第16节     血红蛋白电泳操作与扫描

血红蛋白的功能

1).血红蛋白（Hb）是红细胞的重要组成部分,它含有亚铁血红素等主要成分.

2).血红蛋白（Hb）在人体内主要功能是输送氧气(O2)与二氧化碳（CO2）.

血红蛋白分子结构

血红蛋白是由四个辅基(多酞链)--α,β ,δ, γ,成双成对结合组成。

      (每一辅基是由诸多氨基酸分子构成)

   两个α亚基与两个β亚基构成血红蛋白A0，A1，A3通称为 :HbA                                                 HbA  ---(α2β2 )

   两个α亚基与两个δ亚基构成血红蛋白HbA2;  A2-- (α2δ2)

   两个α亚基与两个γ亚基构成血红蛋白HbF;    F-- (α2γ2);

   两个γ亚基与两个γ亚基构成Barts蛋白带;     Barts--(γ4);

   两个β亚基与两个β  亚基构成H蛋白带(快带);  Hb H---(β4);

Ｈb分子病

    DNA分子结构改变引起基因表达式产物蛋白质分子结构和功能异常

所造成的疾病（异常血红蛋白HbS）.

   异常血红蛋白HbS目前已发现有500多种，其中约50%引起临床分子病，也是较为常见的遗传病。如：β链上第6位的一个谷氨酸(酸性基团)被颉氨酸(中性基团)取代,形成了Hb的S带(HbS);

              ---（它在碱性缓冲液中迁移率较低）.

     *突变后溶解性降低，粘滞性增加，红细胞形态改变为镰刀状，

常称之为镰状红细胞贫血。

 

血红蛋白电泳操作

一．   样品的采集与处理:

1.采用新鲜的抗凝血或2-8℃冷藏5日内抗凝血约500μL;（抗凝剂选EDTA,柠檬酸盐,或肝素）. 不使用溶血标本。              ;

2.将样品放入离心机中以5000转/分的速度旋转5分钟,使血清分离，并用移液器吸出血清弃之；

3.在各试管内加入5mL生理盐水冲洗血沉, 然后放入离心机中以5000转/分的速度旋转5分钟, 再次吸出红细胞上部的液体;

4.重复步骤(3),留下红细胞待用.

5.分别吸出红细胞15μL加注在已编号的试管内,然后再分别加入25μL生理盐水和160μL的溶血素，旋转混匀并在37℃水温箱中孵化15分钟。

预处理后的样品一定在1小时内进行电泳！

二．    电泳操作:

各步骤与血清蛋白电泳完全一样.最后的胶片如图:

血红蛋白电泳胶片中的

可能出现的所有条带:

 

 

血红蛋白异常分为:

1).异常血红蛋白病---血红蛋白分子病

2).地中海贫血(α,β地贫)

凡电泳图谱中出现H(快带),Bart’s (巴兹带), S带,D带,C带,E带,以及较深

的F带时,均应视为病理样品.

血红蛋白胶片与扫描：

            

     

正常标本的血红蛋白扫描图：

 

Hb A应大于96%

Hb A2应小于3%

Hb F 应小于1%

如果Hb F升高，出现Bart’s (巴兹带)或3% < Hb A2 < 12%多属于β地贫

如果出现 H(快带),（无S—-D带）多属于α地贫

如果出现S—-D带，或Hb A2  >12% 则应做酸化血红蛋白，此类标本属于血红蛋白分子病。

Hb质控的扫描图：

β地贫的标本实例

Hb A =90。3%

Hb A2=4。1%

Hb F  =5。6%。

下面是一个血红蛋白电泳报告单：

血红蛋白电泳胶片扫描与血清蛋白电泳完全一样！

复习题：

1．          正常血清中血红蛋白电泳胶片可能出现哪些条带？相对值是多少？

2．          简述血红蛋白电泳的操作步骤。

第二篇：血红蛋白电泳检查(电泳法)

