揭阳市卫生学校实验报告
吸收光度曲线的绘制
一、配制两种浓度的高锰酸钾溶液：C1 、C2各3ml.。
二、测A值
400~500nm每隔20nm 500~510nm每隔10nm 510~560每隔2nm 560~600nm每隔20nm
三、绘制曲线，A为纵坐标，波长n为横坐标。
11检验班 28号 洪英福
第二篇：酶 生化试验报告
生物大分子·酶
——相关生化实验报告
小组成员：王书洋 张斌 贾官斐 杨翀 左天宇
单位：武警后勤学院临床医学系四队 四班
邮编：300162
关键词 淀粉酶; 活性; 温度; 抑制剂; 激活剂; 专一性
【前言】 目前临床主要以检测指标作为依据对疾病的诊断作出较为准确的判断。其中，酶学上的应用占了相当一部分。所以，从临床疾病诊断以及治疗的角度去对酶学知识的具体化了解和应用深化是十分有必要的。酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化。因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。对酶活性的测定对临床诊断以及基础医学的研究都有着重要意义。很多酶其实包含几种具有同样催化效用的蛋白质，但它们的分子组成、理化性质与免疫学特性却有明显差异，这类蛋白质统称为该酶的同工酶。同工酶在组织和器官中的分布不同，通过测定不同同工酶的含量与活性的变化，可以推算出改组织和器官的变化。本综述旨在对后文的三次实验作为基础医学和临床医学的一次应用上的联系。
实验一影响酶促反应速度的因素
【实验原理】
唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各种糊精和麦芽糖。淀粉溶液与碘反应呈蓝色；糊精根据分子大小，与碘反应分别呈蓝、紫、红、无色等不同的颜色；麦芽糖不与碘呈色。唾液淀粉酶的活性受温度、酸碱度、抑制剂与激活剂等的影响。
温度：温度降低，酶促反应减弱或停止；温度升高，反应速度加快。当上升至某一温度时，酶促反应速度达最大值，此温度称为酶的最适温度。由于酶的化学本质是蛋白质，温度过高会导致蛋白质构象的改变，因此如果温度继续升高，反应速度反而会迅速下降甚至完全丧失。
酸碱度：唾液淀粉酶最适pH为pH6.9，高于或低于酶的最适pH值，都将引起酶活性的降低，过酸或过碱的反应条件可使酶活性丧失。
抑制剂与激活剂：酶的活性常受某些物质的影响，能增加酶的活性称为酶的激活剂：降低酶活性且不使酶蛋白变性的称为酶的抑制剂。如Cl-为唾液淀粉酶的激活剂，Cu2+为唾液淀粉酶的抑制剂。
根据上述性质，可以用碘检查淀粉是否水解及其水解程度，间接判断唾液淀粉酶是否存在及其活性大小。
【标本】
唾液
【测定方法】
试剂：1％淀粉溶液，1％氯化钠溶液，1％硫酸铜溶液，1％硫酸钠溶液，碘液，磷酸氢二钠（0.2mmol/L）, 柠檬酸溶液(0.1mmol/L)。
器材：试管，试管夹，恒温水浴锅(37℃),吸管，滴管，试管架，
操作：
1.收集唾液：实验者先将痰咳尽, 用自来水漱口, 清除口腔内食物残渣, 再含蒸馏水约15 mL, 作咀嚼咕漱运动, 3min 后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内, 过滤气泡及食物残渣后于小烧杯中备用。
2.观察温度对酶促反应速度的影响
取试管3支，编号1,2,3，按下表操作：
3. 观察pH对酶促反应速度的影响
