荧光素酶报告基因 原理：转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。

其原理简述如下：

（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。

（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

步骤：

1、 (1) 铺细胞于 24 孔板中，{选用48孔板（如果比较难做的系统可以选用24孔板甚至12孔板，细胞量越多表达的酶相应越多），铺板密度约为30%（如果比较着急做实验，密度可以提高）。}每孔细胞数为 20 万细胞左右，待细胞融汇度达到70% （适合磷酸钙转染）、 85% （适合脂质体转染）时进行转染。一般选用细胞密度为50-70%时进行转染（因为转染后要让质粒表达一定的时间，一般是18-24小时，故而这个细胞密度到加药时密度会差不多到100%）。转染体系的配置：目标蛋白的质粒（pBind-），luc质粒，fermentas转染试剂，（质粒：转染试剂=1：1-3（μg：μL）这个比例根据细胞、质粒转染难易程度而定，必要时需要自己摸条件）。——此步骤与与普通的细胞转染实验的要求相同。

脂质体法

（1）在细胞密度达到80%左右，于转染前1小时用基本培养基（常用无血清培养

基Opti-MEM）为细胞换液。【对转染后易死的细胞可用不含双抗但含有10%FBS的DMEM或1640培养基】

（2）根据细胞培养皿的大小，按下表配制转染试剂体系。将适量欲转染的质粒

DNA与适量体积的 Opti-MEM混匀。同时，将适量的脂质体【采用下表中所给量的一半】也和适量的 Opti-MEM混合。室温静置5分钟【时间过长会降低脂质体活性】。

（3）将（2）中两溶液转移到同一EP管中，吹打使其混匀。静置20分钟。

（4）将质粒DNA和脂质体混合液加入到细胞培养皿中，置于CO2培养箱中37℃

培养（5% CO2，37 ℃）4－6小时后更换正常培养基（含双抗和10%FBS）。 脂质体法各试剂用量

2 在转染合适的时间点，换成含血清（10%FBS）基本培养基培养 24 小时左右，再根据实验需要处理细胞。

3 加Reporter lysis buffer裂解细胞之前弃去培养液，500 μ l 预冷的 PBS 清洗细胞两次，吸尽 PBS 。——荧光酶的酶促反应会被痕量的钙所抑制，故用磷酸钙转染的细胞在收集细胞前应充分洗涤除去含钙介质。

4 每孔中加入 120 μl 1 × Reporter lysis buffer 。室温放置 2-5 分钟裂解细胞，将 24 孔板放在 -80 ℃ 冰箱，待测定时，室温放置，将其融化。——-80 ℃到室温的单次冻融有助于细胞裂解。

5 利用 Luciferase assay kit 试剂盒测定荧光素酶的活性：取 20 μ l 细胞 裂解上清液，加入荧光素酶底物 50 μl ，迅速混匀，测定荧光素酶的活性。— 一个样品做三个平行实验，在上清液与荧光素酶底物迅速、充分混匀的同时保证每份样品加入酶标板的时间间隔一致。

裂解—加荧光素酶试剂

1）5X lysis in ddH2o ，稀释到1X。

60ul X 51(48孔板ddH2o 2448ul

lysis 5X 612ul

每孔60ul 裂解细胞，

于-80°C 10min , 4°C 10min ,反复冻融易于裂解。

2）firefly luciferase substrate

luciferase 1X 2290 ul

Luci (棕色管) 10X 255 ul

ATP 500X 5 ul

每个孔加50 ul luciferase于双报告基因仪器检测。

3）Renilla substrate

50 ulX50 = stop buffer (CTZ buffer) 1X 2225 ul

stop（透明管） 10X 250ul

slip(棕色管) 100X 25ul

再加50 ul relina 于双报告基因仪器检测

6 β - 半乳糖苷酶活性的测定：取 10 μ l 细胞裂解液，加入 120 μ l 下面混合的试剂： 3 μl 100 × Mg （ 0.1M MgCl 2 ）、 66 μ l ONPG （溶于 0.1M 磷酸钠溶液中， 4mg/ml ）、 200 μl 0.1 M 磷酸钠缓冲液（混合 41ml 0.2M Na 2 HPO 4 ·H 2 O ， 9ml 0.2M NaH 2 PO 4 · 2H 2 O ， 50mlH 2 O 配制而成），在 37 ℃ 温育 30 分钟左右，至液体颜色变黄。最后加入 50 μ l Na 2 CO 2 终止反应，测定 OD 420 。

(7) 荧光素酶的活性和 β - 半乳糖苷酶活性的比值即为报告基因的数值。

3.2 仪器安装

3.2.1 双击Veritas图标运行软件；

3.2.2 从"Welcome to Veritas"对话框中点击"Run Promega Protocol"；

3.2.3 浏览"DLR"文件夹，选择合适的检测程序，例如DLR检测中使用的是单注射器那就选择"DLR with one injection."；

3.2.4 点击"Options"选择需要检测的孔，默认值是预置了Promega 操作方案的最佳测量值。但也可以根据自己需要在"Other Options"面板中进行检测时间，延迟时间和加样体积的调整。修改结束，点击"Apply Changes"确认修改，或者点击"Save Protocol As"保存修改方案。另外也可以点击"Options"返回"Main Dialog Box"；

