DNA指纹技术与应用 DNA指纹指具有完全个体特异的dna多态性，其个体识别能力足以与手指指纹相媲美，因而得名。该技术可用来进行个人识别及亲权鉴定，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"。

DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等，各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。其特点有：一，高度的特异性。研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10^-11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10^-19。二，稳定的遗传性。DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA?指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50％给子代。三，体细胞稳定性。即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。 19xx年Jeffery s博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。19xx年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用DNA?指纹技术已侦破了数千例疑难案件。DNA指纹技术具有许多传统法医检查方法不具备的优点，?如它从四年前的精斑、血迹样品中，

仍能提取出DNA来作分析；如果用线粒体DNA检查，时间还将延长。此外千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决沙皇尼古拉的遗骸，以及最近在前南地区的一次意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了DNA指纹技术。

此外，它在人类医学中被用于个体鉴别、确定亲缘关系、医学诊断及寻找与疾病连锁的遗传标记；在动物进化学中可用于探明动物种群的起源及进化过程；在物种分类中，可用于区分不同物种，也有区分同一物种不同品系的潜力。在作物的基因定位及育种上也有非常广泛的应用。

第二篇：DNA指纹图谱技术在作物品种_系_鉴定与纯度分析中的应用

第15卷第4期:74生　物　技　术Vol115,No14:74

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

20xx年8月BIOTECHNOLOGYAug12005

专题综述

REVIEWARTICLES

DNA指纹图谱技术在作物品种(系)鉴定与纯度分析中的应用

孔祥彬,张春庆

1

13

,许子锋

2

(1.山东农业大学农学院,山东泰安271018;2.中种集团承德长城种子有限公司,河北承德067000)

摘要:阐述了常用DNA指纹图谱技术(RFLP、RAPD、SSR、AFLP等)以及其他的几种DNA指纹图谱技术(SCAR、ISSR、SNP、

)SRAP、TRAP等的原理、优点及其应用研究概况,认为利用DNA指纹技术通过鉴定品种DNA水平上的差异来鉴定品种真实性和

纯度,具有准确可靠、成本较低、不受环境因素影响、便于实现鉴定自动化,且可鉴定表型上难于鉴别的品种等优点;已初步应用于多种作物的品种真实性和纯度分析,有些已实现商业化。虽然DNA指纹技术还存在许多不足,该文认为利用DNA指纹图谱鉴定品种纯度和真实性是品种鉴定的发展趋势,应加大力度不断完善和发展DNA图谱鉴定技术,实现DNA指纹鉴定的简单化、自动化和商业化。

关键词:指纹图谱;品种鉴定;纯度分析;DNA

中图分类号:Q789　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2005)04-0074-04

　　优良品种是作物高产的基础,种子质量直接关系到农业生产的安全、农民增收和农村社会的稳定。研究可靠实用的种子真实性和种子纯度鉴定方法是摆在我们科技工作者面前的一项亟待解决的对农业生产关系重大的课题。早期,人们采用形态学方法对品种进行识别,该方法简便、经济,但是由于许多形态学性状鉴定周期长、受环境影响大,并且随着育种亲本的利用集中化,品种鉴定愈来愈困难,传统的形态学方法也就越来越不适应品种鉴定和纯度分析。

随着电泳技术的发展,电泳图谱技术逐渐应用到品种鉴定和纯度分析中来。这种电泳图谱多态性丰富,具有高度的个体特异性和环境稳定性,就象人的指纹一样,“指纹图谱(Fingerprinting)”:指纹图谱,另一类是20DNA指纹图谱。

生化指纹图谱,包括贮藏蛋白电泳指纹图谱和同工酶电泳指纹图谱。蛋白质电泳能产生品种特征特性的蛋白质标记,能准确地将不同品种区分开,而且稳定性、重复性好,具有很强的适用性。但是蛋白质电泳技术也存在一些问题,对某些作物尤其对亲缘关系比较近的品种难以鉴别。同工酶电泳技术能分析大量样品,技术比较简单,但是同工酶是基因表达的直接产物,具有组织特异性、可利用的数量少、多态性少、对酶的提取要求高等缺点,因而在品种鉴别上常因同工酶选择不当而得不到应有的结果[1]。

