免疫学实验教案
授课教师：王廷璞
20##年8月27日
天水师范学院
教 案
2006～20##学年第一学期
教 案（首页）
实验一、实验动物技术
一、教学目标及其基本要求
1．动物实验对生物技术专业的学生非常重要，在其它课程中较少涉及，因此在免疫学实验中需补充动物实验方面未学到的知识和内容。
2．了解什么是实验动物、什么是动物实验及进行动物实验的方法和实验动物知识。
二、教学预案
1．在实验开始前进行人员分组，认真讲解免疫学实验的要求，实验室注意事项，事故应急处理措施，实验报告的写作要求及考核安排。
2．本实验是免疫学实验中动物部分的基础，主要以讲解为主，使学生了解什么是实验动物、什么是动物实验及进行动物实验的方法和实验动物知识。这部分知识讲解可能需2小时。
3．讲解内容包括基本概念、实验动物区别于其他动物的特点、基本技术（实验动物的抓取和固定、实验动物的编号和分组、实验动物的麻醉方法、实验动物用药量的确定及计算方法、实验动物的除毛、实验动物的给药、实验动物的采血法、实验动物各种体液、骨髓的采集方法、实验动物的处死）等内容。
4．讲解结束后进行实验操作，主要练习动物的动物的抓取和固定、静脉注射和采血，约需1.5小时。
5．对所进行的实验操作进行示范，并指导学生进行正确操作。
三、主要仪器设备
动物室、动物实验台（手术台）等。
四、耗材
兔或小白鼠、注射器、针头、酒精棉球、消毒水（新洁尔灭）等。
五、实验教学及操作内容
一、基本概念
（一）实验动物：根据1988年国家科委发布的《实验动物管理条例》所称,“实验动物是指经人工饲育、对其携带的微生物实行控制、遗传背景明确或者来源清楚的，用于科学研究、教学、 生产、检定以及其他科学实验的动物。”作为一种活的实验的材料，实验动物必须具备以下基本条件，即对实验处理的高度敏感性、个体反应的均一性和遗传上的稳定性。
（二）动物实验：动物实验（animal experiment）是指在实验室内，为了获得有关生物学、医学或兽医学方面新的知识或解决具体问题而使用动物进行的科学研究。这类研究必须由具备研究学位或专业技术人员指导或亲自实施。如博士(doctor)、硕士(master)、兽医师（veterinarian）、职业技术人员(special technician)等。
实验动物是由野生动物经驯化、培育而来，家禽、家畜也来源于野生动物。虽然家禽、 家畜和野生动物有时也被用于实验，但由于各个动物的遗传背景不清楚，健康状况有差异,机体的反应性不一致，而造成得不出可靠的实验结果,可重复性较差，不易为国内、国际学术界所公认。
二、实验动物区别于其他动物的特点
与其他动物相比，实验动物具有以下特点：
1、是遗传限定的动物(genetically defined animal)从遗传学角度看， 实验动物必须是经人工培育，遗传背景明确或来源清楚。在人工控制的条件下，实验动物经过连续的近亲繁殖,可以达到遗传基因几乎完全的纯合，而这点在野生动物则是无法做到的。依据实验动物遗传基因纯合的程度,常把实验动物划分为近交系(inbred strain) 、突变系(mutant strain)、杂交一代(hybrid F1)和封闭群(closed colony)四大类群。
2、对其携带的微生物、寄生虫实行人工控制。所有的实验动物， 在繁育过程中，都对其微生物和寄生虫进行严格的监控。根据其微生物控制的程度，目前， 我国把实验动物划分成四个等级，即一级为普通动物（conventional animal）； 二级为清洁动物（clean animal）；三级为无特殊病原体动物（specefic pathogen free animal, SPF）；四级为无菌动物（germ free animal）。
3、实验动物培育的目的主要是用于科学实验。因此， 在育种方向上不同于经济动物那样，偏重于经济价值，也不同于观赏动物注重于观赏价值。而是利用遗传学原理，培育出多种用于各种科学研究的品系动物、免疫缺陷型动物、人类疾病动物模型等。在微生物控制方面，则培育出各种无菌动物、悉生动物（gnotobiotes animal ）及科学研究需要的无特殊病原体动物等等。
三、基本技术
1.实验动物的抓取和固定
在进行实验时，为了不损伤动物的健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，首先要限制动物的活动，使动物处于安静状态，工作人员必须掌握合理的抓取固定方法。抓取动物前，必须对各种动物的一般习性有所了解。操作时要小心仔细、大胆敏捷、熟练准确、不能粗暴，不能恐吓动物，同时，要爱惜动物，使动物少受痛苦。
一、小鼠
小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。在一些特殊的实验中，如进行尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定,如尾静脉注射架或粗的玻璃试管。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作,如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。
二、大鼠
大鼠的门齿很长，在抓取方法不当而受到惊吓或激怒时易将操作者手指咬伤,所以,不要突然袭击式地去抓它，取用时应轻轻抓住其尾巴后提起，置于实验台上，用玻璃钟罩扣住或置于大鼠固定盒内，这样即可进行尾静脉取血或注射。如要作腹腔注射或灌胃等操作时，实验者应戴上棉纱手套(有经验者也可不戴)，右手轻轻抓住大鼠的尾巴向后拉，但要避免抓其尖端，以防尾巴尖端皮肤脱落，左手抓紧鼠两耳和头颈部的皮肤，并将大鼠固定在左手中，右手即可进行操作。
三、家兔
家兔比较驯服，不会咬人，但脚爪较尖，应避免家兔在挣扎时抓伤皮肤。常用的抓取方法是先轻轻打开笼门，勿使其受惊，随后手伸入笼内，从头前阻拦它跑动。然后一只手抓住兔的颈部皮毛，将兔提起，用另一只手托其臀，或用手抓住背部皮肤提起来，放在实验台上，即可进行采血、注射等操作。
因家兔耳大，故人们常误认为抓其耳可以提起，或有人用手挟住其腰背部提起均为不正确的操作。
在实验工作中常用兔耳作采血、静脉注射等用，所以家兔的两耳应尽量保持不受损伤。家兔的固定方法有盒式固定和台式固定。盒式固定适用于采血和耳部血管注射，台式固定适用于测量血压、呼吸和进行手术操作等。
四、豚鼠
豚鼠胆小易惊，抓取时必须稳、准、迅速。先用手掌扣住鼠背，抓住其肩胛上方，将手张开，用手指环握颈部，另一只手托住其臀部，即可轻轻提起、固定。
五、蟾蜍
抓取蟾蜍时，可先在蟾蜍体部包一层湿布，用左手将其背部贴紧手掌固定，把后肢拉直，并用左手的中指、无名指及小指夹住，前肢可用拇指及食指压住，右手即可进行实验操作。抓取蟾蜍时不要挤压两侧耳部突起的毒腺，以免蟾蜍将毒液射到使用者眼睛里。需要长时间固定时，可将蟾蜍麻醉或毁脑脊髓后，用大头针钉在蛙板上。
六、狗
用狗做实验时，为防止其咬伤操作人员，一般先将狗嘴绑住。对实验用狗，如毕格狗或驯服的狗，绑嘴时操作人员可从其侧面靠近并轻轻抚摸颈部皮毛，然后迅速用布带绑住狗嘴；对家养的笨狗或未经驯服的狗，先用长柄捕狗狗夹夹住狗的颈部，将狗按倒在地，再绑嘴。如果实验需要麻醉，可先使动物麻醉后再移去狗夹。当狗麻醉后，要松开绑嘴布带，以免影响呼吸。
2.实验动物的编号和分组
一、编号
实验动物常需要标记以示区别。编号的方法很多，根据动物的种类数量和观察时间长短等因素来选择合适的标记方法。
(一)挂牌法：将号码烙压在圆形或方形金属牌上(最好用铝或不锈钢的,它可长期使用不生锈),或将号码按实验分组编号烙在栓动物颈部的皮带上，将此颈圈固定在动物颈部。该法适用于狗等大型动物。
(二)打号法：用刺数钳(又称耳号钳)将号码打在动物耳朵上。打号前用蘸有酒精的棉球擦净耳朵，用耳号钳刺上号码，然后在烙印部位用棉球蘸上溶在食醋里的黑墨水擦抹。该法适用于耳朵比较大的兔、狗等动物。
(三)针刺法：用七号或八号针头蘸取少量碳素墨水，在耳部、前后肢以及尾部等处刺入皮下，在受刺部位留有一黑色标记。该法适用于大小鼠、豚鼠等。在实验动物数量少的情况下，也可用于兔、狗等动物。
(四)化学药品涂染动物被毛法：经常应用的涂染化学药品有
涂染红色：0.5％中性红或品红溶液。
涂染黄色：3-5％苦味酸溶液。
涂染黑色：煤焦油的酒精溶液。
根据实验分组编号的需要，可用一种化学药品涂染实验动物动物背部被毛就可以。如果实验动物数量较多，则可以选择两种染料。该方法对于实验周期短的实验动物较合适，时间长了染料易退掉；对于哺乳期的子畜也不适合，因母畜容易咬死子畜或把染料舔掉。
(五)剪毛法：该法适用于大、中型动物，如狗、兔等。方法是用剪毛刀在动物一侧或背部剪出号码，此法编号清楚可靠，但只适于短期观察。
(六)打孔或剪缺口法：可用打孔机在兔耳一定位置打一小孔来表示一定的号码。如用剪子剪缺口,应在剪后用滑石粉捻一下,以免愈合后看不出来。该法可以编至1～ 9999号，此种方法常在饲养大量动物时作为终身号采用。
二、分组
(一)分组的原则：进行动物实验时，经常需要将选择好的实验动物按研究的需要分成若干组。动物分组应按随机分配的原则，使每只动物都有同等机会被分配到各个实验组与对照组中去，以避免各组之间的差别,影响实验结果，特别是进行准确的统计检验,必须在随机分组的基础上进行。
每组动物数量应按实验周期长短、实验类型及统计学要求而定。如果是慢性实验或需要定期处死动物进行检验的实验，就要求选较多的动物，以补足动物自然死亡和认为处死所丧失的数量，确保实验结束时有合乎统计学要求的动物数量存在。
(二)建立对照组：分组时应建立对照组。1.自身对照组：是指实验数据而言。实验动物本身在实验处理前、后两个阶段的各项相关数据就分别是对照组和实验组的实验结果，此法可排除生物间的个体差异。2.平行对照组：有正对照组和负对照组两种。给实验组动物某种处理，而给正对照组用同样方法进行处理，但并不采用实验所要求的药物或手段，负对照组则不给任何处理。3.具体分组时，应避免人为因素, 随机把所有的动物进行编号，然后令其双数为Ａ组(实验组),单数为B组(对照组)即可或反之。如果要分若干个组时，应该用随机数字表示进行完全随机分组。
