骨髓细胞学检查分析的原因

关于骨髓细胞学检查分析的原因,关于骨髓细胞学检查分析的相关知识. 关于骨髓细胞学检查分析的原因,关于骨髓细胞学检查分析的相关知识.(一) 增生程度估计 以涂片中有核细胞和成熟红细胞的大致比例估计骨髓增生程度,一般可分五级. (1) 增生极度活跃红细胞有核细胞为 1:1;增生极度活跃见于白血病,红白血病等. (2) 增生明显活跃红细胞有核细胞为 10:1;增生明显活跃见于白血病,增生性贫血等. (3) 增生活跃红细胞有核细胞为 20:1;增生活跃见于正常骨髓或某些贫血. (4) 增生低下红细胞有核细胞为 50:1;增生低下见于骨髓造血功能低下. (5) 增生极度低下红细胞有核细胞为 200:1;增生极度低下见于再生障碍性贫血. (二) 粒细胞系统和红细胞系统的比例关系 粒细胞系统与有核红细胞的比,简称粒,红比值.它可以估计某一系统细胞数的增减.正常粒,红比值为 2~4:1. 粒,红比值正常 可见于正常骨髓象,原发性血小板减少性紫癜,粒系统和红细胞系统同时减少(如再生障碍性贫血),多发性骨髓瘤等. 粒,红比值增高 见于幼稚红细胞减少(如单纯红细胞性再生障碍性贫血),急性化脓性细菌感染引起的粒细胞增多,类白血病样反应, 粒细胞系统白血病等. 粒,红比值降低或比例倒置 见于粒细胞减少(如粒细胞缺乏症),各种增生性贫血(如缺铁性贫血,失血后贫血,溶血性贫血等),巨幼红细胞性贫 血(如恶性贫血,营养性巨细胞性贫血,胃切除后巨幼红细胞性贫血等). (三) 正常骨髓细胞参考值 正常骨髓细胞的参考值如下表所示. 骨髓细胞参考值 髓片(%) 细胞名称 平均值 原始血细胞 原始粒细胞 早幼粒细胞 中幼 晚幼 中性粒细胞 杆状核 粒细胞系统 分叶核 中幼 晚幼 嗜酸粒细胞 杆状核 分叶核 嗜碱粒细胞 中幼 1.25 0.86 0.02 0.61 0.61 0.05 25.32 9.44 0.38 0.49 3.50 2.92 0.23 0.32 0.08 0.64 1.57 6.49 7.90 ±标准差 0.01 0.33 0.60 2.04 1.97晚幼 杆状核 分叶核 原始红细胞 早幼红细胞 中幼红细胞 红细胞系统 晚幼红细胞 早巨红细胞 中巨红细胞 晚巨红细胞 原始淋巴细胞 淋巴细胞单核 幼稚淋巴细胞 淋巴细胞 原始单核细胞 单核细胞系统 幼稚单核细胞 单核细胞 原始浆细胞 浆细胞系统 幼稚浆细胞 浆细胞 网状细胞 内皮细胞 巨核细胞 吞噬细胞 其他细胞 组织嗜碱细胞 组织嗜酸细胞 脂肪细胞 分类不明细胞 粒细胞系统:有核红细胞 检验报告中应注意各系统比例及细胞异常情况的描述. (1) 粒细胞系统0.06 0.10 0.30 0.57 0.92 7.41 10.750.07 0.09 0.05 0.30 0.41 1.91 2.360.05 0.47 22.78 0.01 0.14 3.0 0.004 0.104 0.71 0.16 0.05 0.03 0.05 0.03 0.004 0.003 0.015 2.760.09 0.84 7.04 0.01 0.19 0.88 0.02 0.16 0.42 0.21 0.09 0.06 0.09 0.09 0.03 0.02 0.04 0.87在全部骨髓细胞中所占比例,正

常约占 1/2 左右.细胞大小应无异常,核浆发育平行,胞浆中无空泡,无毒性颗粒, 细胞浆内无 Auer 小体(Auer 小体或称棒状小体,可能是异常发育的溶酶体,可见于粒细胞性白血病和单核细胞性白血病),核应 无异常等. (2) 红细胞系统 幼稚红细胞,正常约占有核细胞的 1/5 左右.正常时无巨幼红细胞发现,成熟红细胞大小,形态应无异常,胞浆无嗜 多染性,无嗜碱性点彩.无细胞内异常内涵物,如 Howell-Jolly 小体,Cabot 环等.(3) 淋巴细胞和单核细胞 所占百分比较少,前者约为 0.2(20%),小儿较高;后者约 0.04(4%)以下,成熟阶段. (4) 浆细胞 以成熟为主,多发性骨髓瘤时浆细胞增加,并出现幼稚型和形态异常(如大小差别大,出现双核或多核等). (5) 巨核细胞 在一般情况下,骨髓片中可见巨核细胞,在 1.5×3cm2 的涂片内可见 7~35 个,多为产血小板型.在原发性血小板减少 性紫癜时,巨核细胞发育停滞,非产血小板型的早期巨核细胞占多数.再生障碍性贫血时,巨核细胞减少或消失. (6) 非造血性细胞 一般数量较少,百分比很低.如非造血性细胞增多见于再生障碍性贫血,尤其急性型.骨髓报告单由以下三部分组成. 骨髓报告单由以下三部分组成.第一部分:骨髓涂片各个系统细胞计数的结果. 第二部分:骨髓涂片典型的镜下图像. 第三部分:文字报告部分,从骨髓的取材情况到各个系统细胞以及异常细胞的形态描述,最后根据各项内容并 结合临床表现及病史等得出结论. 第三部分是骨髓报告中最重要的部分,也是人们有可能看懂的部分.