DNA指纹图谱技术,主要依靠分子标记来构建品种的指纹,包括常用的RFLP、RAPD、SSR、AFLP等;以及新兴的SNP、SRAP、TRAP等等。

1　常用DNA指纹图谱技术

1.1　RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制性长度多态性)指纹图谱技术

19xx年,RFLP技术首先是Botstein等在人类基因组作图中发展起来。DNA限制性片段长度多态性其本质是生物在进化过程中,由于各种原因引起了染色体DNA中核苷酸排列顺序发生了变化,当这种碱基改变涉及到限制性酶切识别位点时,利用限制性内切酶可将DNA切割成长度不同的限制性片段[2,3],从而将不同品种的种子区分开。

作物品种具有特异性、一致性,同一品种的不同个体具有相同的遗传背景,任一个体的分子标记都代表其所属品种的特性。RFLP能够对基因组多个基因位点同时标记,且不受环收稿日期:2005-04-01;修回日期:2005-04-21

),男,山东曲阜人,硕士生,从事玉米DNA作者简介:孔祥彬(1980—

指纹图谱研究,E-mail:xiangbinkong@163.com;3通讯作者:张春庆(1963—),男,山东临朐人,教授,博导,从事种子质量检验技术、种子处理方法、品种登记保护的DNA指纹技术、小麦品质育种的研究,发表论文30多篇,主编教材5部,Tel:0538-8242458,E-mail:cqzhang@。

境影响。RFLP指纹图谱是最早在DNA水平上用于品种鉴别、种子纯度分析的一项技术。SmithJVC,etal(19xx年)利用RFLP技术,选用38个探针成功地将78个玉米的杂交种区分开,共得到288个RFLP标记,并发现RFLP可以区分同工酶和蛋白质电泳不能区分的玉米杂交种[4]。VavinoP,etal(19xx年)利用RFLP技术,用2个特异性的麦谷蛋白(glutenins)和麦醇溶(gliadins)探针,将54个意大利普通小麦品种区分开[5]。在国内,水稻(张培江等,2001)[6](黄益勤等,2001;袁力行等)[7,(2003)提出的核糖体ITS限制(RFLP)分析,可以快速和可靠地将稻属CD染色体组物种区别开来。先通用引物扩增ITS片段,再用特异性的限制性内切酶FokⅠ或DraⅢ消化PCR扩增产物,然后用1%的琼脂糖电泳并根据消化产物的多态性特征来鉴别不同物种[9]。1.2　RAPD(RandomAmplifiedPolymorphismDNA,随机扩增多态性DNA)指纹图谱技术

RAPD是19xx年美国杜邦公司Williams和加里福尼亚生物研究所Welsh等人首次发现的。其主要原理是以基因组DNA为模板,以一个随机的寡聚核苷酸序列为引物进行PCR扩增,揭示DNA序列的多态性。

由于RAPD多数位点是显性的,需要从大量引物中筛选出合适的引物来判别品种和纯度分析。TinkerNA,etal(1993)利用RAPD方法,分析了27个大麦品系,20个双单体材料,用70个引物进行PCR扩增,发现9个RAPD多态性片段可区别27个大麦品系,认为RAPD方法是区别高度相似的大麦品系的有用方法[10]。McDonaldMB,etal(1994)对玉米、大豆、花生、棉花、小麦进行RAPD检测,根据结果认为RAPD技术是鉴定品种纯度的有效的方法[11]。向太和等(2000)从500个RAPD引物中筛选出8个引物能够有效的区分籼优63、籼优64

[12][13]

和籼优晚3及其亲本。此外,RAPD还在大麦、花生[14]、油葵[15]、油菜[16]等作物进行了真实性鉴定和纯度分析。由于RAPD的重复性和稳定性较差,加之其多态性不太高,该方法目前实际应用不多,但是如果建立起不同作物的标准体系,严格控制实验条件RAPD还是有很好的应用前景的。1.3　SSR(SimpleSequenceRepeats,简单序列重复)指纹图谱技术

SSR由Tautz等于19xx年创立,SSR也叫微卫星DNA,是一类由几个(多为1-5个)碱基组成的串联重复DNA序列,其长

(AC)n、度一般较短,广泛分布于基因组的不同位置,如(GA)n、

(GAA)n(其中n为重复次数)等。

SSR指纹技术重复性好,简单易于操作,且是共显性标记,可用来鉴定品种和种子纯度分析。NNandakumar,etal(2004)采用10个微卫星位点分析了11个水稻品种和它们的亲本,发

