山 西 医 科 大 学
研究生学位论文开题报告
学 号：姓 名：
导师姓名：
研究方向： 付 杰 王 英 元 法医损伤病理学 论文题目： 大鼠脑挫伤后脑组织β-APP和
院（系）：
入学时间： 开题时间：
MAP-2表达与损伤时间的关系 山西医科大学法医学院 20xx年9月7日 20xx年5月30 日
二○○七年五月三十日
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学位论文开题报告评审表
注：一半以上不同意或评价综合分低于C+（70分）者，必须重新开题。
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一、立项依据
1.立项目的、意义及应用前景：
损伤时间的推断一直是法医病理学的研究课题之一，脑损伤时间的推断对案件的侦破有极其重要的意义。颅脑损伤是一动态变化的疾病演化过程，它可以产生一系列神经毒性和神经保护的效应，在分子与细胞水平产生基因与蛋白的表达变化[1-3]，绝大多数颅脑损伤的死亡和病残都与损伤后出现的继发性脑损害关系密切[4]，许多细胞因子和生化物质参与脑外伤后继发性脑损伤与抗损伤的病理生理过程[5-9]。国内外法医学者从免疫组织化学和分子生物学的角度对脑挫伤与伤后经过时间的关系做了大量的研究[10-13]，但由于受到检材要求所限，在此方面的研究多为模拟脑挫伤的动物实验，而实际案例的标本甚少，从而造成了理论研究与实际鉴定工作相“脱钩”的现象。
β-APP 可在人体大多数细胞中表达，以神经元和星形胶质细胞中含量较丰富，主要经非淀粉样蛋白生成途径水解，促进神经细胞生长分化、增加神经突触的可塑性、参与信号转导、促进细胞黏附、神经保护作用[14]。近年来很多研究发现[15-17]，一些神经系统的损伤，如创伤、感染、中毒、轴索损伤及缺血等，均可影响β-APP的表达。在实验性脑外伤、脑缺血、脊髓损伤等神经元退变过程中，细胞内钙离子内稳态的破坏引起钙离子内流增加，导致钙超载。钙超载又可激活钙激活中性蛋白酶，激活后的钙激活中性蛋白酶可作用于细胞骨架蛋白（包括MAP-2、血影蛋白、胞衬蛋白、神经丝蛋白等），造成细胞骨架蛋白的降解、破坏、丢失，引起轴突转运障碍，从而导致神经元变性、坏死，神经功能障碍[18]。有研究表明[19]，在轻、中度颅脑损伤的模型中，发现损伤程度与MAP-2表达的区域性及时间性有所区别。对β-APP、MAP-2的有关研究可望用于法医学家对损伤时间的推测。
与其他分子生物学方法比较，实时荧光定量RT-PCR对于少量PCR产物和RT-RCR产物是一种快速且敏感的定量方法，利用克隆质粒DNA作为标准和看家基因去标准化数据，我们就能测量其mRNA的起始拷贝数，从而达到精确的定量。且其所有反应都在闭合管内完成，不需扩增后的产物处理，有效的避免了污染，节省了时间及手工操作程序，此外实时信号监测可有效避开平台效应带来的误差，使其成为法医学研究的重要工具。
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基于上述原因，本课题研究准备采用免疫组化和实时荧光定量RT－PCR技术对实验动物和已知脑挫伤经过时间的人体标本中β-APP、MAP-2进行定性和定量分析，试图建立其蛋白质和核酸表达的程度与挫伤经过时间关系的回归方程，并应用于法医学实践中。
2.国内外研究现状分析：
国内外法医学者关于脑挫伤经过时间的研究已有大量报道，从免疫组织化学和分子生物学的角度对脑挫伤与伤后经过时间的关系做了大量的研究，但利用分子生物学技术对核酸定量分析推断脑挫伤经过时间的研究甚少，另外由于受到检材要求所限，在此方面的研究多为模拟脑挫伤的动物实验，而实际案例的标本甚少，从而造成了理论研究与实际鉴定工作的“脱钩”现象。本课题分别从蛋白水平及特定基因的转录水平入手，采用Westernblot技术及荧光实时定量RT-PCR技术对脑组织挫伤部位β-APP、MAP-2及其mRNA进行定量分析，通过动物实验和人体标本相结合，建立β-APP、MAP-2及其mRNA的表达与脑挫伤经过时间的相关关系，并运用分子生物学原理探讨其表达变化的机制以及对脑挫伤的作用，以期为脑挫伤经过时间筛选可靠的指标，探讨用于法医学实践的可行性。
3.参考文献：
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二、研究方案
1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题
研究目标：① 以Wistar大鼠和人体标本为实验对象，采用免疫组化和荧光实时定量RT-PCR技术定量分析挫伤部位脑组织中β-APP、MAP-2的表达水平，建立其与脑挫伤经过时间的关系。
② 从分子水平探讨β-APP、MAP-2在脑挫伤中的作用及其作用机制。 ③ 为建立脑挫伤的法医学鉴定、脑挫伤经过时间提供重要的理论与实际应用依据。
研究内容 在动物模型的基础上运用免疫组化和荧光实时RT-PCR检测不同脑挫伤经过时间脑组织中β-APP、MAP-2的表达、探讨其在脑挫伤中的作用与机制，并利用实际案例的检材进行验证。主要研究内容如下：
① 建立大鼠闭合性脑挫伤模型并进行实验动物分组及取材。
② 采用免疫组化检测脑挫伤部位β-APP、MAP-2的表达。
③ 脑组织总RNA的提取。
④ 引物设计。
⑤应用荧光实时定量RT-PCR技术定量分析挫伤部位脑组织β-APPmRNA、MAP-2mRNA表达的变化，并建立其表达与脑挫伤经过时间关系的回归方程与曲线。
⑥利用实际检案的检材进行验证，运用分子生物学原理探讨其表达变化的机制以及对脑挫伤的作用。