它又由七个部分组成: (1)骨髓取材,涂片和染色情况:主要与临床医生和检验医生的操作有关系. (2)骨髓的增生程度,粒细胞系和红细胞系的比值(M/E):正常骨髓象增生活跃,粒/红比例为 3～4:1. (3)粒细胞系的增生程度,各个阶段粒细胞的比例和形态:正常骨髓报告显示粒细胞占有核细胞的 50%～60%, 各阶段粒细胞比例,形态大致正常. (4)红细胞系的增生程度,各个阶段粒细胞的比例和形态:正常报告显示红细胞系占有核细胞的 20%左右,各阶 段红细胞比例,形态大致正常,成熟红细胞未见异常. (5)淋巴系和单核系:正常报告显示未见明显异常. (6)巨细胞系:全片所见巨核细胞数目,血小板数量及形态特点.正常时多描述为血小板不少. (7)寄生虫和特殊细胞:正常应该见不到. 如上所述,一个正常的骨髓报告基本上应该是这样的.如果您看到的骨髓报告有一部分的描述与上面的数据或 者图像描述相比有很大变化的话,可以说明那是一份异常的骨髓报告.流式细胞术介绍流式细胞仪(Flow Cytometer 简称 FCM)是一项集激光技术,电子物理技术,光电测量技术,计算机技术以及细胞荧光 化学技术,单克隆抗体技术为一体的新型

高科技仪器.概括来说,流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞 或生物颗粒进行多参数的,快速的定量分析和分选的技术.随着各相关技术的迅速发展,FCM 技术已经成为日益完善的 细胞分析和分选的工具. 我科于 2001 年初引进美国 B-D 公司的双激光四色台式机,FACSCalibur,该机是目前最先进的临床型流式细胞仪,为临床诊断和科研提供了强有力的手段.现将已开展的部分项目介绍如下. 1.淋巴细胞亚群测定 原理: 淋巴细胞分为 T 淋巴细胞(CD3),B 淋巴细胞(CD19),NK 淋巴细胞(CD16+56)三大群;T 淋巴细胞又分为 T 辅助细胞/诱导细胞(CD4),T 抑制和细胞毒细胞(CD8);以荧光标记的鼠抗人单克隆抗体来检测以上各群细胞. 临床应用:总的 T-淋巴细胞和 B-淋巴细胞百分数可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病. 了解 CD4+和 CD8+淋巴细胞的百分数有助于监测患有免疫缺陷疾病,自身免疫性疾病或有免疫反应的病人的免疫状态.患 有先天性或获得性免疫缺陷疾病例如 SCID,AIDS 的病人体内 CD4+细胞亚群的百分率相对降低,而 CD8+群体的百分率相 对升高. 在一些自身免疫性疾病和免疫反应例如急性 GVHD 和移植排斥中,T 抑制/细胞毒性淋巴细胞所占的比例有可能在正常人 的范围之外.在 SLE 病人中,CD8+淋巴细胞的相对百分比往往会降低,但当使用类固醇药物治疗时,也可能上升. CD4+/CD8+的比值可以用来评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态,此外,这 一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性 GVHD 的攻击. 研究表明,自然杀伤(NK)淋巴细胞(CD3-CD16+和/或 CD56+)能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作 用. 2.HLA-B27 测定 原理 将单克隆抗体与外周血共孵育, 裂解红细胞, 洗涤固定后, 上机检测. 在检测之前, 仪器已经 calibration beads 和 HLA-B27 calibration beads 调试成功,并通过试剂批号的后缀确定了 decision marker 的位置. HLA-B27 软件首先在 FSC-FL2 的点图上确定 CD3 强阳性细胞群体的位置,设定一个 CD3+T 淋巴细胞门,然后再根据 FSC 设定光散射门,去除 FSC 过大或过小的细胞,确保门内至少有 50%的 CD3+T 淋巴细胞,这样通过二者的结合,将随后进 行的分析严格地定位在 T 淋巴细胞上. 临床应用:HLA-B27 基因属于Ⅰ型 MHC 基因,基本上表达在机体中所有含核的细胞上,尤其是淋巴细胞的表面有丰富的 含量.早在二十多年前,人们就已发现 HLA-B27 抗原的表达与强直性脊椎炎有着高度相关性,超过 90%的强直性脊椎炎 患者其 HLA-B27 抗原表达为阳性,普通人群中仅 5-10%的为阳性,而强直性脊椎炎由于其症状与许多疾病相似而难以确 诊,因此 HLA-B27 的检测在病情的诊断中有着重