20xx年8月　　　　　　　　　　　DNA指纹图谱技术在作物品种(系)鉴定与纯度分析中的应用　　　　　　　　　　　　75

现9个微卫星位点在11个杂交种具有多态性能构建指纹图谱的,其中4个微卫星位点(RM206、RM216、RM258和RM263)能够区别所有杂交种,可以用来鉴定纯度和品种保护[17]。SmithJSC,etal(1997)利用131个SSR引物和80个RFLP探针对58个玉米自交系和4个杂交种进行了鉴定,结果显示SSR比

[18]

RFLP能更有效地鉴定玉米种质。李云海等(1999)从56对SSR引物中筛选出5对引物,能够有效地区分所有供试的水稻雄性不育系和恢复系[19]。彭锁堂等(2003)选用26对SSR引物筛选出引物RM17对杂交稻组合籼优63和两优培九进行

[20]

SSR鉴定,与田间十分接近。李晓辉等(2003)利用两个或三个引物组合构建SSR指纹图谱可以将13个玉米杂交种区分开[21],随后又构建了86个杂交种的SSR指纹图谱数据库,确定了10对核心引物和判别标准用于亲子鉴定[22]。吴渝生等(2003)以从96对SSR引物中筛选出24对引物,每对引物可以检测到1-6个数目不等的多态性片段共97个,建立了可用于种子检验中的SSR指纹图谱[23]。此外,棉花[24]、小麦[25]等作物也建立了部分品种的SSR指纹图谱。

SSR标记与其他标记(RFLP、RAPD、AFLP)相比具有最高的多态性信息量(PIC),其等位基因变异来源于基因组DNA复制时的滑动引起的重复序列数目的的变化,而不是单碱基突变或插入缺失,因而表现出高度的多态性[26]。因此可用来高效准确地检测生物体中的遗传变异,在品种鉴定及种子检测中具有良好的应用前景。王凤格等(2005)针对我国玉米新品种DNA指纹库构建提出了相应的解决方案,场的规范及玉米新品种保护具有重要意义[27]。性SSR位点的开发及SSR,1.4　AFLP(AmplifiedPorphism,扩增片段长度多态性)指纹图谱技术

AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,扩增长度片段多态性)是由Zabeau等(1993)和Vos等(1995)发明创造的一种DNA分子标记新技术。其原理是基于对基因组总DNA双酶切经PCR扩增后的限制性片段进行选择,其实质是RFLP和PCR两项技术的结合。

AFLP技术不仅重复性好,而且多态性高,在聚丙烯酰胺凝胶上一次可以扩增50-100条带,因而非常适合品种鉴定和纯度分析[26,28]。Wang等(1998)利用AFLP分析了来自半干旱热带作物国际研究所的10个花生品种,获得78个多态性谱带,认为AFLP是构建花生指纹图谱的有效方法[29]。张春庆等(2002)筛选了AFLP引物组合M21P87和M73P17可用于水稻的

[30]

DNA指纹图谱构建,以区别不同品种。高世斌等(2001)用引物组合EcoRⅠ-AGGΠMseⅠ-CAA对我国19个玉米自交系进行了AFLP指纹图谱分析,结果表明利用AFLP标记总DNA,能够从基因组上明确区分玉米自交系,可用于玉米自交系鉴定[31]。棉花[32,33]、西瓜[34]等作物都有应用。

利用AFLP技术进行作物品种指纹图谱的绘制中由于亲缘关系较近,引物的选择是非常关键的。张春庆等(2002,2003)对水稻、玉米AFLP指纹图谱的引物的选择进行了研究,选出了具有多态性引物的组合,为作物品种指纹构建和纯度分析指明了思路[30,35,36]。袁力行等(2000)利用RFLP、SSR、AFLP和RAPD标记分析玉米自交系遗传多样性的比较研究中发现AFLP具有最高的多态性检测效率,能够在一次PCR扩增中检测出DNA水平上的微小差异,因而非常适于种质鉴定与保护[26]。但是目前来看,AFLP技术对实验条件要求较高,并且该技术受到保护,难以在短时间应用到生产实践中来。但是随着分子指纹图谱自动化的实现,AFLP技术还是有很大的应用潜力的。