3. 实验动物的麻醉方法
麻醉(anesthesia)的基本任务是消除实验过程中所至的疼痛和不适感觉，保障实验动物的安全，使动物在实验中服从操作，确保实验顺利进行。
一、常用的麻醉药
(一)常用局部麻醉剂：普鲁卡因，此药毒性小，见效快，常用于局部浸润麻醉，用时配成0.5％～1％；利多卡因，此药见效快，组织穿透性好，常用1％～2％溶液作为大动物神经干阻滞麻醉，也可用0.25％～0.5％溶液作局部浸润麻醉。
(二)常用全身麻醉剂：
1. 乙醚 乙醚吸入法是最常用的麻醉方法,各种动物都可应用。其麻醉量和致死量相差大,所以其安全度大。但由于乙醚局部刺激作用大,可刺激上呼吸道粘液分泌增加；通过神经反射还可扰乱呼吸、血压和心脏的活动，并且容易引起窒息，在麻醉过程中要注意。但总起来说乙醚麻醉的优点多，如麻醉深度易于掌握，比较安全，而且麻醉后恢复比较快。其缺点是需要专人负责管理麻醉，在麻醉初期出现强烈的兴奋现象，对呼吸道又有较强的刺激作用，因此，需在麻醉前给予一定量的吗啡和阿托品(基础麻醉)，通常在麻醉前20－30分钟，皮下注射盐酸或硫酸吗啡(每公斤体重5～10mg)及阿托品(每公斤体重0.1mg)。
盐酸吗啡可降低中枢神经系统兴奋性，提高痛阈，还可节省乙醚用量及避免乙醚麻醉过程中的兴奋期。阿托品可对抗乙醚刺激呼吸道分泌粘液的作用，可避免麻醉过程中发生呼吸道堵塞，或手术后发生吸入性肺炎。
进行手术或使用过程中，需要继续给予吸入乙醚，以维持麻醉状态。慢性实验预备手术的过程中，仍用麻醉口罩给药，而在一般急性使用,麻醉后可以先进行气管切开术,通过气管套管连接麻醉瓶继续给药。在继续给药过程中，要时常检查角膜反射和观察瞳孔大小(如发现角膜反射消失，瞳孔突然放大，应立即停止麻醉。万一呼吸停止，必须立即施行人工呼吸。待恢复自动呼吸后再进行操作。
2. 苯巴比妥钠 此药作用持久,应用方便，在普通麻醉用量情况下对于动物呼吸、血压和其它功能无多大影响。通常在实验前半至一小时用药。使用剂量及方法为：狗腹腔注射80～100mg/kg体重，静脉注射70～120mg/kg体重( 一般每公斤体重给70～80mg即可麻醉，但有的动物要100～120mg才能麻醉,具体用量可根据各个动物的敏感性而定)。兔腹腔注射150～200mg/kg体重。
3. 戊巴比妥钠 此药麻醉时间不很长,一次给药的有效时间可延续3-5小时,所以十分适合一般使用要求。给药后对动物循环和呼吸系统无显著抑制作用，药品价格也很便宜。用时配成1～３％生理盐水溶液，必要时可加温溶解， 配好的药液在常温下放置1～2月不失药效。静脉或腹腔注射后很快就进入麻醉期，使用剂量及方法为：狗、猫、兔静脉注射30～35mg/kg体重,腹腔注射40～45mg/kg体重。
4. 硫喷妥钠 为黄色粉末，有硫臭，易吸水。其水溶液不稳定，故必须现用现配,常用浓度为1～5％。此药作静脉注射时，由于药液迅速进入脑组织，故诱导快，动物很快被麻醉。但苏醒也很快，一次给药的麻醉时效仅维持半至一小时。在时间较长的实验过程中，可重复注射，以维持一定的麻醉深度。此药对胃肠道无副作用，但对呼吸有一定抑制作用，由于其抑制交感神经较副交感神经为强,常有喉头痉挛,因此注射时速度必须缓慢。实验剂量和方法：狗静脉注射20～25mg/kg体重；兔静脉注射7～10mg/kg体重。静脉注射速度以15秒钟注射2ml左右进行。小鼠1％溶液腹腔注射0.1～0.3ml/只；大鼠0.6～0.8ml/只。
5. 巴比妥钠 使用剂量及方法：狗静脉注射225mg/kg体重；兔腹腔注射200mg/kg体重；鼠皮下注射200mg/kg体重。
6. 氨基甲酸乙酯 此药是比较温和的麻醉药，安全度大。多数实验动物都可使用,更适合于小动物。一般用作基础麻醉，如使用全部过程都用此麻醉时，动物保温尤为重要。使用时常配成20～25％水溶液，狗、兔静脉、腹腔注射0.75～1g/kg体重。但在作静脉注射时必须溶在生理盐水中，配成5％或10％溶液， 及每公斤体重注射10～20ml。鼠1.5～2g/kg体重，由腹腔注射。
以上麻醉药种类虽较多，但各种动物使用的种类多有所侧重。如做慢性实验的动物常用乙醚吸入麻醉(用吗啡和阿托品作基础麻醉)；急性动物实验对狗、猫和大鼠常用戊巴比妥钠麻醉；对家兔和青蛙、蟾蜍常用氨基甲酸乙酯；对大鼠和小鼠常用硫喷妥钠或氨基甲酸乙酯麻醉。
二、麻醉方法
(一)全身麻醉：麻醉药经呼吸道吸入或静脉、肌肉注射,产生中枢神经系统抑制,呈现神志消失，全身不感疼痛，肌肉松弛和反射抑制等现象，这种方法称全身麻醉。其特点为抑制深浅与药物在血液内的浓度有关,当麻醉药从体内排出或在体内代谢破坏后,动物逐渐清醒，不留后遗症。
1. 吸入麻醉法 麻醉药以蒸气或气体状态经呼吸道吸入而产生麻醉者，称吸入麻醉，常用乙醚作麻醉药。吸入法对多数动物有良好的麻醉效果，其优点是易于调节麻醉的深度和较快的终止麻醉，缺点是中、小型动物较适用，对大型动物如狗的吸入麻醉操作复杂，通常不用。
具体方法是：使用乙醚麻醉兔及大小鼠时，可将动物放入玻璃麻醉箱内，把装有浸润乙醚棉球的小烧杯放入麻醉箱，然后观察动物。开始动物自主活动，不久动物出现异常兴奋，不停地挣扎，随后排出大小便。渐渐地动物由兴奋转为抑制，倒下不动，呼吸变慢。如动物四肢紧张度明显减低，角膜反射迟钝，皮肤痛觉消失，则表示动物已进入麻醉，可行手术和操作。在实验过程中应随时观察动物的变化，必要时把乙醚烧杯放在动物鼻部，以维持麻醉的时间与深度。
2. 注射麻醉法 常用的麻醉药有戊巴比妥钠、硫喷妥钠、氨基甲酸乙酯等。
大、小鼠和豚鼠常采用腹腔注射法进行全身麻醉。狗、兔等动物既可腹腔注射给药,也可静脉注射给药。在麻醉兴奋期出现时，动物挣扎不安，为防止注射针滑脱，常用吸入麻醉法进行诱导，待动物安静后再行腹腔或静脉穿刺给药麻醉。
在注射麻醉药物时，先用麻醉药总量的三分之二，密切观察动物生命体征的变化，如已达到所需麻醉的程度，余下的麻醉药则不用，避免麻醉过深抑制延脑呼吸中枢导致动物死亡。
局部麻醉药阻滞周围神经末梢或神经干、神经节、神经丛的冲动传导，产生局部性的麻醉区，称为局部麻醉。其特点是动物保持清醒，对重要器官功能干扰轻微，麻醉并发症少，是一种比较安全的麻醉方法。适用于大中型动物各种短时间内的实验。
局部麻醉操作方法很多，可分为表面麻醉、局部浸润麻醉、区域阻滞麻醉以及神经干(丛)阻滞麻醉。
1. 表面麻醉 利用局部麻醉药的组织穿透作用，透过粘膜,阻滞表面的神经末梢，称表面麻醉。在口腔及鼻腔粘膜、眼结膜、尿道等部位手术时,常把麻醉药涂敷、滴入、喷于表面上，或尿道灌注给药，使之麻醉。
2. 区域阻滞麻醉：在手术区四周和底部注射麻醉药阻断疼痛的向心传导,称区域阻断麻醉。常用药为普鲁卡因。
3. 神经干(丛)阻滞麻醉：在神经干(丛)的周围注射麻醉药，阻滞其传导,使其所支配的区域无疼痛，称神经干(丛)阻滞麻醉。常用药为利多卡因。
4. 局部浸润麻醉：沿手术切口逐层注射麻醉药，靠药液的张力弥散，浸入组织,麻醉感觉神经末梢，称局部浸润麻醉。常用药为普鲁卡因。在施行局部浸润麻醉时，先固定好动物，用0.5～1％盐酸普鲁卡因皮内注射，使局部皮肤表面呈现一桔皮样隆起，称皮丘，然后从皮丘进针，向皮下分层注射，在扩大浸润范围时，针尖应从已浸润过的部位刺入，直至要求麻醉区域的皮肤都浸润为止。每次注射时，必须先抽注射器，以免将麻醉药注入血管内引起中毒反应。
三、使用全身麻醉剂的注意事项
给动物施行麻醉术时,一定要注意方法的可靠性,根据不同的动物选择合适的方法，特别是较贵重的大型动物。
1. 麻醉剂的用量，除参照一般标准外，还应考虑个体对药物的耐受性不同,而且体重与所需剂量的关系也并不是绝对成正比的。一般说，衰弱和过胖的动物，其单位体重所需剂量较小，在使用麻醉剂过程中，随时检查动物的反应情况,尤其是采用静脉注射,绝不可将按体重计算出的用量匆忙进行注射。
2. 动物在麻醉期体温容易下降，要采取保温措施。
3. 静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张、角膜反射和对皮肤夹捏的反应,当这些活动明显减弱或消失时，应立即停止注射。配制的药液浓度要适中不可过高，以免麻醉过急；但也不能过低，以减少注入溶液的体积。
4. 作慢性实验时，在寒冷冬季，麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平。
四、实验动物用药量的确定及计算方法
(一)动物给药量的确定
观察一种药物对实验动物的作用时，一个重要的问题就是给动物用多大的剂量较合适。剂量太小，作用不明显，剂量太大，又可能引起动物中毒致死。可以按下述方法确定剂量：
1. 先用少量小鼠粗略地探索中毒剂量或致死剂量,然后用小于中毒量的剂量，或取致死量的若干分之一作为应用剂量，一般可取1/10～1/5。
2. 植物药粗制剂的剂量多按生药折算。
3. 化学药品可参考化学结构相似的已知药物， 特别是化学结构和作用都相似的剂量。
4. 确定剂量后，如第一次用药的作用不明显，动物也没有中毒的表现,可以加大剂量再次实验。如出现中毒现象，作用也明显，则应降低剂量再次实验。在一般情况下，在适宜的剂量范围内，药物的作用常随剂量的加大而增强。所以有条件时，最好同时用几个剂量作实验，以便迅速获得关于药物作用的较完整的资料。如实验结果出现剂量与作用强度之间毫无规律时，则更应慎重分析。
5. 用大动物进行实验时，防止动物中毒死亡,开始的剂量可采用鼠类的1/15～1/2,以后可根据动物的反应调整剂量。
6. 确定动物给药剂量时，要考虑给药动物的年龄大小和体质强弱。 一般说确定的给药剂量是指成年动物的，如是幼龄动物，剂量应减小。如以狗为例：6 个月以上的狗给药剂量为1份时，3～6个月的给1/2份， 45～89日的给1/4份，20～44日的给1/8 份，10～19日的给1/16份。