要意义.在脊椎性关节病这一类的疾病中除了强直性脊椎炎以外,还有 许多其它的疾病与 HLA-B27 抗原的表达有着或多或少的相关性,比如说 Reiter,s 综和症,HLA-B27 阳性率为 70-90%; 银屑病性关节炎,HLA-B27 阳性率为 50-60%;葡萄膜炎(眼色素层炎),HLA-B27 阳性率为 40-50%;溃疡性结肠炎伴有 关节病,HLA-B27 阳性率为 5-10%等等,因此 HLA-B27 的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标. 3.DNA 倍体分析 原理 ModFit LT 是由美国 Verity Software House 公司设计,专门用于流式细胞术中进行细胞周期分析的软件.它通过 对 DNA 含量直方图进行曲线拟合,能快速计算出各种倍体细胞的含量,细胞周期各时相及亚二倍体细胞所占的比例,DNA 指数,G0/G1 期峰的变异系数等.此外,2.0 版本还增加了"同步化分析"和"增殖分析"的功能,可分别进行同步化细 胞和增殖细胞的研究. 临床应用:细胞周期分析是细胞生物学,肿瘤学等学科重要的研究及检测指标,大量的文献已证实,DNA 细胞周期的分 析对反映一个细胞群体的增殖活性具有重要意义,尤其对肿瘤细胞周期的分析,不仅有助于研究药物的作用机理,指导 用药,还可评价预后. 4.血小板活化功能测定 原理:早期血小板活化的标志物,即活化的 gpⅡb/Ⅲa 复合物(PAC-1),其抗体与活化后血小板膜表面的 gpⅡb/Ⅲa 复合物纤维蛋白原结合位点相结合.BDIS 抗体为 IgM 型,建议使用 PAC-1 结合阻断剂 RGDS 做阴性对照.血小板活化后 期的标志物(CD62P),特异地与活化血小板结合.静止血小板胞浆内 a 颗粒含有 CD62P,血小板活化时,颗粒内糖蛋白 向膜外释放,血小板表面表达 CD62P. 临床应用:血小板活化试验,对于血小板功能,心血管疾病,脑梗塞的研究,糖尿病微血管病变有重要意义.使用流式 细胞仪进行多参数分析,可以特异灵敏地检测血小板表面标记,了解血小板的活化状态和反应性,并同时获得更多关于 血小板的信息.在疾病监测,抗血小板治疗病人的筛选及治疗监测,预测并发症等方面有良好的应用前景.5.白血病免疫分型 原理 用 CD45 与侧向角(side scatter,SSC),对数取样后可将骨髓细胞清晰地分出淋巴细胞,单核细胞,成熟粒细胞, 幼稚细胞和红细胞群,其理论依据是 CD45 是所有白细胞的抗原.其表达量在淋巴细胞最高,单核细胞,成熟粒细胞,早 期造血细胞(blasts)依次减弱.红细胞(中,晚幼红细胞,成熟红细胞)不表达 CD45.SSC 反映细胞的颗粒性,成熟 粒细胞 SSC 最高,依次为单核细胞,淋巴细胞,blasts,红细胞.以 CD45/SSC 双参数,对数取样时即可把各细胞群区分 出来.FCM 分析白血病免疫表型时,测量细胞数量一般在 10000～50000 细胞之间,而且快速,特异,准确,重复性好, 能区分细胞起源,划分其分化发育阶段等,对白血

病的诊断与分型,治疗方案选择与预后判断,发病机理研究等有重要 价值. 临床应用: 白血病,淋巴瘤诊断,分型,愈后监测. 白血病系列分化抗原 T 淋巴细胞白血病:CD3,CD5,CD7. B 淋巴细胞白血病:CD10,CD19,CD22. NK 淋巴细胞白血病:CD16,CD56,CD57. 髓系白血病:CD13,CD14,CD33,MPO(髓过氧化物酶). 红白血病:GlyA(血型糖蛋白 A). 巨核细胞白血病:CD41,CD42,CD61. 6.PNH 原理:阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是由于缺乏一系列糖化肌醇磷脂结合蛋白(GPI)锚蛋白而引起溶血性贫血.而 CD55,CD59 均为 GPI 连接蛋白的特异性标记.PNH 患者其红细胞,粒细胞,淋巴细胞表面的 CD55,CD59 抗原明显减少或 消失. 临床应用:PNH 时,CD55-/CD59-细胞增多,并可评估疗效. 7.FAS(CD95)/BCL-2(科研用) 原理 BCL-2 凋亡调控基因,定位于细胞线粒体内,是一种阻断凋亡,引发肿瘤的原癌基因.Fas 和配体 Fasl 结合时, 可以引发信号传导途经引起肿瘤细胞凋亡,是促凋亡基因. 应用:生物细胞研究,临床和基础研究,药物筛选等. 8.Annexin-v(科研用) 原理:Annexin-v 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一,它是一种磷脂结合旦白,可以与早期凋亡细胞的胞膜结合.细胞质 膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一, 在细胞发生凋亡时, 膜磷脂酰丝氨酸 (PS) 由质膜内侧翻向外侧. Annexin-v 与 PS 有高度亲和力.同时使用膜非通透性材料 PI,能将凋亡和坏死细胞区别开来. 应用:生物细胞研究,临床和基础研究,药物筛选等. 9.