2　新兴DNA指纹图谱技术

2.1　SCAR(SequenceCharacterizedAmplifiedRegions,序列特征

扩增区)技术

SCAR标记由Paran等人于19xx年提出,主要目的是把RAPD标记(或其他随机半随机标记)转变成PCR标记,方法是首先克隆RAPD标记,测出其两端的核苷酸序列,再根据这些核苷酸序列设计一对引物(包括RAPD引物)特异性扩增这个标记。

张志永等(1998)依据与SMV(SoybeanMosaicVirus)抗性基因紧密连锁的共显性SCAR标记SCW—05660的序列测定结果,合成了2对SCAR标记特异引物,对30个栽培大豆品种进行了指纹图谱分析。结果表明,较短的片段S—5600和S—05660是抗病品种的特征性条带;而较长的片段S—51000和

[37]

S—51600是感病品种的特征性条带。王斌等(1999)成功地把其中一个自交系8112的特异RAPD标记(0.9kb)转换成了稳定的SCAR标记[38]。干滟等(2001)将“蜀杂6号”的父、母本RAPD标记转化为序列特异的SCAR标记,建立了用SCAR-PCR检测杂交油菜“蜀杂6号”杂种纯度的方法,并逐一对照大田杂种一代生产种的表现型,验证了本方法的可靠性[39]。

该方法与随机标记相比,具有高度稳定性,实现了特异性扩增,对某一品种的鉴定提供了方便。该方法与随机半随机标记结合,将起到事半功倍的结果。

2.2　ISSR(Inter-simplesequencerepeat,简单重复间序列)技术

ISSRZietkiewicz年创建的一种简单序列重。SSR的3’4,然后以此为引物,对两DNA序列进行扩增,然后进行电,,来分析不同样品间IS2SR标记的多态性。ISSR技术的原理和操作与SSR、RAPD非常相似,只是引物设计要求不同,但其产物多态性远比RFLP、SSR、RAPD更加丰富,可以提供更多的关干基因组的信息,而且比RAPD技术更加稳定可靠,实验重复性更好[40]。

BlairMW,etal(1999)利用32个ISSR引物构建59个水稻品种指纹图谱,并与同样品种的AFLP、RFLP、同工酶指纹比较,发现ISSR指纹多态性较好,很适合水稻的遗传多样性分析和品种鉴定[40]。PrevostA,etal(1999)用ISSR指纹图谱于鉴别马铃薯品种,仅用了4个ISSR引物就将30多个品种区分开来[41]。IPasakinskiene,etal(2000)利用引物5′-(AGAC)4GC、5′-AC(GACA)4和5′-(GACA)4GT,对4个不同种类草进行ISSR指纹图谱构建,能够区分两种外型很相似的黑麦草,并发现不同品种许多细微的指纹图谱差别,以利于品种鉴定[42]。王心宇等(2001)对ISSR标记技术在构建多态水平很低的小麦

(AC)n、(TG)n种内指纹图谱方面做了初步研究。发现(AG)n、

等二核昔酸重复引物类型在小麦中多态水平最高,能将亲缘关系很近的品种或品系区分开[43]。

ISSR是以PCR技术为基础的分子标记,DNA用量少、技术要求低、多态性水平高、成本低廉,且PCR扩增时退火温度在52℃左右,保证了PCR扩增的可重复性,因而利用ISSR标记建立品种的指纹图谱,利用指纹图谱进行品种纯度和真实性鉴定是很有潜力的方法。2.3　SNP(singlenucleotidepolymorphisms,单核苷酸多态)技术

SNP为同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化,是继限制性片段长度多态性(RFLP)、微卫星标记(SSR)之后的又一种新的分子标记,通常呈双等位基因多态。生命的遗传信息存贮于DNA序列之中,高等生物每一个细胞的全部DNA构成了该生物的基因组。基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的基础。较普遍的DNA序列变异是单个碱基的差异,包括单个碱基的缺失和插入,但更多的是单个碱基的置换,即单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP),这是等位基因间序列差异最为普遍的类型。这种具有单核苷酸差异引起的遗传多态性特征的DNA区域,可以作为

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一种DNA标记,即单核苷酸多态性(SNP)标记[44]。

