细胞过程中无微生物污染？
实验五 小鼠的注射方法及血液采集方法
实验目的：练习对小鼠注射的操作方法与小鼠的采血方法
实验内容：小鼠注射的操作方法与小鼠的采血方法
一、材料和试剂
1、实验动物： 小鼠
2、实验试剂： 灭菌的生理盐水（代替实验材料，用以注射）
3、仪器或其它用具 无菌注射器（1ml），剪刀，镊子，碘酒棉花，75%的酒精棉花，消毒干棉花，无菌棉签，无菌棉球，毛细吸管，橡皮吸管头，无菌ＥＰ管，一次性手套若干，帆布手套若干。
二、操作步骤
一）小鼠注射：常用的注射途径有皮下、皮内、肌肉、腹腔和静脉等
1、取出无菌注射器及针头，吸入注射材料（本实验以生理盐水代替），并排尽空气（若材料具有传染性，则排气时以消毒棉花包住针头，以免传染材料外溢而污染环境）。
2、皮下注射：将药液推入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过程。作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。操作时，戴上手套，用右手拖鼠尾，使其爬行于较粗糙的台面或铁丝试管架的底面，再用左手拇指和食指紧抓小鼠颈部两耳之间的皮肤，将手翻转，使小鼠腹部向上，左手无名指和小指夹住鼠尾和后肢；先用碘酒棉花，后用75%的酒精棉花消毒小鼠腹部皮肤，右手持备好的注射器，针头稍平刺入皮下，把针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地注射若干生理盐水（注射快慢要适度，以免注射液溢出），注射量约为0.1～0.3ml。拔针时用无菌棉签轻压进针部位片刻，以防止药物外漏。针头拔出后，皮下呈扩散状隆起者为注射正确。
3、皮内注射：将药液注入皮肤的表皮河真皮之间，观察皮肤血管的通透性变化或皮内反应，接种、过敏实验等一般作皮内注射。操作时，戴上手套，1人固定小鼠，另1人先将注射部位的被毛剪掉，局部常规消毒，左手拇指和食指按住皮肤使之绷紧，在两指之间，用注射器针头穿刺，针头进入皮肤浅层，再向上挑起并梢刺入，将生理盐水注入皮内。注射后皮肤出现一白色小皮丘，而皮肤上的毛孔极为明显。注射量为0.1ml/次。拔针时用无菌棉签轻压进针部位片刻，以防止药物外漏。
4、肌肉注射：小鼠体积小，肌肉少，很少采用。当给小鼠注射不溶于水而混悬于油或其他溶剂中的药物时，采用肌肉注射。操作时，戴上手套，1人固定小鼠，另一人用左手抓住小鼠的1条后肢，右手拿注射器。将注射器与半腱肌呈90°角迅速插入1/4，注入生理盐水，用量不超过0.1ml。拔针时用无菌棉签轻轻按住进针部位片刻，以防止药物外漏。
5、腹腔注射：戴上手套，抓取与固定小鼠同皮下注射。使小鼠的头部向下，这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。右手持注射器，进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器官。尤其是对于体重较小的小鼠，腹腔注射时针头可以在腹部皮下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进针，穿过腹中线后在腹部的另一侧进入腹腔，注射0.1ml生理盐水，注射完后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。拔出针头后，用无菌棉签轻压注射部位。