3.2.5 在"Main Dialog Box".中输入个人信息，例如"Experiment", "Operator", "Plate No.", and "Notes"。

3.3 样品分析

3.3.1 准备含有裂解细胞培养物的96 孔板；

注：为了保证数据良好的重现性。加入试剂前，室温下平衡细胞培养基；

3.3.2 准备注射器。将注射器1 进样口放入LAR II，将注射器2 进样口放入Stop & Glo?试剂瓶，在"Main Dialog Box"上用"Prime"键对注射器进行初始化；

注：不能混用注射器。Stop & Glo?试剂对萤火虫荧光素酶活性有猝灭作用。建议一个注射器专门吸入Stop & Glo?，另一个专门吸入LAR II；

3.3.3 样品板放入Veritas?微孔板发光检测仪中，点击“Start”开始检测。检测结束后，所有需要检测的样品检测结果会以Excel 表格形式显示，如检测中遇到其他问题，请参考问题导读获取更多信息；

3.3.4 检测结束就可以通过Excel 进行数据分析；

3.3.5 检测结束取出检测板。选择"Reverse Purge"将管路中剩余试剂回收到试剂瓶，而后彻底清洗注射器。

第二篇：荧光素酶及其报告基因的应用和检测

荧光素酶及其报告基因的应用和检测

一 生物发光

生物发光（bioluminescence）是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种特殊类型的化学发光，化学能转变为光能的效率几乎为100%。也是氧化发光的一种。生物发光的一般机制是：由细胞合成的化学物质，在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。

与荧光的区别在于

荧光：荧光检测需要激发光源，发射光的能量来源于激发光，荧光反应为瞬时反应。 发光：生物发光、化学发光，发光反应无需激发光源，发射光的能量来源于化学反应，发光有一定的持续时间。

二 荧光素酶

荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称,来自于自然界能够发光的生物。

自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感,因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前,以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛,该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。 发光机制

生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+ 、ATP、O2的参与下,催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧,产生激活态的氧化荧光素,并放出光子,产生550～580 nm 的荧光,其化学反应式如下。

这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光,其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白( GFP) 。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光,特异性很强,灵敏度高,由于没有激发光的非特异性干扰, 信噪比也比较高。

三 荧光素酶报告基因

报告基因（report gene）是一种易于检测蛋白质或酶等表达产物的基因，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。通常把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因,或与其他目的基因融合,在调控序列控制下进行表达

,

通过报告基因的表达产物来标定目的基因的表达状况。 1 常见的报告基因：

β‐半乳糖苷酶（β‐Gal）

葡萄糖醛酸酶（GUS）

绿色荧光蛋白（GFP）

分泌型碱性磷酸酶（SEAP）

荧光素酶（LUC）

2 报告基因简单实验流程

? 构建包含有报告基因的质粒

? 将构建好的质粒转染细胞

? 提供相应的刺激（诱导）

? 检测报告基因

? 数据分析

3 荧光素酶作为报告基因的优势：

? 内源性低，哺乳动物无内源性表达

? 荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响 ? 发光检测，检测方便

? 灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子

? 检测范围广，大于7个数量级

4 其它报告基因

正因为荧光素酶与底物的结合特异性很强，检出的灵敏度高，没有激发光的非特异性干扰，信噪比较高，具有其他报告基因不可替代的优势，它作为报告基因显示出良好的前景。荧光素酶已成为医学研究领域的重要工具, 在基因工程研究中被广泛作为报告基因用于单个细胞、转基因生物、动物和人体基因表达的实时、低光成像,是一种非常实用的研究方法，对于推动基因工程研究的发展具有重要作用。

四 它的检测方法

依赖生物发光特性,利用闪烁计数器( scintillationcounter) 对荧光素酶的活性作出定量检测。在标准反应条件下,加入超量底物,经一定时间内,荧光闪烁总数与样品中存在荧光素酶的活性成正比。另外,也可以采用光自显影法对荧光素酶进行定性检测。

五 利用MicroChemi检测植物叶片中的荧光素酶生物发光

1 打开MicroChemi相机开始制冷

2将植物叶片喷加发光底物（喷底物的过程需遮光）

3 将样品置入MicroChemi暗室室温孵育10min（孵育时间随样品而定）

4 打开MicroChemi软件，设置拍摄参数

5利用binning3x3，每10分钟曝光一次，共曝光三张

6添加伪彩，调节照片的对比度，得到最佳照片

附：利用MicroChemi2.0检测烟草叶片中荧光素酶的发光，曝光10min，binning3x3