玉米1号染色体中每104个碱基就出现1个SNP,其多态性程度比人类及果蝇要高得多[45]。Bhattramakki研究组(2002)以8个差异性明显的玉米自交系基因组DNA为模板,用特异引物扩增源于EST的502个基因座。对所得到的400～500bp的PCR产物测序表明,86%基因座的PCR产物具有SNP多态性,52%基因座在两个广为应用的玉米自交系B73和Mo17之间存在SNP多态性[46]。因而,据此多态性,很容易绘制这种插入或缺失的遗传图谱,也可通过分析PCR产物大小,以鉴别各个体的基因型。随着品种基因芯片的逐步开发,各种品种SNP指纹图谱将会不断涌现。2.4　SRAP(Sequence-relatedamplifiedpolymorphism,相关序列扩增多态性)技术

SRAP是一种新型的基于PCR的标记系统,由美国加州大学蔬菜作物系LiG与QuirosCF博士于20xx年提出,又叫基于序列扩增多态性(Sequence-basedamplifiedpolymorphism

[47]

SBAP)(Ferriol,etal.,2003a)。该标记通过一对引物对开放读码框(ORFs)进行扩增,分为17个碱基的正向引物(F-prim2er)和18个碱基的反向引物(R-primer)。反向引物5’端前11个碱基的填充序列,接着为AATT序列,随后也是3’端3个选择碱基。其AATT序列可以对富含AT的内含子区域和启动子区域进行扩增。由于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大,从而与正向引物搭配扩增出基于内含子和外显子SRAP多态性标记[47]。

SRAP标记中,约20%为共显性,性,部分条带为某些作物所特有.,[47,48]

2003)。SRAP,态性产生于两方面:产生共显性标记;核苷酸改变影响引物的结合位点,导致显性标记产生。MariaFerrio,etal(2004)利用11对SRAP引物组合分析47份南瓜种质材料,扩增得到148条条带,其中98条多态性条带,多态性达66.2%,每个引物组合扩增产生6～16条多态性带,平均每个引物产生8.9条带[49]。HBudak,etal(2004)利用ISSR、SSR、RAPD、SRAP四种DNA分子标记比较了草皮草(Buffalograss)的遗传多样性,提出构建品种的DNA指纹图谱,以应用到品种鉴定和品种保护中[50]。

SRAP指纹图谱多态性高;重复性好;操作简单;在基因组中分布均匀;引物具有通用性,而且其正向引物可以与反向引物两两搭配组合,因此用少量的引物可组配得到多个引物对,提高了引物的使用效率,降低引物合成成本。因而利用SRAP构建品种指纹图谱是一种值得尝试的方法。2.5　TRAP(TargetRegionAmplificationPolymorphism,目标区域扩增多态性)技术

TRAP是基于生物信息学工具和EST数据库信息在已知的目的基因序列附近产生多态性标记,是由JinGuoHu和Brady在20xx年提出的新型的基于PCR的标记[51]。TRAP技术可以用来不同基因型种质的收集和能对作物品种所需农艺性状的基因标签[52]。随着生物信息学的崛起,和各种作物EST数据库的日趋完善,各种在高等植物表达区和功能区的分子标记不断涌现[52]。

标准指纹图谱,今后我们要把理论与实践结合,努力构建出不同作物的标准指纹图谱,使其在品种鉴定和纯度分析中发挥出巨大作用。

参考文献:

[1]张春庆,尹燕枰.种子质量检验理论与技术[M].北京:中国农业科技出版社,1995.7.

[2]杨金水.基因组学[M].北京:高等教育出版社,2002,6.12-55.[3]温孚江,郑成超,崔德才.农业生物技术[M].北京:中国科学技术出版社,2002,1.176-186.

[4]SmithJVC,SmithOS.Restrictionfragmentlengthpolymorphismscandifferentiateamonghybrids[J].CropScience,1991,31:893-899.

[5]VacineP,AccerbiM.CultivaridentificationinTaestivumusinghighlypolymorphismRFLPprobes[J].TheorApplGenet,1993,86:833-836.

[6]张培江,才宏伟,袁平荣,等.RFLP标记水稻遗传距离及其与杂种优势的关系[J].杂交水稻,2001,16(5):50-54.