6、静脉注射：将小鼠放在金属笼或鼠夹中，通过金属笼或鼠夹的孔拉出尾巴（也可人工国定小鼠），戴上手套，用左手抓住小鼠尾巴中部。小鼠的尾部有2条动脉和3条静脉，2条动脉分别在尾部的背侧面和腹侧面,3条静脉呈品字型分布，一般采用左右两恻的静脉.拔去沿尾部静脉走向的毛，置尾巴于45～50℃温水中浸泡几分钟或用75%酒精棉球反复擦拭尾部，以达到消毒和使尾部血管扩张及软化表皮角质的目的。行尾部静脉注射时，以左手拇指和食指捏住鼠尾两恻，使静脉更为充盈，用中指从下面托起尾巴，以无名指夹住尾巴的末梢,右手持注射器，使针头与静脉平行(小于30°角)，从尾巴的下1/3处进针，开始注入药物时应缓慢，仔细观察，如果无阻力，无白色皮丘出现，说明已刺入血管，可正式注入生理盐水（正常情况下，推注的过程应该没有明显阻力，血管也不会鼓起。推液时动作宜轻柔，若发现血管鼓起，那是针头没有刺入血管，需立即拔出针头。）。有的实验需连日反复尾静脉注射，注射部位应尽可能从尾端开始（但是进针部位也不可以太靠下，因为越往下，静脉越细，操作越难，一般以小鼠尾巴下三分之一的位置比较好），按次序向尾根部移动，更换血管位置注射给药。注射量为0.05～0.1ml/10g体重。拔出针头后，用无菌棉签轻压注射部位1～2min，防止出血。
二）小鼠采血：常用的采血方法有剪尾采血、静脉采血、摘除眼球采血、心脏采血、颌下静脉丛采血。
1、剪尾采血：戴上手套，拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠固定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈。擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用EP管接流出的血液，同时自尾根部向尾尖按摩。取血后用无菌棉球压迫止血并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。每次采血量0.1ml。此方法无需麻醉、创伤小、可重复采血，是一种简便、安全、快速的采血方法。
2、静脉采血：戴上手套，固定小鼠,将采血注射针头刺入颌下静脉丛血管取血，每次采血量可达到0.3-0.5 ml。此方法无需麻醉、创伤小、采血量大并可重复采血，是一种简便、安全、快速、采血量多的采血方法。
3、摘除眼球采血：戴上手套，左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用无菌纱布压迫止血。每次采血量0.1～0.6ml。
4、心脏采血：戴上手套，小鼠仰卧位固定，剪去胸前区被毛，皮肤消毒后，用左手食指在左侧第3～4肋间触摸到心搏处，右手持带有4~5号针头的注射器，选择心搏最强处穿刺，当刺中心脏时，血液会自动进入注射器。每次采血量0.5～0.6ml。
5、断头采血：戴上手套，右手用剪刀剪断小鼠颈部约1/2～4/5，让血液流入试管。此法可采血0.8～1.2ml。
6、颌下静脉丛采血：徒手固定法:将小鼠固定在左手中。在小鼠头部下颌部准确把握颌下静脉丛血管位置(位于下颌骨后方咬肌边缘)。酒精棉球擦拭采血部位消毒后, 将灭菌注射针头迅速刺入颌下静脉丛血管，血液即流出。采血结束, 立即用灭菌干棉球压迫止血。每次采血量0.5ml, 可重复采血。
注：
1.避免小鼠咬人，避免针头等器械伤人；
2.注射前要注意调整好注射器，在装好针头吸取注射液后，一定要排除空气，特别是注射粘性材料，如油包水乳剂时更为重要，假如有气泡存在，它将被皮肤对注射的阻力所挤压，而引起注射释放量减少，也会使残余的注射液在拔出针头时渗漏出来；
3.采血的注射器与针头及盛血的容器最好用干热灭菌法，因为如果带有水分会溶解红细胞，若用高压蒸气灭菌法，在灭菌后一定要烘干。
思考讨论：
1、如何抓小鼠既避免小鼠咬人，由使它不乱动？
2、如果注射传染性材料，应注意哪些？
3、采血所用的注射器和容器要注意些什么？
一项小鼠采血新技术—颌下静脉丛采血法
余琛琳1, 赵 乐2, 汤 球1, 崔淑芳1
( 1 第二军医大学训练部实验动物中心,上海 200433; 2 和记黄埔医药有限公司,上海)