7. 确定动物给药剂量时，要考虑因给药途径不同，所用剂量也不同。 以口服量为100时，皮下注射量为30～50，肌肉注射量为20～30，静脉注射量为25。
(二)人与动物的用药量换算方法
人与动物对同一药物耐受性不同，一般动物的耐受性要比人大，单位体重的用药量动物比人要高。必须将人的用药量换算成动物的用药量。一般可按下列比例换算：
人用药量： 1
小鼠、大鼠： 50～100
兔、豚鼠： 15～20
狗、猫： 5～10
以上系按单位体重口服用药量换算。如给药途径为静脉、皮下、腹腔注射，换算比例应适当减小些。
4.实验动物的除毛、给药方法
一、实验动物的除毛
在动物实验中，被毛有时会影响实验操作与观察，因此必须除去。除去被毛的方法有剪毛、拔毛、剃毛和脱毛等。
(一)剪毛法：剪毛法是将动物固定后，先用蘸有水的纱布把被毛浸湿，再用剪毛剪刀紧贴皮肤剪去被毛。不可用手提起被毛，以免剪破皮肤。剪下的毛应集中放在一容器内，防止到处飞扬。给狗、羊等动物采血或新生乳牛放血制备血清常用此法。
(二)拔毛法：拔毛法是用拇指和食指拔去被毛的方法。在兔耳缘静脉注射或尾静脉注射时常用此法。
(三)剃毛法：剃毛法是用剃毛刀剃去动物被毛的方法。如动物被毛较长，先要用剪刀将其剪短，再用刷子蘸温肥皂水将剃毛部位浸透，然后再用剃毛刀除毛。本法适用于暴露外科手术区。
(四)脱毛法：脱毛法是用化学药品脱去动物被毛的方法。首先将被毛剪短，然后用棉球蘸取脱毛剂，在所需部位涂一薄层，2～3分钟后用温水洗去脱落的被毛，用纱布擦干，再涂一层油脂即可。
适用于狗等大动物的脱毛剂配方为：硫化钠10g，生石灰15g，溶于100ml水中。
适用于兔、鼠等动物的脱毛剂的配方为：1. 硫化钠3g,肥皂粉1g,淀粉7g,加适量水调成糊状；2. 硫化钠8g,淀粉7g，糖4g，甘油5g，硼砂1g,加水75ml；3. 硫化钠8g溶于100ml水中。
二、实验动物的给药
在动物实验中，为了观察药物对机体功能、代谢及形态引起的变化，常需要将药物注入动物体内。给药的途径和方法多种多样，可根据实验目的、实验动物种类和药物剂型、剂量等情况确定。
(一)注射给药法
1. 皮下注射 注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入,固定后即可进行注射。一般小鼠在背部或前肢腋下，大鼠在背部或侧下腹部；豚鼠在后大腿内侧、背部等脂肪少的部位；兔在背部或耳根部注射；蛙可在脊背部淋巴囊注射；狗多在大腿外侧注射，拔针时，轻按针孔片刻，防药液逸出。
2. 皮内注射 此法用于观察皮肤血管的通透性变化或观察皮内反应。 如将一定量的放射性同位素溶液、颜料或致炎物质、药物等注入皮内，观察其消失速度和局部血液循环变化，作为皮肤血管通透性观察指标之一。方法是：将动物注射部位的毛剪去，消毒后，用皮试针头紧贴皮肤皮层刺入皮内，然后使针头向上挑起并再稍刺入，即可注射药液。注射后可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。
3. 肌肉注射 当给动物注射不溶于水而混悬于油或其他溶剂中的药物时,常采用肌肉注射。肌肉注射一般选用肌肉发达、无大血管经过的部位，多选臀部。
注射时针头要垂直快速刺入肌肉，如无回血现象即可注射。给大、小鼠作肌肉注射时，选大腿外侧肌肉进行注射。
4. 腹腔注射 先将动物固定,腹部用酒精棉球擦试消毒，然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进约0.5厘米，再使针头与皮肤呈45 度角方向穿过腹肌刺入腹腔，此时有落空感，回抽无肠液、尿液后，缓缓推入药液。此法大小鼠用的较多。
5. 静脉注射 是将药液直接注射于静脉管内，使其随着血液分布全身,迅速奏效。但排泄较快，作用时间较短。
小鼠、大鼠的静脉注射：常采用尾静脉注射。鼠尾静脉共有3根， 左右两侧和背侧各1根，两侧尾静脉比较容易固定，故常被采用。操作时，先将动物固定在暴露尾部的固定器内(可用烧杯、铁丝罩或粗试管等物代替),用75％酒精棉球反复擦试使血管扩张, 并可使表皮角质软化，以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，使静脉充盈,注射时针头尽量采取与尾部平行的角度进针。开始注射时宜少量缓注，如无阻力,表示针头已进入静脉,这时用左手指将针和尾一起固定起来，解除对尾根部的压迫后，便可进行注射。如有白色皮丘出现，说明未穿刺入血管，应重新向尾部方向移动针头再次穿刺。注射完毕后把尾部向注射侧弯曲以止血。如需反复注射，尽量从尾的末端开始。 一次的注射量为每10g体重0.1-0.2ml。
豚鼠的静脉注射：一般采用前肢皮下头静脉。鼠的静脉管壁较脆，注射时应特别注意。
兔的静脉注射：一般采用外耳缘静脉，因其表浅易固定。注射部位除毛，用75％的酒精消毒，手指轻弹兔耳，使静脉充盈，左手食指和中指夹住静脉的近心端，拇指绷紧静脉的远心端，无名指及小指垫在下面，右手持注射器，尽量从静脉的远端刺入血管，移动拇指于针头上以固定，放开食、中指，将药液注入，然后拔出针头，用手压迫针眼片刻以止血。
狗的静脉注射：狗的静脉注射多采用前肢外侧静脉或后肢外侧的小隐静脉。注射部位除毛后，在静脉血管的近心端用橡皮带扎紧，使血管充盈，从静脉的远心端将注射针头平行血管刺入，回抽注射器针栓，如有回血，即可放开像皮带，将药液缓缓注入。
6. 淋巴囊注射 蛙类常采用此法,其皮下有数个淋巴囊，注入药物甚易吸收。腹部淋巴囊和头部淋巴囊常作为蛙类给药途径。一般多选用腹部淋巴囊给药。注射时将针头从蛙大腿上端刺入，经大腿肌层入腹壁肌层，再进入腹壁皮下，即进入淋巴囊，然后注入药液。
(二)经口给药法
1. 口服法：把药物放入饲料或溶于饮水中让动物自动摄取。此法优点在于简单方便，缺点是不能保证剂量准确。一般适用于对动物疾病的防治或某些药物的毒性实验，制造某些与食物有关的人类疾病动物模型。
2. 灌胃法：在急性实验中,多采用灌胃法。此法剂量准确。灌胃法是用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内。灌胃器由注射器和特殊的灌胃针构成。小鼠的灌胃针长约4～5cm，直径为1mm，大鼠的灌胃针长约6～8cm，直径约1.2mm。灌胃针的尖端焊有一小圆金属球，金属球为中空的。焊金属球的目的是防止针头刺入气管或损伤消化道。针头金属球端弯曲成20°左右的角度，以适应口腔、食道的生理弯曲度走向。
鼠类的灌胃法：用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力,此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为3～4cm，大鼠或豚鼠为4～6cm。常用灌胃量小鼠为0.2～1ml,大鼠1～4ml,豚鼠1～5ml。
狗、兔的灌胃法：先将动物固定，再将开口器的小孔插入动物口中，再慢慢沿上鄂壁插入食道，将灌胃管的外端浸入水中，如有气泡逸出，则说明灌胃管误入气管，需拔出重插。插好后，将注射器连于灌胃管将药液推入。灌胃结束后，先拔出灌胃管，再拿出开口器。一次灌胃能耐受的最大容积兔为80～100ml，狗为 200 ～250ml。
(三)其它途径给药方法
1. 呼吸道给药：呈粉尘、气体及蒸气或雾等状态的药物或毒气,均需要通过动物呼吸道给药。如实验时给动物乙醚作吸入麻醉、用锯末烟雾制作慢性气管炎动物模型等，特别在毒理学实验中应用更为广泛。
2. 皮肤给药：为了鉴定药物或毒物经皮肤的吸收作用、局部作用、 致敏作用和光感作用等，均需采用经皮肤给药方法。如兔和豚鼠常采用背部一定面积的皮肤脱毛后，将一定的药液涂在皮肤上，药液经皮肤吸收。
3. 脊髓腔内给药：此法主要用于锥管麻醉或抽取脑脊液。
4. 脑内给药：此法常用于微生物学动物实验,将病原体等接种于被检动物脑内，然后观察接种后的各种变化。
5. 直肠内给药：此种方法常用于动物麻醉。兔直肠内给药时,常采用灌肠的胶皮管或用14号导尿管代替。
6. 关节腔内给药：此法常用于关节炎的动物模型复制。
5.实验动物的采血法
实验研究中，经常要采集实验动物的血液进行常规质量检测、细胞学实验或进行生物化学分析，故必须掌握正确的采集血液的技术。采血方法的选择，主要决定于实验的目的和所需血量以及动物种类。
一、大鼠、小鼠的采血方法
(一)剪尾采血：需血量很少时常用本法，如作红、白细胞计数、血红蛋白测定、制作血涂片等可与此法。动物麻醉后，将尾尖剪去约5mm，从尾部向尾尖部按摩，血即从断端流出。也可用刀割破尾动脉或尾静脉，让血液自行流出。如不麻醉，采血量较小。采血结束后，消毒、止血。用此法每只鼠可采血10余次。小鼠可每次采血约0.1ml，大鼠约0.4ml。
(二)眼眶后静脉丛采血：穿刺采用一根特制的长7～10cm硬的玻璃取血管,其一端内径为1 ～1.5mm，另一端逐渐扩大，细端长约1cm即可，将取血管浸入1％肝素溶液，干燥后使用。采血时，左手拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛冲血。右手持取血管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入，当感到有阻力时即停止刺入，旋转取血管以切开静脉丛，血液即流入取血管中。采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法在短期内可重复采血。小鼠一次可采血0.2～0.3ml，大鼠一次可采血0.5～1.0ml。
(三)颈(股)静脉或颈(股)动脉采血：将鼠麻醉，剪去一侧颈部外侧被毛，作颈静脉或颈动脉分离手术,用注射器即可抽出所需血量。大鼠多采用股静脉或股动脉,方法是：大鼠经麻醉后，剪开腹股沟处皮肤，即可看到股静脉，把此静脉剪断或用注射器采血即可，股动脉较深需剥离出，再采血。
(四)摘眼球采血：此法常用于鼠类大量采血。采血时,用左手固定动物,压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用镊子或止血钳迅速摘除眼球，眼眶内很快流出血液。