（1）配制一系列pH不等的缓冲液。
（2）取试管3支，编号1,2,3，按下表操作：
4观察激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响
取试管4支，编号1,2,3,4，按下表操作：
【结果及讨论】
温度对酶促反应的影响 ：此组实验的三个试管模拟人体的环境即近中性,通过观察不同温度下酶活性强弱, 证明温度对酶活性有很大影响。1 号试管的颜色变化比较大, 无色时淀粉被完全分解为单糖, 晴褐色时淀粉不完全分解, 蓝色时淀粉完全没被分解, 浅蓝色时少许被分解; 也就是说不同人的唾液淀粉酶活性在100 ℃时受影响的程度不同, 有的被完全抑制, 有的部分受影响, 而有的和在37℃时相比几乎无变化。2号试管无色, 说明淀粉完全被分解为单糖, 不能与碘发生颜色反应;通观3 号试管发现唾液淀粉酶活性在0 ℃时大都被抑制, 或是完全被抑制或是大部分被抑制。
pH 值对酶促反应的影响 ：此组实验在37 ℃ 下设置三个pH 值: 5. 0 ( 酸性) 、6. 8( 近中性) 和8. 0( 碱性) 。通过各个试管的颜色判断酶活性强弱。酶活性比较强时, 淀粉完全分解, 显示无色或碘液的浅黄色; 酶活性比较弱时, 淀粉不能被完全分解, 依被分解的程度不同显示不同的颜色。相比较而言, 2 号试管的颜色最浅, 说明37℃ 时酶活性最强, 淀粉被完全分解。1 号试管颜色相近,均为晴褐色, 说明其中的淀粉被分解为多糖, 也就是淀粉酶在酸性环境中能发挥作用; 而在3 号试管的碱性环境中, 淀粉酶发挥作用的强弱程度不同, 有的能将淀粉部分分解, 颜色呈现棕黄色, 有的不能分解, 呈深蓝色。
激活剂和抑制剂对酶活性的影响 ：在37℃、近中性环境中, 设置对照( 蒸馏水) 、0. 9% NaCl、1% CuSO4、1% Na2SO4 的四组实验, 通过观察颜色, 判断酶活性强弱, 从而得出抑制剂和激活剂。对照组中酶将淀粉完全分解, 加碘液呈无色,2、4 号颜色与1 号相近, 说明其中的淀粉被完全分解, 因此0. 9%NaCl、1 %Na2SO4 为激活剂, 3 号试管为深蓝色, 说明其中的淀粉没有被分解, 酶不能发挥其应有的作用, 可以判断1% CuSO4 为抑制剂。
【总结】通过实验发现唾液淀粉酶具有高度专一性, 其活性受温度、p H 值、激活剂及抑制剂等多种因素影响; 每个人产生唾液淀粉酶的量不同, 活性强弱也有差异。不同人的酶活性受环境条件影响程度也不同, 有些人的酶活性在一定条件下几乎不受影响, 而有些几乎失活。人体唾液淀粉酶在37℃ 活性最强, 但0 ℃ 、100 ℃下酶活性并没有完全丧失, 而是活性受到影响, 特别是0℃时酶活性受影响比较大, 其活性比较弱, 由此可知很多水果、蔬菜中的酶在低温时活性比较低, 有利于保鲜。同时发现中性环境中淀粉酶活性最强, 不同来源的酶对碱的耐受度不同, 有的影响不大, 有的几乎失活。稀释的唾液, 由于酶浓度降低, 其活性也相应降低, 出现相应的颜色反应。
【临床意义】（待补）
实验二血清乳酸脱氢酶的测定（比色法）
【实验原理】乳酸脱氢酶在有辅酶Ⅰ携氧的情况下，使乳酸脱氢酶生成丙酮酸，丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸苯肼。苯肼在碱性溶液中显红棕色，其显色的深浅与丙酮酸的浓度成正比。440nm下与同样处理的丙酮酸标准液进行比色，求得乳酸脱氢酶的活力单位。
