一、实验原理：

1、适宜的反应条件下，β- 葡萄糖苷酸酶（GUS）可将X－Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。

二、实验步骤：

1、将准备好的拟南芥植株放入小EP管中，加入染色液浸没试材，封好盖子；

2、37℃培养箱中温育1小时至过夜；

3、将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。

4、观察结果。

三、实验结果：

 

转基因拟南芥                                         野生型拟南芥

 

      （上）转基因拟南芥；（下）野生型拟南芥             转基因拟南芥（作图上行从左数第一个的放大）

四、分析讨论：

1、预期结果：转基因植株被染成蓝色，野生型植株不被染色。

   实际结果：与预期结果一致，但野生型脱色不完全，有几片叶子的叶绿素未被脱掉。

       分析：实验较为成功。由上图可知，转入的基因在整棵植株都有表达，其中蓝色在叶脉中最深，推测转入的基因在叶脉中表达最多。在野生型植株中，大部分叶子被乙醇脱去叶绿素而呈现浅黄色。

2、gus基因是目前常用的一种报告基因，是β－D－ 葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶 (GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸 ，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。 其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。

3、gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。

4、gus基因是一种报告基因，报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。报告基因是研究基因调控的有力工具，常用于判断试验基因的转化效率以及基因的调控与功能的研究实验中。

5、报告基因必须具备的条件有：(1)已被克隆和全序列已测定; (2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物; (3) 报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好，表达产物能进行定量测定；(4) 细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测。

6、利用报告基因表达载体的研究技术的优点有：(1) 避开内源和外源基因表达水平的影响：对于报告基因编码产物的检测水平可以精确地反映基因启动子的转录活性，不会受到内源性基因表达产物水平的影响；(2) 易于检测：如果研究不同基因启动子的转录活性，采取本身基因表达产物的检测方法，必须建立各种基因表达产物的检测方法，有些基因的表达产物的检测技术还不具备，或者很难建立，而采用报告基因的研究策略就很容易解决这一问题，只要建立稳定的报告基因表达的检测技术就可以用于不同基因启动子转录活性的检测和研究。

第二篇：GUS基因的定性和定量检测

1．GUS报告基因的定性检测

GUS能与显色底物X-gluc 反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性研究GUS的表达水平和表达模式。GUS 染色的稳定性好，组织定位精确，成为在植物中运用很广的报道基因。

1.1 GUS染色底物的配制

按下表1配制GUS染色的底物。

表1. GUS染色底物的配制

* 0.5M Na2HPO4配制方法：将17.907g Na2HPO4溶于水，定容至100ml。0.5M NaH2PO4的配制方法：将7.800g NaH2PO4溶于水，定容至100ml。

1.2 染色步骤

1)   染色：加入适量配制好的GUS 染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS染液中，将24孔板置于37℃保温箱中放置6h。

2)   漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。

3)   脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。

4)   记录：在体视显微镜下拍照记录。

2．GUS报导基因的定量检测

GUS 能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。MU的激发波长为365nm，发射波长为456nm，其含量可由荧光分光光度计测出。因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。

2.1 试剂配制

1)   1mol/L Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100ml水。

2)   1mol/L NaH2PO4 溶液：15.601g NaH2PO4 溶于100ml水。

3)   0.1M 磷酸缓冲液(PH7.0)：1mol/L Na2HPO4取5.77ml，1mol/L NaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。

4)   10％ SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。

5)   0.5 M EDTA (PH8.0)：在80ml水中加入18.61g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。

6)   GUS酶提取液：0.1M 磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10% SDS取1ml； 0.5M EDTA(PH8.0)取2ml；Triton X-100取100ul；β-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。

7)   MUG底物：称8.8mg MUG，溶于10ml GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。

8)   反应终止液（0.2 mol/L Na2CO3 ）：称2.12Na2CO3 ，用水定容到100ml。

9)   考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 10mg, 95%乙醇5m1, H3PO4 10ml，定容至l00ml，过滤后4℃保存。

10) １mg/ml BSA：20mg BSA，用GUS提取缓冲液定容至20ml。

2.2 植物总蛋白的提取

1)   取新鲜的植物组织100mg左右，用液氮将生物材料急速冷冻，然后采用液氮研磨的方式在研钵里磨碎组织。如果不立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于-80℃冰箱。

2)   将研磨破碎的组织转到Ep管里，并立即加入1ml的GUS提取缓冲液，充分混匀。

3)   12,000rpm, 4℃离心5min，将上清转至另一洁净的Ep管，冰上放置待用。

2.3 蛋白浓度的测定（Bradford法）

1)   取7个Ep管，分别加入0μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl的BSA标准液，用水补至相同体积20μl。加入980μl的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。以蛋白浓度（mg/ml）对吸收值A595做标准曲线。

2)   取待测蛋白样品10μl，加10μl水，加入980μl的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。代入公式，求出蛋白样品的浓度。

2.4 GUS表达水平的定量测定

1)   取100μl蛋白上清，加入400μl 37℃预热的GUS提取缓冲液里，再加入500μl MUG底物，37℃温浴。在0min、15min、30min、45min和60min分别取混合反应物200u1加入到800u1反应终止液，室温避光保存。

2)   用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝10nm时测定不同时间点的荧光强度值。

3)   以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间的荧光强度变化。

4)      用单位时间的荧光强度变化除以参加反应的蛋白量，求出单位质量的蛋白单位时间的荧光强度变化。

文档中提及的产品，可以登录生物耗材网查询！