(五)断头采血：用剪子迅速剪掉动物头部，立即将动物颈朝下，提起动物，血液可流入已准备好的容器中。
二、豚鼠采血方法
(一)耳缘切口采血：先将豚鼠耳消毒,用刀片沿血管方向割破耳缘,切口约长0.5cm,在切口边缘涂上20％的柠檬酸钠溶液，防治血凝，则血可自切口处流出。此法采血每次可采0.5ml。
(二)背中足静脉采血：固定豚鼠，将其右或左后肢膝关节伸直，脚背消毒，找出足静脉，左手拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右手将注射针刺入静脉，拔针后立即出血。
(三)心脏采血：用手指触摸，选择心跳最明显的部位，把注射针刺入心脏，血液即流入针管。心脏采血时所用的针头应细长些，以免发生采血后穿刺孔出血。
三、兔的采血方法
(一)耳缘静脉采血：将兔固定,拔去耳缘静脉局部的被毛，消毒，用手指轻弹兔耳,使静脉扩张，用针头刺耳缘静脉末端,或用刀片沿血管方向割破一小切口,血液即流出。本法为兔最常用的采血方法，可多次重复使用。
(二)耳中央动脉采血：在兔耳中央有一条较粗的、颜色较鲜红的中央动脉。用左手固定兔耳，右手持注射器，在中央动脉的末端，沿着与动脉平行的向心方向刺入动脉，即可见血液进入针管。由于兔耳中央动脉容易痉挛，故抽血前必须让兔耳充分充血，采血时动作要迅速。采血所用针头不要太细，一般用6号针头，针刺部位从中央动脉末端开始，不要在近耳根部采血。
(三)颈静脉采血：方法同小鼠、大鼠的颈静脉采血。
(四)心脏采血：使家兔仰卧，穿刺部位在第三肋间胸骨左缘3mm处， 针头刺入心脏后，持针手可感觉到兔心脏有节律的跳动。此时如还抽不到血，可以前后进退调节针头的位置，注意切不可使针头在胸腔内左右摆动，以防弄伤兔的心、肺。
四、狗的采血方法
(一)后肢外侧小隐静脉采血：后肢外侧小隐静脉位于后肢胫部下三分之一的外侧浅表皮下，由前侧方向后行走。采血时，将动物固定，局部剪毛、消毒，采血者左手紧握剪毛区上部或扎紧止血带，使下部静脉充血，右手用连有6号或7号针头的注射器刺入静脉，左手放松，已适当速度抽血即可。
(二)前肢背侧皮下头静脉采血：前肢背侧皮下头静脉位于前脚爪的上方背侧的正前位。采血方法同上。
(三)颈静脉采血：前两种方法需技术熟练,且不适于连续采血。大量或连续采血时,可采用颈静脉采血，方法同小鼠、大鼠的颈静脉采血方法。
(四)股动脉采血：本法为采取动脉血最常用的方法。操作简便，稍加训练的狗，在清醒状态下将狗卧位固定于狗解剖台上。伸展后肢向外伸直，暴露腹股沟三角动脉搏动的部位，剪毛、消毒，左手中指、食指探模股动脉跳动部位，并固定好血管，右手取连有5号半针头的注射器，针头由动脉跳动处直接刺入血管，若刺入动脉一般可见鲜红血液流入注射器，有时还需微微转动一下针头或上下移动一下针头，方见鲜红血液流入。有时可能刺入静脉，必须重抽。抽血毕，迅速拔出针头，用干药棉压迫止血2-3分钟。
6.实验动物各种体液、骨髓的采集方法
一、消化液的采集
(一) 唾液
1. 直接抽取法 在急性实验中， 可用吸管直接插入动物口腔或唾液腺导管抽吸唾液，此法非常简单，但从口腔抽吸唾液会有杂质混入。
2. 制造腮腺瘘法 在慢性实验中,收集狗的唾液，要用外科手术方法将腮腺导管开口移向体外，即以腮腺导管为中心，切成一直径约2～3cm的圆形粘膜片，将此粘膜片，与周围组织分开，穿过皮肤切口引到颊外,将带有导管开口的粘膜片与周围的皮肤缝合,腮腺分泌的唾液就流出颊外。这种方法可以收集到较纯净的唾液。
(二)胃液
1. 直接收集胃液法 急性实验时，先将动物麻醉，将插胃管经口插入胃内,在灌胃管的出口连一注射器，用此注射器可收集到胃液,此法适用于狗等大型动物。如是大鼠,需手术剖腹，从幽门端向胃内插入一塑料管，再由口腔经食道将一塑料管插入前胃，用pH7.5、35℃左右的生理盐水，以12ml/h的流速灌胃，收集流出液，进行分析。
2. 制备胃瘘法 在慢性实验中,收集胃液多用胃瘘法,如全胃瘘法、巴氏小胃瘘法、海氏小胃瘘法等。制备小胃是将动物的胃分离出一小部分，缝合起来形成小胃，主胃与小胃互不相通，主胃进行正常消化，从小胃可收集到纯净的胃液。应用该法，可以待动物恢复健康后，在动物清醒状态下反复采集胃液。
(三)胰液和胆汁
在动物实验中，主要是通过对胰总管和胆总管的插管而获得胰液或胆汁。狗的胰总管开口于十二指肠降部，在紧靠肠壁处切开胰管，结扎固定并与导管相连，即可见无色的胰液流入导管。大鼠的胰管与胆管汇集于一个总管，在其入肠处插管固定，并在近肝门处结扎和另行插管，可分别收集到胰液和胆汁。
有时也可通过制备胰瘘和胆囊瘘来获得胰液和胆汁。
四、脑脊液的采集
(一)狗、兔脑脊液的采集通常采取脊髓穿刺法：穿刺部位在两髂连线中点稍下方第七腰椎间隙。动物轻度麻醉后，侧卧位固定，使头部及尾部向腰部尽量弯曲，剪去第七腰椎周围的被毛。消毒后操作者在动物背部用左手姆、食指固定穿刺部位的皮肤，右手持腰穿刺针垂直刺入，当有落空感及动物的后肢跳动时，表明针已达椎管内( 蛛网膜下腔)，抽去针芯,即见脑脊液流出。如果无脑脊液流出，可能是没有刺破蛛网膜。轻轻调节进针方向及角度，如果脑脊液流的太快，插入针芯稍加阻塞，以免导致颅内压突然下降而形成脑疝。
(二)大鼠脑脊液的采集可采用枕大孔直接穿刺法
在大鼠麻醉后，头部固定于定向仪上。头颈部剪毛、消毒，用手术刀沿纵轴切一纵行切口(约2cm）用剪刀钝性分离颈部背侧肌肉。为避免出血，最深层附着在骨上的肌肉用手术刀背刮开，暴露出枕骨大孔。由枕骨大孔进针直接抽取脑脊液。抽取完毕逢好外层肌肉、皮肤。刀口处可撒些磺胺药粉，防止感染。采完脑脊液后，应注入等量的消毒生理盐水，以保持原来脑脊髓腔的压力。
五、尿液的采集
常用的采集方法较多，一般在实验前需给动物灌服一定量的水。
(一)代谢笼法：此法较常用，适用于大、小鼠。将动物放在特制的笼内。动物排便时，可以通过笼子底部的大小便分离漏斗将尿液与粪便分开，达到采集尿液的目的。
由于大、小鼠尿量较少，操作中的损失和蒸发，各鼠膀胱排空不一致等原因，都可造成较大的误差，因此一般需收集5小时以上的尿液，最后取平均值。
(二)导尿法：常用于雄性兔、狗。动物轻度麻醉后，固定于手术台上。由尿道插入导尿管(顶端应用液体石蜡涂抹)，可以采到没有受到污染的尿液。
(三)压迫膀胱法：在实验研究中，有时为了某种实验目的，要求间隔一定的时间，收集一次尿液，以观察药物的排泄情况。动物轻度麻醉后，实验人员用手在动物下腹部加压，手要轻柔而有力。当加的压力足以使动物膀胱括约肌松驰时，尿液会自动由尿道排出。此法适用于兔、狗等较大动物。
(四)输尿管插管法：动物麻醉后，固定于手术台上。剪毛、消毒，于耻骨联合上缘之上在正中线做皮肤切口(长约3～4cm),沿腹中线切开腹壁及腹膜,找到膀胱翻出腹外。辨认清楚输尿管进入膀胱背侧的部位(膀胱三角)后，细心地分离出两侧输尿管，分别在靠近膀胱处穿线结扎。在离此结扎点约2cm 处的输尿管近肾段下方穿一根丝线。用眼科剪在管壁上剪一斜向肾侧的小切口，分别插入充满生理盐水的细塑料管( 插入端剪成斜面)，用留置的线结扎固定。可见到尿滴从插管中流出( 头几滴是生理盐水)，塑料管的另一端与带刻度的容器相连或接在记滴器上， 以便记录尿量。 在适用过程中应经常活动一下输尿管插管，以防阻塞。在切口和膀胱处应盖上温湿的生理盐水纱布。
(五)膀胱插管法：腹部手术同输尿管插管。将膀胱翻出腹外后，用丝线结扎膀胱颈部，阻断它同尿道的通路。然后在膀胱顶部避开血管剪一小口，插入膀胱漏斗，用丝线做以荷包缝合固定。漏斗最好正对着输尿管的入口处。注意不要紧贴膀胱后壁而堵塞输尿管。下端接橡皮管插入带刻度的容器内以收集尿液。
(六)穿刺膀胱法：动物麻醉后固定于手术台上，在耻骨联合之上腹正中线剪毛，消毒后进行穿刺，入皮后针头应稍改变一下角度，以避免穿刺后漏尿。
(七)剖腹采尿法：同穿刺法做术前准备，皮肤准备范围应大一点。剖腹暴露膀胱，操作者的左手用无齿小平镊夹住一小部分膀胱，右手持针在小镊夹住的膀胱部位直视穿刺抽取尿液。可避免针头贴在膀胱壁上而抽不出尿液。
(八)反射排尿法：适用于小鼠，因小鼠被人抓住尾巴提起时排便反射比较明显。故需采取少量尿液时，可提起小鼠，将排出的尿液接到带刻度的容器内。
六、精液的采集
(一)人工阴道采集精液(semen)：体型较大的动物，如狗、猪、羊等,可用一专门的人工阴道套在发情的雄性动物阴茎上，采集精液。也可将人工阴道置入雌性动物的阴道内，待动物交配完毕后，取出人工阴道采集精液。还可将人工阴道固定在雌性动物外生殖器附近，雄性动物阴茎开始插入时,立即将其阴茎移入人工阴道内，待其射精完毕后,采集人工阴道内的精液。
(二)阴道栓采集精液：大小鼠雌雄交配后，24小时内可在雌性动物阴道口出现白色透明的阴道栓，这是雄鼠的精液和雌鼠阴道分泌液在阴道内凝固而成的，取阴道栓涂片染色可观察到凝固的精液。
(三)其它采集精液法：将发情的雌性动物放在雄性动物一起，当雄性动物被刺激发情后，立即将雄性动物分开，再用人工法刺激其射精。也可按摩雄性动物的生殖器或用电刺激其发情中枢或性敏感区，使其射精。
七、阴道内液体的采集
(一)棉拭子法：用消毒棉拭子旋转插入动物阴道内，然后在阴道内轻轻转动几下后取出，即可进行涂片镜检。有的适用如大、小鼠等，阴道液较少，取其阴道液时，可用先浸湿后又挤尽无菌生理盐水的棉拭子取阴道液,这种棉拭子比干棉拭子容易插入阴道。对体型较大的实验动物，也可先按摩或刺激其阴部，而后再采集其阴道液。
(二)滴管法：用消毒的钝头滴管吸取少量的无菌生理盐水插入动物阴道内，然后挤出生理盐水后又吸入，反复几次，吸取阴道冲洗液滴于玻片上制片、染色镜检。
(三)刮取法：用光滑的玻璃小勺或牛角制的小刮片慢慢插入阴道内，在阴道壁轻轻刮取一点阴道内含物，进行涂片镜检。
八、胸水的采集
收集胸水常采用穿刺法。如果实验不要求动物继续存活，也可用处死动物剖胸取胸水。穿刺部位在动物脊侧腋后线胸壁第11～12肋间隙穿刺较安全。此部位是肺最下界之外侧，既可避免损伤肺组织造成气胸，又易采集在隔肋窦的胸水。此外，也可在腹侧胸壁近胸骨左侧缘第4～5肋间隙穿刺。