转铁蛋白受体(CD71) 原理: 恶性肿瘤,缺铁性贫血时,血细胞表面转铁蛋白受体增高.以鼠抗人抗体 CD71 来检测外周血淋巴细胞 CD71 的表 达率. 临床应用:其增高见于恶性肿瘤,缺铁性贫血等. 10.血小板相关抗体检测 原理:ITP 的发病机制是机体免疫系统失常,产生血小板自身抗体使血小板过度破坏 .以人血小板免疫羊,产生抗抗体, 来检测血小板自身抗体. 临床应用:诊断 ITP 和评估疗效. 11.CD34 绝对值计数(PROCOUNT) 原理 (1)获取: 软件先获取 5μl 样本,用此数据在 FL1(核酸染料)-SSC 设一个实时的门,去除碎片,并在此界限设定阈值(实验室报 告图 1),此门亦用于对照管,故对照管在实验室报告图 1 上无显示.然后软件获取 1000 个微球,再按选定的收获界限 收获细胞.(2),分析: 由于 CD34+细胞相对含量较低,流式细胞学上的特征与其他细胞群体亦有相似之外,所以需要一个利用已知祖细胞特征 的多参数设门策略,通过门的集合或逻辑门来有效地除外如粒细胞,单核细胞,碎片等不需要的细胞群体.这种分析方 法利用细胞粒度(SSC),核酸染料表达(FL1),CD45 表达(FL3),和 CD34 抗原表达(FL2)的特点帮助区分祖细胞 与其他细胞群体.图 1 为 ProCOUNT 试剂盒所有的多参数设门方法.首先确认微球群体,因为 CD34 细

胞太少,需依与其 他细胞群体关系设定 CD45 门:以单核细胞群确定门 SSC 上限,以 10%低 SSC 粒子确定右限.此门去除 CD45 强阳性细胞. 单核细胞还用于 FL2-FL3 和 FL1-FL2 图辨别 CD34 细胞群与其他群体的分界.因碎片已在获取是用阈值去除,故所有非微 球粒子均被认为是有核细胞,CD45 计数不包括 CD45 阴性细胞.前两步(3a 和 3b)通过核酸染料(FL1)去除细胞碎片, 除外所有 CD45(FL3)染色较强的细胞,从而确定祖细胞的位置.同时,不属于祖细胞的高侧向散射光(SSC)细胞群体 亦被排除在外.由此可以在 FL1(核酸染料)和 FL2(CD34)的双参数点图中清楚地看到祖细胞和其他细胞群体的区别. 围绕祖细胞群体设门,定量微粒可以完成绝对值计数的后续步骤. 临床应用:骨髓移植,外周血干细胞移植,再障的病程监测等. 12,CD28 CD28 是免疫球蛋白超家族成员之一,其分子量为 90kD,主要分布在外周血淋巴细胞. 临床意义: ① CD8+CD28+ 是细胞毒性 T 细胞(Tc)即 CTL.CTL 具有识别抗原的特性.杀伤具有特定的外来抗原(如病毒感染靶细 胞膜表面的病毒抗原).与自身 MHCI 类抗原结合的复合物的靶细胞. ② CD8+CD28- 抑制性 T 细胞(Ts).Ts 细胞不仅对 B 细胞合 成和分泌抗体有抑制作用.而且对 Th 辅助作用.对迟发型超 敏反应以及 Tc 介导的细胞毒作用都有免疫调节作用. 正常范围:CD8+CD28+:12.23 ±5.13% CD8+CD28-: 24.10±10.48%一, 流式细胞仪在白血病免疫分型诊断的概述 近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一.早年曾用过的荧光显微镜或 APAAP 方法基 本被废弃.国际上公认的通用的方法是流式细胞术(FCM).流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体 (McAb)作分子探针,多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型,由此了解被测白血病细胞所属细 胞系列及其分化程度. 1. 流式细胞仪诊断白血病的依据 ⑴ FCM 能快速,多参数,客观的定性又定量测定细胞膜,浆,核的抗原表达 ⑵ ⑶ 至今尚未发现白血病的特异抗原. 能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说.即白血病细胞基因异常,分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病.这群细胞充盈于骨髓.正常血细胞从多能干细胞分化,发育,成熟为功能细胞的过程中, 细胞膜,细胞浆或胞核抗原的出现,表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关,而且表现出与细胞系 列及其分化程度相关的特异性.因此,这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础.白血病是造血系统的恶性 肿瘤,在形态上变化虽相当大,但仍能表达正常血细胞所具有的抗原,因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫 分型.