[7]黄益勤,李建生.利用RFLP标记划分45份玉米自交系杂交优势群的研究[J].中国农业科学,2001,34(3):244-250.[8]袁力行,傅骏骅,WarburtonM.利用RFLP、SSR、AFLP和RAPD标记分析玉米自交系遗传多样性的比较研究[J].遗传学报,2000,27(8):725-733.

[9]包颖,葛颂.根据核DNA的ITS序列的RFLP分析鉴定稻属CD染色体组物种[J].植物学报,2003,45(7):762-765(inEnglish).

[10]TinkerNA,FortinMG,MatherE.RandomamplifiedpolymorphicDNAandrelationshipsin[J].Theor.Appl.Genet,1993:976,LJDNAextractionfromdryseeds].SeedSciTechnol,1994,22:[12]向太和,汪秀峰,李莉,等.利用RAPD标记对我国主栽的籼优杂交稻和其亲本进行区别和鉴定[J].作物学报,2000,26(3):292-296.

[13]FernandezME,FigueirasAM,BenitoC.TheuseofISSRandRAPDmarkersfordetectingDNApolymorphism,genotypeidentificationandgeneticdiversityamongbarleycultivarswithknownorigin[J].TheorApplGenet,2002,104:845-851.

[14]VSubramanian,SGurtu,RCNageswaraRao,etal.IdentificationofDNApolymorphismincultivatedgroundnutusingrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)assay[J].Genome,2000,43(4):656-660.

[15]莫结胜,刘杰,刘公社.杂交油葵A15种子纯度的RAPD鉴定[J].作物学报,2001,27(1):85-90.

[16]王灏,王道杰,李成梅,等.利用RAPD技术进行杂交油菜杂油59品种鉴定和纯度分析[J].中国农业科学,2002,35(12):1550-1555.[17]NNandakumar,AKSingh,RKSharma,etal.Molecularfingerprintingofhybridsandassessmentofgeneticpurityofhybridseedsinriceusingmicrosa2tellitemarkers[J].Euphytica,2004,136:257-264.

[18]SmithJSC,ChinEOL,ShuH,etal.AnevaluationoftheutilityofSSRlociasmolecularmarkersinmaize(ZeamaysL.):ComparisonwithdatafromRFLPsandPedigree[J].Theor.Appl.Genet,1997,95:163-173.[19]李云海,肖晗,张春庆,等.用微卫星DNA标记检测中国主要杂交水稻亲本的遗传差异[J].植物学报,1999,41(10):1061-1066.

[20]彭锁堂,庄杰云,颜启传,等.我国主要杂交水稻组合及其亲本SSR标记和纯度鉴定[J].中国水稻科学,2003,17(1):1-5.

[21]李晓辉,李新海,李文华,等.SSR标记技术在玉米杂交种种子纯度鉴定中的应用[J].作物学报,2003,29(1):63-68.

[22]李晓辉,李新海,高文伟,等.玉米杂交种DNA指纹图谱及其在亲子鉴定中的应用[J].作物学报,2005,31(3):386-391.

[23]吴渝生,杨文鹏,郑用琏.3个玉米杂交种和亲本SSR指纹图谱的构建[J].作物学报,2003,29(4):496-500.

[24]武耀廷,张天真,郭旺珍,等.陆地棉品种SSR标记的多态性及用于杂交种纯度检测的研究[J].棉花学报,2001,13(3):131-133.

[25]郝晨阳,王兰芬,贾继增,等.SSR荧光标记和银染技术的比较分析[J].作物学报,2005,31(2):144-149.

[26]袁力行,傅骏骅,WarburtonM,等.利用RFLP、SSR、AFLP、和RAPD标记分析玉米自交系遗传多样性分析的比较研究[J].遗传学报,2000,27(8):725-733.

[27]王凤格,赵久然,郭景伦,等.中国玉米新品种标准DNA指纹库构

3　展望

伴随着育种进程和种子贸易的发展,特别是我国加入WTO和市场经济体制的建立,迫切需要建立一套快速准确的品种鉴定体系。DNA指纹图谱技术具有高度的个体特异性和环境稳定性,甚至可以检测到一些基因组中的微小变异,具有准确性强、鉴别能力强等优点。虽然目前各种分子图谱技术存在技术上的不足,但是不同分子指纹图谱的相互结合非常适合于品种鉴定、纯度分析以及品种保护等工作。目前,DNA指纹图谱技术仅仅停留在实验室水平,并且没有各种作物的

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20xx年8月BIOTECHNOLOGYAug12005

建研究的几点思考[J].植物学通报,2005,22(1):121-128.