动物穿刺部位剪毛、消毒，操作者左手拇、食指绷紧肋间穿刺部位的皮肤，用带夹的橡皮管套上12～14号针头，沿肋骨前缘小心地垂直刺入。当有阻力消失或落空感时，表示已穿入胸腔。再接上针管，除去夹子，缓缓抽取胸水。如果有条件在穿刺针头与注射器之间连一个三通管，但应注意正确运用三通管。穿刺结束迅速拔出针头，轻揉穿刺部位，促进针孔闭合并注意消毒。
操作中严防空气进入胸腔，始终保持胸腔负压。穿刺应用手控制针头的深度，以防穿刺过深刺伤肺脏。
九、腹水的采集
抽取狗等大动物腹水，让狗按自然站立位固定，穿刺部位在耻骨前缘与脐之间，腹中线两侧。剪毛消毒，局部浸润麻醉。操作者左手姆、食指紧绷穿刺部位的皮肤，右手控制穿刺深度做垂直穿刺。注意不可刺的太深，以免刺伤内脏。穿刺针进入腹腔后，腹水多时可见因腹压高而自动流出。腹水太少可轻轻回抽，并同时稍稍转动一下针头，一旦有腹水流出，立即固定好针头及注射器的位置连续抽取。
抽取大鼠、小鼠的腹水方法简单，用左手拇指及食指捏住动物颈部皮肤，无名指、小手指及手掌夹住其尾巴固定好动物，使其腹部略朝上，在腹股沟和腹中线之间，消毒皮肤,用8号针头刺入腹腔,如腹压高腹水自然流出，如腹水太少，可借助注射器抽取。
抽腹水时注意不可速度太快，腹水多时不要一次大量抽出，以免因腹压突然下降导致动物出现循环功能障碍等问题。
十、骨髓的采集
1. 大鼠、小鼠骨髓的采集：用颈椎脱臼法处死动物,剥离出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的Hank平衡盐溶液，冲洗出胸骨或股骨中全部骨髓液。如果是取少量的骨髓作检查，可将胸骨或股骨剪断，将其断面的骨髓挤在有稀释液的玻片上，混匀后涂片凉干即可染色检查。
2. 大动物骨髓的采集：狗等大动物骨髓的采集可采取活体穿刺方法。 先将动物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮肤，然后估计好皮肤到骨髓的距离，把骨髓穿刺针的长度固定好。操作人员用左手把穿刺点周围的皮肤绷紧，右手将穿刺针在穿刺点垂直刺入，穿入固定后，轻轻左右旋转将穿刺针钻入，当穿刺针进入骨髓腔时常有落空感。狗骨髓的采集，一般采用髂骨穿刺。
狗等大动物常用的骨髓穿刺点：胸骨：穿刺部位是胸骨体与胸骨柄连接处。肋骨：穿刺部位是第5～7肋骨各点的中点。胫骨：穿刺部位是股骨内侧、靠下端的凹面处。如果穿刺采用的是肋骨，穿刺结束后要用胶布封贴穿刺孔，防止发生气胸。
7.实验动物的处死
当实验中途停止或结束时，实验者应站在实验动物的立场上以人道的原则去处置动物，原则上不给实验动物任何恐怖和痛苦，也就是要施行安乐死。安乐死是指实验动物在没有痛苦感觉的情况下死去。实验动物安乐死方法的选择取决于动物的种类与研究的课题。
一、蛙 类
常用金属探针插入枕骨大孔,破坏脑脊髓的方法处死。将蛙用湿布包住，露出头部,左手执蛙，并用食指按压其头部前端，拇指按压背部，使头前俯；右手持探针由凹陷处垂直刺入，刺破皮肤即入枕骨大孔。这时将探针尖端转向头方，向前深入颅腔，然后向各方搅动，以捣毁脑组织。再把探针由枕骨大孔刺入并转向尾方，刺入椎管，以破坏脊髓。脑和脊髓是否完全破坏,可检查动物四肢肌肉的紧张性是否完全消失。拔出探针后,用一小干棉球将针孔堵住,以防止出血。操作过程中要防止毒腺分泌物射入实验者眼内。如被射入时，则需立即用生理盐水冲洗眼睛。
二、大鼠和小鼠
1. 颈椎脱臼法：右手抓住鼠尾用力向后拉,同时左手拇指与食指用力向下按住鼠头。将脊髓与脑髓拉断，鼠便立即死亡。
2. 断头法：用剪刀在鼠颈部将鼠头剪掉，鼠立即死亡。
3. 击打法：右手抓住鼠尾,提起，用力摔击其头部，鼠痉挛后立即死去。或用木锤用力击打鼠头部也可致死。
4. 急性大出血法：可采用鼠眼眶动脉和静脉急性大量失血方法使鼠立即死亡。
5. 药物致死法：吸入一定量的一氧化碳、乙醚、氯仿等均可使动物致死。
三、狗、兔、豚鼠
1. 空气栓塞法：向动物静脉内注入一定量的空气,使之发生栓塞而死。当空气注入静脉后，可在右心随着心脏的跳动使空气与血液成泡沫状，随血液循环到全身。如进到肺动脉，可阻塞其分支，进入心脏冠状动脉，造成冠状动脉阻塞，发生严重的血液循环障碍，动物很快致死。一般兔、猫等静脉内注入20～40ml空气即可致死。每条狗由前肢或后肢皮下静脉注入80～150ml空气，可很快致死。
2. 急性失血法：先使动物轻度麻醉，如狗可按每公斤体重静脉注射硫喷妥钠20～30mg，动物即很快入睡。暴露股三角区，用锋利的杀狗刀在股三角区作一个约10厘米的横切口，把股动、静脉全切断，立即喷出血液。用一块湿纱布不断擦去股动脉切口周围处的血液和血凝块,同时不断的用自来水冲洗流血,使股动脉切口保持畅通，动物在3～5分钟内即可致死。采用此种方法，动物十分安静，对脏器无损伤，对活杀采集病理切片标本是一种较好的方法。
如果处死狗的同时要采集其血液时，则在用硫喷妥钠轻度麻醉后，将狗固定在狗手术台上。分离颈动脉，插一根较粗的塑料管，放低狗头，打开动脉夹，使动脉血流入装有抗凝血的容器内，并不断摇晃，以防血液凝固。
六、思考题
1．实验动物与动物实验的区别。
2．进行动物实验时，对实验动物有何要求？
3．不同实验动物的采血方法有何不同？
4．举例说明对一种药物进行动物实验的重要性。
七、教研室（系）主任审查意见
实验二、免疫佐剂的制备
一、教学目标及其基本要求
1．了解什么是佐剂，其作用和应用范围以及如何使用免疫佐剂等。
2．掌握弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂制备方法。
二、教学预案
1．介绍佐剂的概念及在免疫学中的作用，在抗体制备中的重要性。5min。
2．演示并逐步介绍佐剂的制备过程，制备弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。10nin 。
3．讲解操作注意事项，特别是佐剂制备过程中需耐心研磨的时间与方法。5min。
三、主要仪器设备
乳钵、超声波细胞破碎器、高压锅、冰箱等。剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。
四、耗材
石腊油、羊毛脂、卡介苗、移液管、移液器、tip 头、离心管、活卡价苗(BCG)(75mg／ml)等。
五、实验教学及操作内容
（一）佐剂的概念与原理
1．概念 佐剂（adjuvant）是指能够增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质，应用时可与抗原同时或预先注射于机体。佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免疫原性。
2．佐剂的条件 作为一种良好的佐剂，必须具备下列条件：
①增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；
②佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；
③佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能；
④良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。
常用佐剂的种类和制备：
佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。目前应用最多的是弗氏佐剂(Freund adjuvant)。
1．弗氏佐剂 弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/ml)或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂。上述佐剂经高压灭菌后，低温保存备用。
在免疫动物前，先将弗氏佐剂与抗原按一定比例混合，制备成 "油包水"乳状液。佐剂和抗原体积比一般为1：1。佐剂与抗原乳化可按如下方法进行：
（1） 研磨法：先将佐剂加热并取适量放入无菌的玻璃研钵内，待冷却后再缓缓滴入等体积的抗原溶液，边滴边按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，继续研磨一段时间，使之成为乳白色粘稠的油包水乳剂。本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。
（2） 注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。本法优点是容易做到无菌操作，适用于制备少量的抗原乳剂。 制备好的乳化剂经鉴定才能适用。鉴定方法是将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。
2．氢氧化铝佐剂 取5%硫酸铝溶液250ml，在强烈搅拌下加入5%氢氧化钠溶液100ml，用生理盐水离心洗涤沉淀2次，再悬入生理盐水中使达250ml。免疫接种时，取适量氢氧化铝佐剂加等体积抗原即可免疫。
3．明矾佐剂 钾铝矾(硫酸铝钾)在一定pH条件下产生氢氧化铝胶体吸附抗原而产生佐剂效应。制备方法是用生理盐水溶解蛋白质抗原，在搅拌下缓慢滴入一定量10%硫酸铝钾溶液，用NaOH调pH到6．5，此时溶液变成乳状悬液，离心后去掉上清液，沉淀用生理盐水洗涤二次，加入硫柳汞防腐，4℃保存备用。明矾佐剂一般用于肌肉注射，皮下注射容易引起肉芽肿和脓肿。
4．脂质体 脂质体包封抗原后，可使抗原延缓释放，并且脂质体颗粒有刺激机体免疫反应的作用。因此，用脂质体包封的抗原免疫动物可提高免疫效果。
佐剂的应用原则和评价：