2. 流式细胞仪诊断白血病的意义 ⑴ 骨髓血细胞是形态学分型的基础,FCM 白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化,国际白血病 MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的,对下列情况意义更大:①用形态学,细胞化学染色不能 肯定细胞来源的白血病.②形态学为急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性未分化白血病(AUL)但缺乏特异性淋巴细胞系 列抗原标记.③混合性白血病.④部分髓系白血病.目前,免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难.⑤慢性淋巴细胞白血病.⑥微小残留白血病. ⑵ ⑶ 临床预测;可根据抗原的表达情况预测病情的预后:如白血病患者有 CD7+与 CD34+共表达,预后不好. 疾病监测:可监测病程的发展,疗效,可进行微小残留白血病的检测.二,免疫分型常用的免疫标志及其意义 1.白血病系列分化抗原 T 淋巴细胞白血病:CD3,CD5,CD7. B 淋巴细胞白血病:CD10,CD19,CD22. NK 淋巴细胞白血病:CD16,CD56,CD57. 髓系白血病:CD13,CD14,CD33,MPO(髓过氧化物酶). 红白血病:GlyA(血型糖蛋白 A). 巨核细胞白血病:CD41,CD42,CD61. 2.白血病系列非特异性抗原 CD34,HLA-DR 为早期细胞抗原,无系列特异性,可与 CD38 联合运用于免疫分型.一般而言,干/祖细胞 CD34+,HLA -DR+,CD38-,原始细胞 CD34+,HLA-DR+,CD38+,而幼稚细胞(如早幼粒细胞)CD34-,HLA-DR-,CD38+. 3.白血病分化阶段抗原 T 细胞抗原 CD4,CD8. B 细胞抗原:CD10,Cyμ(胞浆 μ 链),SmIg(表面膜免疫球蛋白),CD38 和 CyIg(胞浆免疫球蛋白),CD11C. 4.白细胞共同抗原 CD45 为白细胞共同抗原,其表达量在淋巴细胞最高,单核细胞,成熟粒细胞,早期造血细胞(blasts)依次减弱.红细 胞(中,晚幼红细胞,成熟红细胞)不表达 CD45.用 SSC/CD45 PerCP 双参数分析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始 或成熟细胞.用两个系列或阶段特异性 McAb 加 CD45 进行三色免疫荧光染色,经 FSC,SSC,McAbl-FITC,McAb2-PE,CD45 PerCP 五参数分析,可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰. 三,白血病及淋巴瘤免疫分型 1.AML MO:有低的 SSC 和 FSC.在 CD45-SSC 图上出现在淋巴细胞位置上,至少表达一个特异性标志如 CD13 或 CD116,但 MPO 比 CD13 与 CD33 更灵敏.一般淋系标志阴性,但也可表达 CD7 或 CD4.一般 HLA-DR,CD34 阳性,有些研究表明 CD7 与 CD34 共表达在 AML 且预后差. M1:流式上 M1 与 M0 相似不易区分,M1 一般 CD13+,CD33+,HLA-DR-,但 CD34 表达少于 M0,可能表达部分 CD15. M2: M0 与 M1 的主要区别是成熟度增加,blasts 减少,CD15 较 M1 较显著,CD34 弱于 M1,CD13 有时表达强于 CD33,多 数病例 HLA-DR -) CD45-SSC 图显示从髓系 blast 区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带, ( . CD45-SSC 图有助于确定 blasts 比例. M3, 高颗粒性, 具较高的 S