[28]MJBlears,SADeGrandis,HLee,etal.Amplifiedfragmentlengthpolymorphism(AFLP):areviewoftheprocedureanditsapplications[J].JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology,1998,21(3):99-114.

[29]WangXJ,SantoshG,NiganN.FingerprintinginGroundnutusingAFLPΠΠEighteethinternationalcongressofgeneticsabstract[C].Beijing,Chi2na,1998.154.

[30]ZHANGChun-qing,JIAJi-zeng.StudiesontheprimersscreeningforAFLPFingerprintsofricecultivars[J].AgriculturalSciencesinChina,2002,9(1):949-953.

[31]高世斌,李晚忱,荣廷昭,等.玉米骨干自交系AFLP指纹图谱鉴定[J].四川农业大学学报,2001,19(2):126-128.

[32]宋国立,张春庆,贾继增,等.棉花AFLP银染技术及品种指纹图谱应用初报[J].棉花学报,1999,11(6):282-283.

[33]朱云国,王学德,李悦有.用AFLP技术构建棉花雄性不育三系及杂交种F1的DNA指纹图谱[J].棉花学报,2001,13(3):158-160.[34]CheKe-peng,XuYong,LiangChun-ya,etal.AFLPFingerprintandSCARmarkerofwatermeloncorecollection[J].ActaBotanicaSinica,2003,45(6):731-735.

[35]张春庆,贾继增.玉米AFLP指纹图谱的引物选择研究[J].作物学报,2002,28(2):221-226.

[36]张春庆,贾继增.利用AFLP鉴定玉米自交系及杂交种[J].山东农业大学学报(自然科学版),2003,34(3):427-430.

[37]张志永,张劲松,巩学千,等.抗SMV栽培大豆种质资源的SCAR标记指纹图谱分析[J].高技术通讯,1998,10:49-53.

[38]王斌,张超良,翁曼丽,等.玉米自交系8112特异SCAR得[J].高技术通讯,1999,3:45-47.[39]干滟,曾凡亚,赵云.(SCAR)].,(6):722-728.

[40]BlairMW,PanaudO,MeCouchSR.Inter—simplesequencerepeat(IS2SR)amplificationforanalysisofmicrosatellitemotiffrequencyandfingerprintinginrice(OryzasativaL)[J].Theor.Appl.Genet,1999,98:780-792.

[41]PrevostA,WilkinsonMJ.AnewsystemofcomparingPCRprimersap2

pliedtoISSRfingerprintingofpotatocultivars[J].TheorApplGenet,1999,98:107-112.

[42]IPasakinskiene,CMGriffiths,AJEBettany,etal.Anchoredsimple-sequencerepeatsasprimerstogeneratespecies-specificDNAmarkersinLoli2umandFestucagrasses[J].TheorApplGenet,2000,100:384-90.

[43]王心宇,陈佩度,亓增军,等.ISSR标记在小麦指纹图谱分析中的应用研究初探[J].农业生物技术学报,2001,9(3):261-263.

[44]杜春芳,刘惠民,李润植,等.单核苷酸多态性在作物遗传及改良中的应用[J].遗传,2003,25(6):735-739.

[45]TenaillonM,SawkinsMC,LongAD,etal.PatternofDNAsequencepolymorphismalongchromosome1ofmaize[J].ProcNatl.AcadSci,USA,2001,98:9161:9166.

[46]BhattramakkiD,DolanM,HanafeyM,etal.Insertiondeletionpolymor2phismsin3’regionsofmaizegenesoccurfrequentlyandcanbeusedashighlyinformativegeneticmarkers[J].PlantMolBiol,2002,48(5-6):537-547.

[47]LiG,QuirosCF.Sequence-relatedamplifiedpolymorphism(SRAP),AnewmarkersystembasedonasimplePCRreaction:itsapplicationtomappingandgenetagginginBrassica[J].TheorApplGenet,2003,107(1):168-180.[48]LinZX,ZhangXL,NieYC,etal.ConstructionofgeneticlinkagemapforcottonbasedonSRAP[J].ChineseScienceBulletin,2003,48(9):2063-2067.