应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性，从而提高抗体的效价。颗粒性抗原（如细菌、细胞）因具有较强的免疫原性，一般情况下不使用佐剂即可取得较好的免疫效果。对于可溶性大分子量的蛋白质免疫原、人工抗原，初次免疫时必须使用佐剂才能取得较好的免疫效果。另外，一般不连续两次使用完全弗氏佐剂，以免导致动物严重反应。
免疫佐剂的作用归纳起来有：①延缓抗原的释放，保护抗原不被水解，佐剂可延长抗原在体内滞留时间，避免频繁注射，有利于高亲和力抗体的产生；②活化巨噬细胞并促进巨噬细胞与T和B细胞的相互作用，从而对淋巴细胞有特异性加强刺激的作用。
由于佐剂常混有微量的其他物质，这些物质进入机体后也可引起抗体的产生，影响抗体的特异性。注射完全佐剂可引起局部炎症反应，使局部组织坏死。
（二）实验操作
1．弗氏不完全佐剂(FIA)制备：称羊毛脂10克，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中(每瓶10ml)，高压灭菌(8磅20分钟)后保存备用。
2．弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：将FIA予温(60℃30分钟)，吸取3ml于研钵中，逐滴加入活BCG(75mg／ml)0.5ml及纯化人IgG2.5ml(2.4mg／ml) 边滴边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。
注意事项
1．免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。
2．免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡(频率2900转／分，振幅6mm)；后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后，吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这两种方法约1小时即可使抗原充分乳化。
3．佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物(0.005mgN)产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对BCG过敏，尤其是豚鼠其次是家兔，当再次注射完全佐剂时,可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应的发生。
4．抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少，免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的情况下，一次注入的总剂量以0.5mg／kg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大10倍。另外，免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可较大量少次注射。
5．免疫方法上也可采用多点注射法免疫动物。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，同时于两侧肩部(或臂部)和鼠蹊部各注一处。每点注0.2ml，间隔2周后再于上述部位选不同点同上注射，也可产生高效价的免疫血清。
六、思考题
1．弗氏弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂的区别。
2．卡介苗的作用是什么？
3．比较各组所制备佐剂的优良程度，并分析原因。
七、实验原始数据
本次实验中，共使用石腊油 ml，羊毛脂 g，研磨时间 分钟，乳化程度：
教师签字：
八、教研室（系）主任审查意见
实验三、 免疫血清的制备
一、教学目标及其基本要求
1．学习利用可溶性抗原，通过免疫动物制备抗血清方法。
2．了解免疫血清制备、分离免疫血清的方法。
3．熟悉掌握动物注射与采血方法和技巧。
二、教学预案
1．讲解约需20-30分钟。
2．上次实验中存在的问题和结果分析。
3．详细介绍和演示所制备的佐剂与抗原的乳化过程。
4．教会学生进行正确的动物注射方法和采血方法。
5．介绍免疫血清的制备和分离、保存方法。
6．演示和介绍超声波细胞破碎器的正确使用方法。
7．安排实验动物的饲养和管理。（3—4周时间）
8．本实验需二至三周时间。
三、主要仪器设备
微量搅拌器、搅拌针、不同型号注射器、超声波细胞破碎器、水浴锅等。
四、耗材
人IgG、福氏完全佐剂、小白鼠、家兔、毛细吸管、酒精、碘酒、棉球等。
五、实验教学及操作内容
（一）原理
具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物(即多克隆抗体)。另外，抗体的产生具有回忆应答的规律性，初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆性B细胞参与再次应答所致。
（二）免疫方法
根据抗原的性质不同而异。下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。
1. 用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；
2. 第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。
3. 第二次免疫：间隔10-14天后，于两侧 窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧 窝及鼠蹊部皮下。
4. 间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。
5. 若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。
（三）放血
心脏采用血法
1．家兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；
2．剪去左胸部兔毛，消毒皮肤；
3．用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位；
4．用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死；
5．将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。
颈动脉放血法
1．家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤；
2．沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌；
3．分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离；
4．于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住；
5．用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱；
6．松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。
（四）分离血清
将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。
（五）结果鉴定
以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价，并用琼指免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量，应产生单一的沉淀弧线。鉴定方法的具体步骤参见有关部分。
（六）注意事项
1．免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。
2．免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡(频率2900转／分，振幅6mm)；后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后，吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这两种方法约1小时即可使抗原充分乳化。
3．佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物(0.005mgN)产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对BCG过敏，尤其是豚鼠其次是家兔，当再次注射完全佐剂时,可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应的发生。
4．抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少，免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的情况下，一次注入的总剂量以0.5mg／kg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大10倍。另外，免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可较大量少次注射。
5．免疫方法上也可采用多点注射法免疫动物。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，同时于两侧肩部(或臂部)和鼠蹊部各注一处。每点注0.2ml，间隔2周后再于上述部位选不同点同上注射，也可产生高效价的免疫血清。