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拟解决的关键问题：① 在分子水平上阐明β-APP、MAP-2对脑挫伤的
的作用与机制分析。
② 实验条件以及影响因素如温度、湿度的控制。
③ 引物设计。
④ 实验结果在法医学鉴定中的应用。
2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 研究方法：
① 建立闭合性大鼠脑挫伤模型，并进行实验动物分组及取材（设置对照组及实验组，其中实验组依照挫伤后1h、4h、12h、48h、72h和7d、14d分成7组，每组4只）。
② 收集已知准确脑挫伤经过时间的人体标本50例以上。
③ 采用免疫组化检测脑挫伤部位β-APP、MAP-2的表达。
④ 用RNA提取试剂盒提取总RNA。
⑤ β-APPmRNA、MAP-2mRNA RT-PCR引物合成。
⑥ 采用荧光实时定量RT-PCR技术对挫伤部位脑组织β-APPmRNA、MAP-2mRNA进行定量分析。
⑦ 建立β-APPmRNA、MAP-2mRNA表达变化与脑挫伤经过时间关系的回归方程；对实际案例标本进行验证，评价指标的实用性，应用于法医学实践。 技术路线和实验方案：
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可行性分析：
本课题组所在学科为山西省重点学科，已获得博士学位授予权。多年来，本课题组一起从事损伤病理学、猝死病理学、死亡时间推断的法医学应用研究，在死亡时间推断的实验研究方面形成了自已的特色，发表了一系列科研论文，有较好的工作基础。本实验室有进行该研究的所有设备，实验条件较成熟。课题组主要人员有多年从事核酸分析技术和实验病理学研究的经历，有丰富的工作经验，技术路线成熟。课题负责人多年从事损伤时间、死亡时间的推断及临床法医学的研究，富有创造性，组织能力强，课题技术路线合理可行。可以保证该课题的顺利完成。
(1) 建立大鼠皮肤挫伤损伤模型的方法已经成熟。
(2) 本教研室是省级重点学科建设单位，具有博士学位授予权，有雄厚的基础
及科研力量，导师王英元教授、教研室主任高彩荣教授等具有二十多年科
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研工作经历，在他们的指导下，足以完成课题。
(3) 本教研室具备实验研究所必需的仪器设备及技术条件，为本项目的完成提供了保障。
3. 本课题的创新之处
（1）本实验采用改良的自由落体装置, 撞击制造大鼠脑挫伤模型, 模型具有制作简单、存活率高、损伤程度差异小、可重复性强的特点, 对损伤时限的研究延长到损伤后14 d, 为较长时段脑损伤时间的推断提供参考依据。
（2）关于脑挫伤经过时间的研究已有大量报道，但利用分子生物学技术对核酸定量分析推断脑挫伤经过时间的研究甚少，本课题从特定基因的转录水平入手，对脑组织挫伤部位β-APPmRNA、MAP-2mRNA进行定量分析，在国内尚属首次。
（3）通过动物实验和人体标本相结合，建立β-APPmRNA、MAP-2 mRNA表达变化与脑挫伤经过时间的相关关系，并运用分子生物学原理探讨其表达变化的机制以及对脑挫伤的作用，以期为脑挫伤经过时间筛选可靠的指标，探讨用于法医学实践的可行性。
（4）采用荧光实时定量RT-PCR技术有效的避免了污染，节省了时间及手工操作程序，此外实时信号监测可有效避开平台效应带来的误差，这项技术非常适于在法医学实践中应用。
4. 研究计划及预测进展：
5. 预期研究成果
（1）建立重复性较强的闭合性脑挫伤动物模型，适于实验研究。
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（2）建立挫伤脑组织中β-APP、MAP-2的表达水平与脑挫伤经过时间的回归方程与标准曲线。
（3）在核心期刊上发表科研论文2-3篇
三、研究基础
一、多年来，本课题组一起从事损伤时间推断、死亡时间推断及猝死病理学的实验研究，在损伤与猝死病理学的法医学应用方面形成了自已的特色，发表了一系列包括SCI收录的高水平论文。一名博士生和两名硕士生正在进行脑组织中mRNA的提取与检测研究，积累了丰富的经验。
二、本课题组部分研究工作和近期发表的文章如下：
（1）血细胞中端粒的变化推断年龄及死亡时间的研究
（2）早期心肌挫伤损伤时间的推断及免疫组化研究。
（3）STR的多态性研究及法医学应用。
（4）羊水栓塞及过敏性休克的实验病理学研究与法医学应用。
（5）挤压伤-挤压综合征的法医病理学研究与应用。
（6）心肌早期缺血的免疫组织化学研究。
三、工作条件
本实验室所在学科为山西省重点学科及博士学位授权点，具备核酸片段分析和序列分析的必备仪器和设备，主要设备有：
① ABI9700PCR扩增仪
② ABI310遗传分析系统
③ Mx3005P Real Time PCR 扩增仪
④ SQ3测序仪
⑤ UV-2102PCS型紫外分光光度计
⑥ Multiskan MK3型酶标仪
⑦ 超净工作台
⑧ 各型离心机
⑨ 人工气候箱
⑩ 各种低高压电泳仪
本课题绝大部分实验均可在本实验室完成。同时本课题组所在山西医科大学 10
司法鉴定中心承担全省的司法鉴定工作，可以方便、快速的收集人体检材
四、经费预算
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研究生开题报告评分表
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