血红蛋白电泳检查（电泳法）

1. 原理

血红蛋白是由两对多肽链组成的复杂分子。每一条链含有血红素和络合铁原子的卜啉。所有血红蛋白的血红素部分都是相同的。所测定的血红蛋白的蛋白部分称之为珠蛋白。正常人血红蛋白多肽链包括α、β、δ和γ。血红蛋白的结构、分子特性取决于形成其肽链的氨基酸顺序和性状。氨基酸不同可形成不同的血红蛋白，其表面电荷不同，在电场中的泳动率不同。本实验在碱性（PH=8.60）条件下，以琼脂糖凝胶电泳的方法进行，对红细胞洗涤后造成溶血，电泳分离血红蛋白后以氨基黑染色。多余的染色液用酸性液体洗去。待琼脂糖凝胶板干燥后，肉眼可直接判别有无电泳条带异常。运用光密度扫描仪检测准确定量分析电泳条带异常情况。血红蛋白异常有二种类型：血红蛋白性质或结构的异常称之为血红蛋白病。血红蛋白中的一条链合成减少引起血红蛋白性质异常，称之为地中海贫血。

2. 标本采集

2.1 标本采集前病人准备：受检者应空腹。

2.2 标本种类：抗凝血

2.3 标本要求：抗凝剂选用EDTA，柠檬酸或肝素均可，避免碘乙酸。常规静脉采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml的干燥。清洁试管中，充分混匀。

3. 标本储存：储存于2-8℃冰箱中，5天。

4. 标本运输：储存于2-8℃状态下的冰壶或泡沫箱密封运输。

5. 标本拒收标准：细菌污染、溶血或脂血标本不能作测定。

6. 试剂

6.1 试剂名称：血红蛋白电泳检查试剂

6.2 试剂生产厂家：法国Sebia公司

6.3 包装规格：150tests

6.4 试剂盒组成

琼脂糖凝胶 10块 溶血素 1瓶

缓冲液条带 10包×2条 薄滤纸 1×10张

氨基黑（浓缩液）1瓶×100ml 点样模具滤纸 10条×1盒

6.5 试剂储存条件及有效期：贮存于室温（15～30℃）或冰箱（2～8℃），不能冷冻。有效期两年。

7. 仪器设备

7.1 仪器名称：SEBIA电泳仪

7.2 仪器厂家：法国Sebia公司

7.3 仪器型号：HYDRASYS

8. 操作步骤

8.1 血红蛋白液制作：抗凝血离心，5000rpm，5分钟，去掉血浆，用10倍体积的生理盐水洗涤红细胞3次，若红细胞体积小于10ul，需特别小心。取10ul红细胞加入130ul溶血液造成溶血。震荡混匀10秒钟，室温下培育5分钟待测。

8.2 启动电泳仪

8.3 将加样器放在一平板上，有数字的一端向上。各加样孔加入10ul溶血的样品，2分钟内加样完毕。将加样器放入保湿盒内，齿端向上（转运时用塑料齿保护架）。等待5分钟，使样品扩散至齿端。打开电泳仪盖，抬起电极和加样器支架。

8.4 使用HYDRAGEL 15 HEMOGLOBINCE时选择仪器的“HBTOTAL”程序（位于链盘左侧）。

8.5 从包装袋内取出缓冲条，拿出末端的塑料片，将缓冲条两端塑料片固定在电极支架背侧的钉上，塑料片应紧贴支架。

8.6 取出凝胶板。将薄的滤纸轻轻吸去凝胶板表面的多余液体，然后立即丢弃滤纸。在电泳仪温度控制板表面的边线内加200ul蒸馏水或去离子水。凝胶面朝上，放置凝胶板，边缘对齐边线。略略将凝胶弯曲，然后放平，使水均匀分布在凝胶板下面而不含气泡。

8.7 降低支架，使缓冲条不接触到凝胶板。

8.8 从保温盒里取出加样器。取时拿保护框。折断加样器齿端保护框。将加样器放在4号位置。

8.9 关上电泳仪盖子，按下键盘左侧的绿色箭头“START”键，电泳开始。

8.10 凝胶染色扫描

8.10.1 打开盖子

8.10.2 取出并丢弃加样器

8.10.3 升高两个支架，握住塑料端取出并丢弃缓冲条。

8.10.4 打开凝胶托架，平放，将干燥的凝胶片放入两层间，然后关上托架。

8.10.5 将凝胶支架放入染色池

8.10.6 取出凝胶支架，打开盖子，取出干燥的凝胶片。

8.10.7 在光密度仪的570nm处或以黄色滤光片扫描测定。使用HYDRYS，DVSE或PREFERENCE光密度仪时，使A2片段的标记置于扫描板5mm的标志处。