六、思考题
1．制备免疫血清时应如何选择家兔？
2．抗原剂量小时应采取的免疫措施有哪些？
3．免疫实验动物时，为什么要进行多点皮下注射？
4．通过这次实验，你有何收获和体会？
5．常用的免疫途径有哪些？免疫剂量取决于哪些因素？
七、实验原始数据
家兔编号：
1．静脉采血 ml，分离阴性血清 ml。
2．家兔皮内或皮下注射抗原 ml，注射部位 。
3．家兔静脉注射抗原 ml，注射部位 。
4．注射后家兔反应：
八、教研室（系）主任审查意见
实验四、琼脂扩散试验
一、教学目标及其基本要求
1．了解双向琼脂扩散的基本原理。
2．掌握测定血清中IgG含量的方法。
3．学会用双向琼脂扩散试验测定血清中IgG含量的方法。
二、教学预案
1．讲解约需20分钟。
2．上次实验中存在的问题和结果分析。
3．讲解免疫沉淀的方法和琼脂扩散的基本原理。
4．详细讲解实验结果的判定。
5．强调移液器的正确使用。
三、主要仪器设备
载玻片、琼脂板打孔器、微量加样器、常规手术器械。
四、耗材
制备的免疫血清、琼脂粉、巴比妥、巴比妥钠、移液器、tip 头、离心管等。
五、实验教学及操作内容
（一）材料与试剂
1．琼脂粉
2．平皿
3．打孔器
4．生理盐水或其他缓冲液，可加1/万的硫柳汞或叠氮钠防腐。
（二）操作方法
1．称取一定量的琼脂粉，按1%左右（0.8％～1.5%）的比例加入生理盐水或缓冲液，水浴煮沸融化20min。
2．将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm～3mm。自然冷却。
3．根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径）按模板打孔。也可直接用组合打孔器打孔。现在一般多打成梅花形孔图。
4．挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。
5．在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。
6．以毛细滴管吸取样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。加少了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果。
7．加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿盘中，37℃自由扩散24h～48h。
（三）结果判定
1．用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同，见下图。
图 琼脂免疫扩散试验结果示意图
中间孔含A,B,C三种抗血清，a、b和a、c为不同型的抗原（呈双线或交叉），b、c为同一血清型的不同亚型（部分融合，有交叉）
2．用做血清流行病学调查时，将标准抗原置中心孔，周围1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6孔分别加待检血清。待检孔与阳性孔出现的沉淀带完全融合者判为阳性。待检血清无沉淀带或所出现的沉淀带与阳性对照的沉淀带完全交叉者判为阴性。待检孔虽未出现沉淀带，但两阳性孔的沉淀带在接近待检孔时，两端均内向有所弯曲者判弱阳性。若仅一端有所弯曲，另一端仍为直线者，判为可疑，需重检。重检时，可加大检样的量。
检样孔无沉淀带，但两侧阳性孔的沉淀带在接近检样孔时变得模糊、消失，可能为待检血清中抗体浓度过大，致使沉淀带溶解，可将样品稀释后重检。
3．用以检测的抗血清的效价时，将抗原置中心孔，抗血清倍比稀释后置周围孔，以出现沉淀带的血清最高稀释倍数为该抗血清的琼扩效价。
（四）注意事项
1．不规则的沉淀线可能是加样过满溢出、孔型不规则、边缘开裂、孔底渗漏、孵育时没放水平、扩散时琼脂变干燥、温度过高蛋白质变性或未加防腐剂导致细菌污染等所致。
2．抗原抗体的比例与沉淀带的位置、清晰度有关。如抗原过多，沉淀带向抗体孔偏移和增厚，反之亦然。可用不同稀释度的反应液试验后调节。
六、思考题
1．琼脂扩散实验中需要哪些实验器材？
2．当抗原浓度过高时，产生的沉淀线为（ ）
A．靠近抗原孔 B 靠近抗体孔 C 两个孔之间 D 不产生沉淀线
3．你所在实验成绩组的琼脂扩散试验中，出现了几条沉淀线？说明了什么问题？
4．沉淀线出现的时间一般是多少小时？
5．当两个孔之间 的沉淀线相互交叉时，说明两个孔中的抗原（ ）
A． 完全相同 B 完全不同 C 部分相同
6．琼脂扩散试验中，所用的方法是（ ）
A．单向琼脂扩散 B 双向琼脂扩散
7．琼脂扩散试验中，所用的介质是什么？
8．本次琼脂扩散试验中，目的是用（ ）
A．已知抗原检测未知抗体 B 已知抗体检测未知抗原
9．琼脂扩散试验中，沉淀线的形成需要（ ）
A．抗原浓度高 B抗体浓度高 C 抗原和抗体的浓度比例在合适时形成
七、实验原始数据
1．琼脂浓度： 2．血清稀释度；
3．血清免疫效价： 4．沉淀线出现时间：
5．沉淀线条数： 6．实验结果：
八、教研室（系）主任审查意见
实验五、免疫球蛋白的提取与纯化
一、教学目标及其基本要求
1．学会免疫球蛋白的提取和含量测定方法。
2．掌握冷酒精法提取免疫血清中IgG的原理和过程。
3．学会用紫外分光光度计法测定蛋白质的含量。
4．掌握紫外分光光度计的使用方法和原理。
二、教学预案
1．本实验内容需讲解约30min。
2．对免疫球蛋白的提取方法进行较为系统的解释。讲清本实验提取方法的原理。
3．讲解所提取免疫球蛋白含量的测定方法，教会学生使用紫外分光光度计。
4．强调离心机、微量加液器的使用。
三、主要仪器设备
离心机、紫外分光光度计、微量加样器、毛细吸管、小玻棒、离心管等。
四、耗材
免疫血清、酒精、巴比妥缓冲液、移液器、tip 头、离心管等、标准牛血清白蛋白；各种待测蛋白样品。
五、实验教学及操作内容
（一）冷酒精沉淀法提取IgG
原理：
用本方法提取免疫球蛋白主要是利用免疫球蛋白之间的分子量不同，用不同浓度的冷酒精中，在不同的离子强度中沉淀出来，然后进行纯化分离。
操作方法：
1．血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7左右，冷却到0℃。
2．在激烈搅拌的情况下，加-20℃预冷的酒精到终浓度为20%。
3．保持在-5℃约15 min，产生沉淀（A），其中含有大多数种类的免疫球蛋白。
4．5000rpm/min 离心10min，弃上清，沥干液体，将沉淀悬浮于25倍体积的0.15mol/L NaCl溶液（冷）中，加0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生沉淀（B），包含大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。
5．调节上清液pH至7.4，加-20～-30℃的冷酒精至终浓度为25%，维持在-5℃，得到沉淀（C），含有90～98%IgG。
6．5000rpm/min 离心10min，弃上清，沥干液体，将沉淀重悬于适量缓冲溶液中待用。
不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。见表。从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃ 水中，调节 pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节 上清液离子强度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在 –2℃或-3℃低温，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。
从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件
（二）紫外分光光度法测定蛋白质的含量
1．实验原理
大多数蛋白质由于有酪氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有吸收峰，可以进行蛋白质含量的测定。由于各种蛋白质中都含有酪氨酸，因此280nm的光吸收值是蛋白质的一种普遍性质。在一定程度上，蛋白质溶液在280nm的消光值与其浓度成正比，故可做定量测定。核酸在紫钱线区也有强吸收，可通过校正加以消除。
2．实验方法与操作步骤
方法1：
（1）紫外分光光度计的校正与标准曲线的制作：准确称取牛血清白蛋白10mg，用无离子水连续稀释成每亳升含50ug、40ug、30ug、20ug、10ug、5ug、1ug，以无离子水做空白对照，于280nm下测定光吸收值。以牛血清白蛋白的含量为横坐标，O.D值为纵坐标，作出蛋白标准曲线和回归方程。
（2）在紫外分光光度计下测定待测样品的光吸收值，在标准曲线上查出相应的蛋白含量。
方法2：
由于核酸在280nm也有吸收，干扰测定，但核酸的最大吸收值在260nm，可通过计算消除核酸存在的影响。该方法是以酵母烯醇酶蛋白和酵母核酸为标准建立计算公式，而不同蛋白质的氨基酸组成也不同，因而光吸收也不尽相同。这就会带来误差。
（1）取待测样品溶液置于1cm的石英比色杯中，于紫外分光光度计波长280nm和260nm。分别读取A280和A260。用无离子水作空白对照。
（2）根据下列公式计算样品中的蛋白质含量。
蛋白质含量（mg/ml）=1.5A280-0.76A260
对实验结果进行下列方面的讨论：
1 对两种方法的结果进行比较。
2 样品纯度对实验结果的影响。
3 仪器对实验结果的影响。
4 个人操作对实验结果的影响。
5 写出你对本次实验的收获和认识，存在的问题与改进方法的建议。
六、思考题