SC, CD45 较成熟 C 少, 但 多数情况 HLA-DR (-) 或表达减少, CD34 少于 M2, 一般 CD13 弱 (+) , 可有 CD2 表达. M4 与 M5:两型表型相似,但 M4 较 M5 表达更多的 CD34(+),较之 M0,M1,M4 与 M5 有更大的 FSS 和 SSC,CD45-SSC 图上,成熟 C 出现在单核区,重要的表型为 CD13,CD33,HLA-DR,CD14 和 CD15,CD33 可表达强于 CD13,CD33(+), CD13(-),CD34(-)很可能为 M5,但只出现在少数病人中,部分 M5 可见 CD56(+). M6: M6 较少见且特征不明显,一般 HLA-DR,CD34,CD13,CD33 阳性,CD45-SSC 图显示主要为红系成份. M7: 巨核细胞白血病,在 AML 中少于 1%.一般 CD61(GpⅢa)和/或 CD41(GpⅡb-Ⅲa)阳性,而注意由于血小板粘附 在 blasts 上造成的假阳性,可以用流式双色分析在 EDTA 存在下,测 GpⅡb/Ⅲa 与 CD34 以减少激活血小板的粘附. 2.ALL: ALL 是儿童中最常见的恶性肿瘤,约占全部肿瘤的 25%,在成人,ALL 约占急性白血病的 25%,我们将 ALL 分为 B 祖细 胞型,CD10+或 CD10-,前 B 细胞型,B 细胞型,T 细胞型. B 祖细胞型 ALL: 在幼儿约占 ALL 的 65%～70%, 青少年为 55%～60%, 成人为 50%. 在儿童, 90%病例 CD10+, 约 在幼儿只有少于 50%病例 CD10+,blasts 一般 FSC,SSC 很少,是 FAB 标准的 L1 或 L2,一般 TdT(+)HLA-DR(+),CD19(+),此型又分为 2 个 亚型,CD10+和 CD10-,前者预后好,多数病例 CD24+,CD34+,CD20 表达随成熟度增加而增加,B 祖细胞被定义为 sIg-. 前 B 细胞型 ALL: 此亚型约占儿童 ALL 的 25%,细胞一般为 CD19+,CD24,HLA-DR+,胞浆 CD22+,CD10+,TdT 随 CD20 变化,CD34 多为阴性, B 亚型被认为比 B 祖型预后更差, 前 这与 t(1; 19)出现相关并由此产生 E2A-PBX1 融合蛋白, 它的表型为 CD19 +,CD10+,CD9+,不同程度 CD20 表达,CD34-,确认此表型有助于诊断基因上不确定的病例. B 细胞型 ALL: 成熟 B 细胞型 ALL 约占 ALL2%～5%,B 细胞型 ALL 较之 B 祖细胞型 ALL 有更大的 FSC 和 SSC,在 CD45-SSC 图上出现在 淋巴和单核细胞区域,即 FAB 标准的 L3,表型为 CD19,CD20,CD22,CD24 且 sIg(多数为 IGM)多数病例 CD10+.但成 熟抗原及 sIg 使之区别于更早的 B 系 ALL,极少数成熟 B 细胞 ALL 无 FAB-L3 形态. T-ALL:多数病例有大的 FSC,SSC,在 CD45-SSC 图上可能出现在淋系未成熟细胞和髓系未成熟细胞或单核细胞区,多 数表现为胸腺亚型,最常见亚型为皮质晚期表达,CD1,CD2,CD5,CD7,CD4/ CD8 双阳与极少膜表面 CD3,TdT 多为阳 性. 另一常见亚型为皮质早期表达 CD2, CD5, CD7, 强表达. TdT 髓质期亚型表达 CD2, CD5, CD7, CD3+CD4+/CD3+CD8+, 与 很少见 TdT 表达.前 T 细胞亚型,表达 CD7 胞浆 CD3+且无其它 T 细胞抗原,T 细胞肿瘤的特征是丧失 T 细胞抗原而表现 出其它异常抗原组合. 杂合型白血病: 随着流式技术的广泛应用, 我们发现许多病例并不能严格划分为淋系或髓系, 真正的双表型病人多为 t(9; 22)或 (11q23) , 现在杂合型的误