在动物实验研究中, 特别是生理学、 药理学、 药物代谢动力学等研究中, 经常要采集实验动物的血液样本进行常规质量检测、 细胞学实验或进行生理、生化分析[1]。目前, 小鼠常用的采血方法有眼眶后静脉丛采血法、眼球摘除采血法、心脏采血法、剪尾采血法等[2],不同的采血方法适用于不同的实验用途和所需血量。本实验经过解剖、观察小鼠头部浅层血管,发现其颌下部静脉血管丰富、位置浅表,尝试并建立了小鼠颌下静脉丛采血的新方法。该方法无需麻醉、创伤小、采血量大并可重复采血, 是一种安全、快速、简便、采血量多的采血方法。
材料
实验动物: 2月龄昆明小鼠, 雌雄10只, 由第二军医大学实验动物中心提供[合格证号: SCXK(沪) 200720003]。
实验器材:灭菌6号注射针头、酒精棉球、灭菌离心管、灭菌干棉球、抗凝剂等。
方法
徒手固定法:将小鼠固定在左手中 (图1)。在小鼠头部下颌部准确把握颌下静脉丛血管位置,如图2中箭头所指位置,血管位于下颌骨后方咬肌边缘。酒精棉球擦拭采血部位消毒后, 将灭菌注射针头迅速刺入颌下静脉丛血管 (图3) , 血液即流出 (图4)。采血结束, 立即用灭菌干棉球压迫止血。 将血液收集于灭菌离心管内,编号备用(图1~ 4 见封三)。
结果
通过颌下静脉丛采血方法的应用, 单人操作采血20 次,每只小鼠采血用时约为 30~59s, 平均每次 ( 47±8) s 内即可完成对一只小鼠单次采血的整个过程。操作熟练的实验人员,可以在更短时间内完成采血过程。
使用颌下静脉丛采血法对雌雄各10只小鼠进行采血操作,每只小鼠采血量范围为0.3~ 0.5 mL，每只小鼠平均采血量可达 ( 0.38±0.07) mL。
讨论
已有的众多采血方法各有其优缺点。例如,对于体重为25 g左右的成年小鼠, 眼眶后静脉丛采血法采血量比较多, 约为0.2~ 0.3 m L, 并可重复采血,但易损伤眼球; 眼球摘除采血法采血量多,约为0.3~ 0.4 mL,但不可重复采血, 而且可致小鼠失明,易感染,止血不严时还可致小鼠死亡,同时也不符合动物福利基本原则; 心脏采血法采血量可达 0.8 mL, 但由于小鼠个体小、心脏小、心脏搏动快, 采血时位置较难固定[3], 因而操作难度系数大, 需要麻醉, 且容易因操作问题导致动物死亡; 剪尾采血法, 虽可以连续多次采血, 但每次采血量极少, 不到 0.1 mL, 不适于需要较多血量的实验[ 4 ]。
颌下静脉丛采血法主要有以下几个方面的优点: (1)采血操作方法简单, 所需实验器械简易、 普遍; (2)对小鼠损伤小,采血所需时间很短,尤其是操作熟练实验人员, 可很好的把握采血位置和深度,将损伤降至最低。本实验中,采血操作结束后,未见小鼠出现明显的行为异常和精神沉郁,均很快恢复活跃的状态,而且所有实验小鼠均正常存活; (3)血液采集量大,成年小鼠单次血量可达0.5 mL; (4)止血速度快; (5)可多次重复采集血液样本,满足对血样的不同需求。此采血方法尽量减轻了对实验动物的伤害,在倡导实验动物福利方面有着积极的意义。同时,单次0.5 mL 的采血量可以满足许多动物实验对血液样品量的要求,如血红蛋白的测定、红细胞计数、白细胞计数及白细胞分类计数、血液涂片、酶活性微量分析、血液DNA的提取等。
掌握好这项采血技术, 我们认为以下几点值得注意: (1)采集血液样品时, 如果小鼠头部和前肢摆动, 容易导致渗出的血样洒落,减少血液采集量。因而在徒手固定小鼠时,应确保其头部和前肢不能摆动, 以便更好的判断采血部位和进行血液采集。(2)采血用注射针头的大小、 进针的力度和深度要依照小鼠体重而定,并且都需要经过多次的实验和训练才能很好的把握。一般 25 g 以内小鼠, 可选用 4号、 5 号注射针头, 进针深度以 1~ 2 mm 为宜; 25 g以上成年小鼠可选用 6 号注射针头, 进针深度以3~ 4 mm 为宜。(3)采血过程都要遵循无菌操作原则, 尤其是采血用注射针刺入之前,一定要用酒精棉球擦拭采血部位, 一方面是进行消毒, 另一方面, 由于血液由下颌部被毛处流出, 有可能粘连上毛发污染血液, 而在操作时进行必要的消毒措施, 就可以避免上述情况发生, 最大程度保证血液的质量。