1．免疫球蛋白的提取方法有哪几种？各有何特点？
2．用紫外分光光度法测定蛋白质含量与其它方法比较有何特点？仪器对实验结果有何影响？
3．写出你对本次实验的收获和认识，存在的问题与改进方法的建议。
七、实验原始数据
1．提取IgG所用血清量 ml。 2．提取的IgG量为 ml。
3．紫外法测定蛋白质含量：（列表）
BSA： 500ug、400 ug、………10 ug
OD值：
样品OD值：
IgG含量（mg/ml）：
八、教研室（系）主任审查意见
实验六、免疫印迹技术
一、教学目标及其基本要求
1．了解免疫斑点试验的原理和操作过程。
2．掌握免疫斑点试验的方法。
二、教学预案
1．本实验内容需讲解约30min。
2．重点介绍免疫印迹技术的原理。
3．讲解本次实验所采用的方法和操作过程。
4．介绍本次实验的影响因素。
5．介绍不同酶底物显色的原理和结果判定。
6．要求在本次实验中测定出最低检出浓度。
三、主要仪器设备
移液器、恒温箱、干燥箱、塑封机、水浴箱、冰箱、脱色摇床以及其它器械。
四、耗材
硝酸纤维素膜、tip 头、离心管、Tween20、AP标记的羊抗兔IgG、硷性磷酸酶底物溶液等。
五、实验教学及操作内容
(一) 免疫斑点试验的基本原理
硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，在中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。因而，将抗原吸附于纤维素膜后，就可利用纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应。当加入抗体后(即可与膜上的抗原结合，然后再加入带有标记物的抗体，使标记通过抗抗体和相应抗体的结合间接地交联于纤维素膜上。加入标记物相应的底物后，标记物即可与底物作用形成不溶性产物,呈现斑点状着色,从而判定结果。根据所用的标记物不同，可分为：辣根过氧化物酶免疫斑点试验（使用辣根过氧化物酶作为抗抗体的标记物)，碱性磷酸酶免疫斑点试验(使用硷性磷酸酶抗硷性磷酸酶复合物作为酶标记物)和金银染色免疫斑点试验(使用胶体金作为抗抗体的标记物)等。其中，最常用的是以辣根过氧化物酶标记系统为基础的免疫斑点试验。
(二)主要材料与试剂
1. 硝酸纤维素膜(NC膜)。
2. 洗涤液：含0.5％Tween20的0.01M PBS pH7.4
0.2M Na２HPO４ 87ml ┐
0.2M NaH２PO４ 13ml │
NaCl 15.2g │─-→加H２O至2000ml
Tween 20 6ml ┘
3. 封闭液(抗体稀释液)：
1M D-glucose 19.817g（用BSA：50mg）
2ml 甘油(2％)
加含0.35％Tween20的0.01M PBS至100ml
4. 辣根过氧化物酶底物溶液
DAB（二氨基联苯胺） 5mg ┐用前取1ml（或用邻苯二胺OPD）
0.05M pH7.6 Tris-HCl 10ml┘
加3％H２O２ 0.01ml
5. 硷性磷酸酶抗硷性磷酸酶复合物(APAAP复合物)
6. 硷性磷酸酶底物溶液
(三) 免疫斑点试验的基本步骤
方法一 辣根过氧化物酶免疫斑点试验
用铅笔在NC膜上划出小方格（0.5×0.5cm）
（接触NC膜时要戴手套）
↓
将0.01M PBS pH7.4 稀释的抗原液2μl
点于硝酸纤维素膜(或醋酸纤维素膜)上
↓
置37℃温箱中干燥20～30分钟
↓
滴加封闭液37℃温盒中封闭10分钟（在杂交袋中进行）
↓
用洗涤液洗1～2次，滤纸吸干
↓
加用稀释液稀释的抗体（抗体1∶2或1∶4稀释）或待检标本，
置37℃湿盒中30分钟（在杂交袋中进行）
↓
用洗涤液震洗3次×3分钟、吸干
↓
加1∶1000倍稀释的第二抗体
↓
用洗涤液震洗3次×3分钟、吸干
↓
加底物溶液显色
↓
水洗终止反应，观察结果。出现明显棕
色斑点者为阳性（OPD产生强桔红色或棕色）
方法二 碱性磷酸酶免疫斑点试验
将0.01M PBS PH7.4 稀释的抗原液2μl
点于硝酸纤维素膜上
↓
置37℃温箱中干燥20～30分钟
↓
用封闭液37℃湿盒中封闭10分钟
↓
用洗涤液震洗1～2次，滤纸吸干
↓
加稀释液稀释的小鼠抗体或待检标本，
置室温湿盒中30分钟
↓
用洗涤液震洗3次×3分钟，吸干
↓
加1∶50稀释的兔抗鼠IgG或羊抗鼠IgG血清，
置室温湿盒中30分钟、洗同前、吸干
↓
加APAAP复合物于膜上、室温湿盒中30分
钟，洗同前、吸干
↓
加1∶50稀释的抗鼠IgG血清，置室温湿
盒中10分钟，震洗1次、吸干
↓
加APAAP复合物，温育、洗涤同“9”
↓
重复“9”和“10”1～3次
↓
洗涤液震洗3次×3分钟、吸干
↓
滴加新配底物溶液显色5～10分钟，水洗中
止反应，观察结果
(四) 免疫斑点试验的影响因素
1.包被N、C膜的抗原浓度对试验结果影响较大。多以蛋白质含量500～1000μg／ml为宜。浓度过高可出现假阳性，过低则降低试验的敏感性。
2.酶结合物浓度对试验成功与否至关重要。最适浓度常与包被抗原浓度有关，应根据试验具体条件作方阵滴定来确定。
3.显色时间，一般认为5-10分钟较好。显色时间过长常导致本底着色加深，降低试验的特异性。
4.用抗原包被NC检测抗体时，待检样品加样不宜过多。加样过多可使相邻的样品混淆，一般5～10μl即可。
六、思考题
1．辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记的第二抗体在检测中有何区别？
2．举例说明免疫印迹技术的应用范围。
3．本实验中的影响因素有哪些？
4．什么叫本底？本底过高意味着什么？实验过程中如何控制本底？
七、实验原始数据
1．抗原稀释系列浓度：
2．标记酶：
3．所用底物：
4．抗体浓度：
5．抗体稀释度：
6．第二抗体及浓度：
7．最低检出浓度：
八、教研室（系）主任审查意见
实验七、 酶联免疫吸附实验（ELISA）
一、教学目标及其基本要求
1．了解酶联免疫吸附实验的方法。
2．掌握酶联免疫吸附实验的方法，检测特定的抗体。
二、教学预案
1．本实验内容需讲解约30min。
2．重点讲解和指导酶联免疫吸附实验的原理和操作过程。
3．介绍酶标分光光度计、全自动洗板机的正确使用方法和数据分析。
4．强调双氧水、邻苯二胺、硫酸溶液的正确配制和防护措施。
5．详细介绍操作过程中应注意事项。
三、主要仪器设备
酶标分光光度计、全自动洗板机、聚苯乙烯微量塑料板、常规玻璃器械。
四、耗材
聚合OT抗原或PPD、待测血清、阳性及阴性对照血清、辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG抗体、邻苯二胺、双氧水、吐温-磷酸盐缓冲液、磷酸盐-枸橼酸缓冲液等。
五、实验教学及操作内容
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一) 原理
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二) 操作步骤
方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
方法二 用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
(三) 试剂器材
1. 试剂
(1) 包被缓冲液(pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):
NaCO31.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸馏水至1000ml
(2) 洗涤缓冲液(pH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml。
(3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克，加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。
(4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。
(5) 底物缓冲液(pH5.0磷酸柠檬酸缓冲液):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。
(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(pH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl
(7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(pH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl
(8) 抗原、抗体和酶标记抗体。
(9) 正常人血清和阳性对照血清。
2. 器材:
(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。
(四) 注意事项
1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
（2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求pH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
六、思考题
1．简述ELISA的原理和应用范围。
2．固相载体的选择对ELISA的结果和敏感性有何影响？
3．举例说明要使ELISA显色反应均一性的措施有哪些？
4．在ELISA中，不同酶的显色底物有何区别？
七、实验原始数据
见打印数据。
八、教研室（系）主任审查意见