诊率很高.最常导致误诊的原因是在分析中未能排除非白细胞,过度强调弱的非特异性结合,忽略了某 些抗体缺乏系特异性,最重要的系特异性抗原在 B 系,T 系,髓系分别为 CD22,CD3 和 MPO. 3.CML: 由于慢性期显著的细胞分化,在 CD45-SSC 图上除了髓系细胞占主导外,只显示一个正常骨髓像,CML 可确诊,CML 起病 与发展相对缓慢,慢性期的持续 1 年左右最终发展为加速期和急变期.流式细胞技术对急变期亚型的诊断具有极高价值. 直接影响到治疗效果. 急变期 CML 主要表现为髓系, 偶为淋系, 髓性急变可表现出多种形态包括未分化细胞. 淋性急变具典型形态特征, CD10 为 +B 祖细胞 ALL 极少有 T 细胞型 ALL. 4.CLL: CLL 细胞主要为较正常淋巴细胞稍大的小淋巴细胞. 免疫分型主要为: SIgM, SIgD 弱表达, 系抗原为 CD19, B CD20, CD43, CD79a 与 CD5 共表达,CD23 表达使得 CLL 区别于帽细胞淋巴癌 MU,即(CLL:CD23+,MCL:CD23-),CD10-,CD23-, CD11c 和 CD25,CD20 常弱表达,尽管 CLL 起病慢,但 CLL 病人的生存率变化很大,有染色体异常的病预后不良,最常见 的三联体 trisony12,14q,13q,11q,免疫表型上没有特异的变化而免疫表型的变化并不是提示染色体异常.最近,有 研究表明,三联体 trisony12 与 SIg,CD20 表达量高度相关,与 CD23-相关 与 FMC7 相关. B 型前淋巴细胞白血病(B-DLL)较 CLL 更为严重,流式细胞技术在区分 B-DLL 和 CLL 上发挥很大作用,B-DLL 多为 CD5-,CD22+,表达更强的 sig. MU 病人平均生存率不超过 5 年,与 CLL 在形态上很难区分,与 CLL 相似有 CD5+B 祖细胞,但 Sig 表达强于 CLL,且 CD22 -. 另一与 CLL 难于区分的是 FCC,细胞为强 Sig,CD5-,CD10+,CD23+,具 B 系表型:对于诊断为 CLL,CD5,FMC7,CD22 与 SIg,CD20 异常强表表达的病例我们要考虑是否为 DLL,MCC 或 CLL 的亚型(trisomy12)因为它们危险性更大. 四,流式细胞仪免疫分型实验 1.样本采集,运输,保存和操作 ⑴样本类型:适用于多种临床标本,如外周血,骨髓穿刺液,骨髓活检物,淋巴样组织活检物,浆液,脑脊液,皮肤, 黏膜(内窥镜活检物),细针穿刺物等等. ⑵抗凝剂的选择: 外周血标本可采用 EDTA, 或肝素抗凝. ACD 如果用同一份血标本做白细胞计数和流式分析, 则应用 EDTA 抗凝.骨髓穿刺可用肝素.其他体液用 EDTA,ACD 或肝素均可,但保存的样本活性可能会降低,EDTA 的优点是成熟髓性细胞贴壁造成的损失及血小板聚集较小,但细胞散射光特征丢失较肝素标本快;由于相对大量的 ACD 会通过改变 pH 而影 响骨髓细胞活性问题,通常不推荐用 ACD 做骨髓穿刺抗凝剂. ⑶样本的保存:样本的完整性和细胞活性与抗凝剂的选择,运输,保存和温度息息相关. ①理想状态下,样本应在采集后立刻进行处理和染色. ②短期保存(1 小时或更短)应在室温(18-22℃);

③长时间保存血或骨髓标本室温即可,有些样本可能 4℃为佳. ④标本保存的时间上限取决于标本类型及其保存条件. ⑤肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至 48-72 小时; ⑥EDTA 抗凝的血和骨髓可保存至 12-24 小时. ⑦ACD 抗凝的血和骨髓可保存至 72 小时,但 ⑧对于只做胞内染色的样本, 可固定细胞以长期保存. 但?quot;固定-染色"的方法取决于要分析的抗原特性和染色方式, 采用之前一定要进行新鲜标本的对照和验证实验. 2.样本制备 ⑴单细胞悬液的制备 ①血和骨髓:天然单细胞悬液.当有血凝块时,应用 50um 尼龙网过滤,同时进行细胞计数和血涂片以判断靶细胞群体是 否仍然存在. ②组织块:机械分离和酶分离两种方法.分离不仅是要获得最大产量的单细胞悬液,还要尽量保证细胞结构的完整性和 抗原性.大多数淋巴样组织可用轻柔的机械方法快速分离,并保持收获细胞的相对完整.某些组织由于细胞间连接紧密, 需在机械分离的基础上用蛋白水解酶如胰蛋白酶,胃蛋白酶.骨髓标本亦可能因骨细胞成分污染而需要酶消化.但使用 酶法一定要确认酶的使用没有改变,减弱靶抗原的表达,细胞活性没有显著降低. ⑵分离靶细胞群体 样本的任何处理方式都可能导致靶细胞群体的丢失.所以应尽可能使用最接近原始标本状态的处理过程.