【标本】新鲜兔肝
【材料与方法】
器材：紫外分光光度仪，加样枪，容量瓶，滴管，试管等。
试剂：
1. 0.1mol甘氨酸溶液 称取甘氨酸7.505g，氯化钠5.85g，蒸馏水溶解后稀释到1000ml。
2. pH10.0乳酸钠缓冲底物液 吸取70%乳酸钠溶液10ml、0.1ml甘氨酸溶液125ml、0.1N氢氧化钠75ml，混合，加氯仿数滴防腐，置冰箱保存。
3. 辅酶Ⅰ溶液 称取辅酶Ⅰ10mg，加蒸馏水2ml，溶解后置冰箱保存，约可用6周。
4. 2,4-二硝基苯肼溶液 称取2,4-二硝基苯肼19.8mg，用10NHCL10ml溶解后，加蒸馏水至100ml，置棕色瓶内，置冰箱保存。
5. 0.4N氢氧化钠溶液 。
6. 丙酮酸标准液（1μmol/L） 准确称取纯丙酮酸钠11.0mg，置于100ml容量瓶中，加入乳酸钠缓冲底物液使其溶解并稀释至刻度。此液应新鲜配制。
操作：
先将血清标本做1/5稀释（血清1份蒸馏水4份），然后按照表进行操作。
混匀，室温放15min，用440nm或蓝色滤光板进行比色，以蒸馏水调零，读取各管吸光度读数，以测定管吸光度减去对照管吸光度，于标准曲线上查其活力单位值。
[标准曲线绘制]
血清乳酸脱氢酶比色测定法标准曲线绘制操作步骤
混匀，室温放5min，用440nm或蓝色滤光板进行比色，以蒸馏水调零，读取各管吸光度读数，以各管吸光度减去0号管读数(纵坐标)后，与其相应的酶活力单位值（横坐标）在坐标纸上作图，绘成曲线。
[注]以100ml标本在37℃与底物作用15min，生成1μmol丙酮酸为1个乳酸脱氢酶活力单位。
【讨论】
【拓展】血清乳酸脱氢酶
血清乳酸脱氢酶介绍：
乳酸脱氢酶(LDH或LD)是糖无氧酵解及糖异生的重要酶系之一，可催化丙酮酸与L-乳酸之间的还原与氧化反应，也可催化相关的α-酮酸。LDH广泛存在于人体组织中，以心、肾、骨骼肌含量最高，肝、脾、胰和肺组织次之。LDH测定方法主要有比色法和连续监测法。
血清乳酸脱氢酶正常值：
(1)比色法：150～450U/L。
(2)连续监测法：男80～280U/L 女100～230U/L
血清乳酸脱氢酶临床意义：
LDH测定常用诊断心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤。
(1)心肌梗死：发病10～12h升高，24～48h达高峰，8～9天后恢复正常。与CK相比，虽然酶活性出现较迟，阳性率较低，但持续时间长，且活性增高的程度与心肌梗死的病情密切相关，梗死范围越大，其酶活性越高。若LDH增高后恢复迟缓，或在病程中再次增高，提示梗死范围扩大，预后不良。
(2)肝脏疾病：急性肝炎或慢性活动性肝炎LDH常显着或中度升高。其敏感度略低于ALT。肝癌时LDH活性明显升高，尤其是转移性肝癌增高更显着。可达1000U/L。
(3)血液病：白血病、巨幼红细胞贫血、恶性淋巴瘤等LDH活性升高。
(4)其他：营养不良、横纹肌损伤、胰腺炎、肺梗塞等LDH活性也升高
【相关资料】
实验三琼脂糖凝胶电泳法分离乳酸脱氢酶同工酶
【生化特性】
【材料与方法】
标本:新鲜兔肝
器材：电泳法，试管，加样枪，载玻片，滴管，吸量管，恒温水浴箱等。
试剂：
1． 巴比妥-盐酸缓冲液(pH 8．4，0.1mol／L)：溶17.0g巴比妥钠于600ml蒸馏水，加入1mol／L盐酸溶液23.5ml，再加蒸馏水于1000mL。