9. 结果判断与参考范围

扫描得到的只是每种血红蛋白条带的相对浓度值。取出胶片后，首先清洁胶片的背面。判断溶血液的浓度是否合适，主要看基质带的浓度，如基质带浓度过淡，说明溶血液的浓度太淡。正常时A2浓度大约为基质带浓度的1-2倍。

半岁-成人:HbA≧94.5﹪,HbF﹤2.0％,HbA2﹤3.5％

1个月：HbA 12-40﹪,HbF 60-93％,HbA2 0.1-1.0％

6个月：HbA 86-98﹪,HbF 0.84-10.7％,HbA2 0.87-2.9％

脐带血：HbA 4-40﹪,HbF 30-96％,HbA2﹤1.0％

10. 质量控制

建议测定每一批样本时都附有一控制品或含有血红蛋白A,F,C和S的血样本。

11. 临床意义

11.1 检测β-地中海贫血

11.1.1 轻型：HbA2轻度升高，大多在4％-8％

11.1.2 中间型：HbA1A2缺如，HbF可达10％

11.1.3 重型：HbF：30％-90％，HbA多低于40％或甚至0％

11.2 检测α-地中海贫血

11.2.1 标准型α-地中海贫血：新生儿期HbBart′s可达5％-15％，几个月后消失。经煌焦油蓝温育后，少数红细胞内有H包涵体。血红蛋白电泳无异常发现。

11.2.2 血红蛋白H病：HbH在PH8.6或8.8电泳时，向阳极方向移动，泳速快于HbA;在PH6.5电泳时，仍向阳极方向移动。

11.2.3 血红蛋白Bart胎儿水肿综合症：Hb Bart′s占80％-100％，可有少量HbH。HbA、A2及F均缺如。

11.3 检测血红蛋白病：引起临床注意的异常血红蛋白有四种：S，C，E和D。

11.3.1 血红蛋白S：在碱性缓冲条件下血红蛋白S的条带位于A和A2片段之间

11.3.2 血红蛋白C：在碱性缓冲条件下血红蛋白C，E和A2的条带重叠在一起。若这一片段﹥15％，应怀疑有血红蛋白C或E的异常。

11.3.3 血红蛋白E：与血红蛋白C不同的是，E在酸性凝胶电泳中不与A2分离。

11.3.4 血红蛋白D：在碱性缓冲条件下，血红蛋白D和S的条带重叠在一起，但D在酸性凝胶电泳中不与A2分离。

12. 操作性能：灵敏度高、特异性强、操作简便，重复性好。

13. 注意事项：

13.1 试剂贮存于室温（15～30℃）或冰箱（2～8℃）内，不能冷冻。

13.2 不要应用溶血标本

13.3 若检测到异常血红蛋白，而又与常见的异常血红蛋白S,C,D或E不同，可使用其他方法（如球蛋白链电泳）检测，或求助于有关专门实验室。

13.4 HbF小于全部血红蛋白的2％-3％时，扫描检测HbF（或其它一些较少见的血红蛋白）只是半定量的，结果不十分准确。

13.5 对于中度或重度贫血的病例，点样量应增大为15ul或20ul，其结果不受影响。

13.6 电泳过程中不能打开盖子。在染色脱色以及干燥过程中，仪器的一些程序处于锁定状态。 13.7 最后染色后立即扫描测定。若欲保存，可用一保护物覆盖后置于干燥、暗处，避免受热，可保存约3个月。

[临床意义]

(1)HbA2增高是轻型β—海洋性贫血最重要的诊断依据；

(2)HbS病、β链异常的不稳定Hb病及某些巨幼细胞性贫血患者HbA2也可增高；

(3)缺铁性贫血时，HbA2常降低，可与轻型β—海洋性贫血鉴别；

(4)正常人Hb电泳后，一般只见两条区带(HbA和HbA2)，若出现新的区带，则可能为异常Hb，应进一步检查。