去除红细胞是 流式分析要求的至少步骤.两种方法: ① 红细胞裂解:较佳.操作简单,快,并最可能保持原始标本的白细胞分布.溶血剂的选择应基于其选择性去除成熟红 细胞而最小程度的影响其他细胞的特点.最好在染色后溶血.若在染色前溶血,需确认:抗原性不被溶血过程改变; 溶 血剂被彻底洗去, 细胞和抗体结合的动力反应未受影响; 所用溶血剂不含固定剂, 否则会影响细胞活性及表面标记结果 . ② 度梯度离心:白血病细胞回收较好并可能得到富集,同时去除死细胞.但费时,白血病细胞的相对频率较难分析,某 些重要细胞群体可能选择性丢失.根据密度梯度原理,若白血病细胞没有与淋巴细胞相似的浮力密度即可能丢失.所以 用此方法时应检查各层细胞特性以防止靶细胞的丢失. ⑶估细胞悬液 ①样本外观:有严重溶血和血凝块的标本可能会有白细胞的损坏以及细胞亚群的丢失或改变,应弃用. ②细胞丢失和分布:确认细胞形态和原始标本相似.密度梯度离心之后更应检查细胞分布.可做血涂片判断. ③细胞计数和浓度调整:厂家推荐的抗体浓度通常是假定靶细胞数量在正常范围内 (500,000-1,000,000/testAb).白 细胞数量上的显著变化会带来染色模式的变化.而白血病标本常常有异常的白细胞数量,骨髓标本也可能被外周血稀释, 这些标本的细胞性可能有极大的变异.因此有些标

本没有足够的细胞做流式分析,有些则由于细胞量大,正常浓度下的 抗体相对不足, 不能饱和所有的结合位点, 导致假阳性结果. 所以染色前的细胞计数非常必要. 推荐方法: WBC<1000/uL: 用 200uL 全血并调整相应溶血剂用量;WBC:1000-10000/uL, 用 100uL 全血并用溶血剂标准量;WBC:10000-20000/uL, 用 50uL 全血并调整相应溶血剂用量; WBC>20000/uL,用稀释至(2)(3)范围内.骨髓标本常常要在 PBS 1:10 稀释后计数. 应该指出,由于不同的标本中不同系列的细胞比例不同,调整细胞总数不一定合适每一个系列特异的抗体.实验室若选 择不同于厂家推荐的方法(如自己稀释抗体),抗体一定需要进行测试以得到抗体和细胞的最佳比率. ④细胞活性:死细胞对许多抗体有非特异性染色,有些抗原同时存在于胞膜和胞浆,这就使样本的细胞活性检测变得重 要,尤其毖揪顺な奔涞脑耸浜痛⒋妫蚨匝镜闹谱鞴滩惶宄薄<觳獾姆椒ㄍ ǔS辛街郑阂皇鞘凳钡牧魇 郊觳猓豪糜馊玖螾 I,7-AAD 或 EMA(ethidium monoacide).活细胞将拒染这些染料.此方法的优势是细胞表面标 志和活性分析可同时进行,通过设门即可得到活细胞的染色特性.尤其适用于高度坏死的样本.样本染色后需固定.应在加固定剂之前洗去多余的 7AAD,以保证区分的是固定前细胞的死活状态.但随着时间延长,7AAD 会在固定的细胞群体 重新分配,死活细胞的区分变难.对于染色后常规固定并在固定后 12 小时以上分析的标本,最好用 EMA.EMA 与死细胞 DNA 稳定的共价结合保证了长时间固定后仍能很好地区分固定前的死活状态.二是手工检测:使用 Trypan blue 或其他 细胞活性染料. ⑷细胞染色 ①细胞表面染色:大多数可帮助白血病免疫分型的抗原都在细胞膜上.但由于许多抗原也同时存在细胞内,所以在细胞 表面抗原检测时应特别注意保持细胞膜的完整以保证检测的特异性.例如免疫球蛋白重链在细胞内和表面的存在有着不 同的意义,检测表面标记必须是未固定的活细胞. ②细胞内染色:有些胞内特异性抗原的检测对白血病的免疫分型尤为重要,如 TdT, MPO, cCD3, cCD22, 以及胞浆内 Ig 的表达.胞内染色的关键是使细胞膜通透,把抗体导入胞浆而不影响细胞结构的完整性.要保证固定和透膜的步骤不影 响有关标记的抗原性以及和抗体的结合. ③胞膜和胞内的同时染色:通常,先胞膜染色,固定,膜通透和胞内染色,最 后是 DNA 染色.固定剂和通透剂都可能对细胞和参数有不同的多重影响,应根据情况选择.每一步染色对荧光素的选择 和抗体的选择都很重要.如,用于表面标记的荧光素应不被随后的固定和通透步骤所影响,而对于胞内染色,所用的荧 光素应足够小能穿透到胞膜内. 3. 抗体组合的确定: 选择抗体