2． 0.5mol／L乳酸钠溶液：称取5.6g乳酸钠溶于蒸馏水并稀释至100ml。
3． 1mmol／L乙二胺四乙酸二钠 称取EDTA·Na2 ·H2O 372m g，溶解于蒸馏水中，并定容至l00ml。
4．0.5%缓冲琼脂糖凝胶:溶0．05 g琼脂糖于5ml （pH 8.4，0.1mol／L）的巴比妥一盐酸缓冲液中，加蒸馏水5ml再加入EDTA·Na2溶液0.2ml冰箱保存备用。
5．0.8-0.9%琼脂糖染色胶：溶80-90mg琼脂糖于5ml（pH 8.4，0.1mol／L）的巴比妥一盐酸缓冲液中，再加入0.001 mol／L EDTA·Na2溶液0.2ml，冰箱保存备用。
6．显色液：溶50mgNBT于20ml蒸馏水（25ml棕色容量瓶）溶解后加入NAD+125mg 及PMS12.5mg，加蒸馏水25ml，避光低温保存，一周内有效，如溶液呈绿色即失效。
7.2%醋酸缓冲液：2ml醋酸（99.5%）加蒸馏水98ml。
8.电泳缓冲液（pH 8.6，0.075mol／L）：称取巴比妥钠15.45g、巴比妥2.76g溶蒸馏水并稀释至1000ml。
材料
（1） 兔肝匀浆制备：处死家兔，立即将其肝脏取出，用蒸馏水洗净，称重后剪碎，按照1g加4ml蒸馏水之比例加蒸馏水后，置匀浆器中匀浆十五分钟。
（2） 提取匀浆上清液：将兔肝匀浆四层纱布过滤，滤液离心（400rad/s）15分钟共两次，取上清液，冰箱保存备用。
操作
1. 琼脂糖凝胶板的制备和电泳：将0.5%琼脂糖凝胶水浴熔化。取2ml熔化的凝胶液平浇于一洁净载玻片上。凝胶凝固后，于凝胶板一段1/3处用一硬纸片插入(不插透凝胶)过一会将纸片拔出即可获一小槽。
用毛细管向小槽内加入新鲜兔肝匀浆约10ul，将凝胶板加入电泳槽内，两端各以浸有电泳液的纱布作盐桥，点样端靠近阴极电泳，电压保持100V，电泳40—60min。
2.显色：电泳终止前约10min左右，将0.8~0.9%琼脂糖染色胶在水浴中熔化，取此胶0.67ml与染色液0.53ml及0.5M乳酸液0.2ml混匀，立即浇在电泳完毕的凝胶板上， 37℃ 避光保存30min（温度不超过40℃），即显示出5条深浅不同的蓝紫色区带。最靠近阳极的是LDH1依次为LDH2,LDH3,LDH4,LDH5，则移向阴极端。
3.固定与干燥：将显色后的凝胶板浸于2%醋酸溶液中，1.5~2小时烘干后，取出滤纸，背景即透明。
【讨论】
【拓展】：
一， 毛细管电泳法分离血清中乳酸脱氢酶同工酶：
毛细管电泳首先由H jerten在1967 年提出, 但从19世纪80年代开始才有了较大的发展, 目前此技术并未在临床得到广泛开展和应用。
利用还原型辅酶I(NADH)在340nm波长处特异性吸收峰,建立用毛细管区带电泳在线检测人血清中乳酸脱氢酶(LDH)同工酶的方法。方法?实验中采用未涂层毛细管,长60cm,内径75μm,pH9.4(23℃)二氨基二甲基1,3丙二醇(AM2P)缓冲液含20mmol/L氧化型辅酶I(NAD+)、51.6mmol/L乳酸锂。
结果:在25min内完成电泳分离,乳酸脱氢酶同工酶1(LDH1)、乳酸脱氢酶同工酶5(LDH5)纯品各自均可得到较好峰形,而且LDH1、LDH5纯品的混合物亦可得到完全分离,在分析正常人血清与肝癌患者血清时,其结果与美国Helena公司REP全自动琼脂糖电泳结果一致,取得满意效果。
结论该法快速、低耗,具有较好的推广应用价值。
【临床意义】