[49]MariaFerriol,BelenPico,PascualFernandezdeCordova,etal.Molecu2lardiversityofaplasmcollectionof(Cucurbitamoschata).deter2minedSRAPAFScience,2004,44:653-664.,.Comparativeanalysisofseed2onphylogeneticrelationshipusing,andSRAPs[J].TheorApplGenet.,2004,109:280-[51]JinGuoHu,BradyAVick.Targetregionamplificationpolymorphism:Anovelmarkertechniqueforplantgenotyping[J].PlantMolecularBiologyRe2porter,2003,21:289-294.

[52]PKGupta,SRustgi.MolecularmarkersfromthetranscribedΠexpressedregionofthegenomeinhigherplants[J].Functional&IntegrativeGenom2ics,2004,4(3):139-162.

Ⅲ类内含子及其对基因表达的影响

郑斌,詹希美

(中山大学中山医学院寄生虫学教研室,广东广州510080)

摘要:内含子是指断裂基因中的非编码区序列。根据内含子的核苷酸序列和RNA潜在折叠方式不同,可分成四种类型:I类内含子、Ⅱ类内含子、Ⅲ类内含子和Ⅳ类内含子。Ⅲ类内含子为真核细胞前mRNA中的内含子。它可以启动某些基因的表达,影响基因的表达量;增加mRNA分子的稳定性;并通过选择性剪接调控基因的表达。Ⅲ类内含子可以提高转基因动物基因的表达效率。因此,基因工程中,为了提高表达效率,是选用基因组基因还是cDNA基因,应视具体基因而定。

关键词:内含子;mRNA;基因表达:选择性剪接;转基因动物

中图分类号:Q522　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2005)04-0077-03

　　外源基因能否在表达体系正确的、高水平的表达,是基因工程中最重要的问题。影响外源基因表达的因素有多种,如基因信号肽序列、载体密码子的偏嗜性和最佳诱导表达条件等。随着分子生物学技术的发展,人们发现作为非编码序列的内含子(特别是Ⅲ类内含子)对基因表达有相当重要的作用。因此,基因工程中,在构建表达载体时,应考虑内含子对基因表达的重要影响,以期达到外源基因高水平表达的目的。

1　内含子及其类型

19xx年麻省理工学院的PhillipSharp和冷泉港实验室的RichardRoberts等人发现了断裂基因(此工作获19xx年诺贝尔

收稿日期:2004-12-19;修回日期:2005-06-03

基金项目:国家自然科学基金项目(No.30170837);国家十五科技攻关项目(No.2003BA712A03-07)资助

作者简介:郑斌(1970-),女,博士生,从事寄生虫免疫与分子生物学的研究,Tel:020-87331583,E-mail:zhengbin8899@sina.com;詹希美(1945-),男,博士生导师,教授,从事寄生虫免疫与分子生物学的研究,主编国家统编教材五年制、八年制《人体寄生虫学》。

生理学与医学奖)。该发现使人们对基因结构的认识产生了

一次质的飞跃。绝大多数真核基因和某些原核基因是断裂基因,即基因由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成。编码区序列称为外显子(exon),非编码区序列称为内含子(intron),又称为间插序列(interveningsequence)。基因表达时,外显子和内含子被一起转录成一个前体RNA分子,再通过RNA剪接删除内含子序列而把外显子序列连接起来,产生成熟的有功能的mRNA、rRNA或tRNA。

根据内含子存在的宿主不同可以分为:mRNA内含子、tR2NA内含子、rRNA内含子、snoRNA内含子和snRNA内含子等;根据其核苷酸序列和RNA潜在折叠方式不同,可分成四种类型:I类内含子、Ⅱ类内含子、Ⅲ类内含子和Ⅳ类内含子[1]。I类内含子(groupIintrons)存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的rRNA基因中,极个别的Ⅰ类内含子存在于原核生物的噬菌体中。Ⅱ类内含子(groupⅡintrons)主要见于细胞器(如线粒体)、细菌中。Ⅲ类内含子(groupⅢintrons,又称核mRNA前体内含子)最为常见,即绝大多数真核细胞前mRNA中的内含子。Ⅳ类内含子(groupⅣintrons),又称核tRNA前体内含