分子克隆技术试题
龟叔
一：填空
1.PCR反应体系中加入矿物油的作用是：（防止体系蒸发）
2.分子克隆连接外院DNA片段与载体之前，需对载体进行去磷酸化处理，本次实验使用的碱性酶是：（ 牛小肠碱性磷酸酶 CIAP ），目的是（ 防止载体自连 ）。
3.α-互补中含有外源片段的菌落是（白 ）色。
4.Southern杂交中预杂交的目的是（ 封闭非特异性位点，减少杂交背景 ）
5.凝胶电泳时加入Longding buffer 的目的是（含甘油或蔗糖使DNA在点样时容易沉下 ）和（ 电泳指示剂指示电泳进程 ）
6.影响琼脂糖凝胶电泳的因素有（ DNA大小 ）、（DNA构象 ）、（琼脂糖浓度 ）、（ 电压大小 ）、（ 是否含有嵌入染色剂 ）、（碱基组成与温度）、（缓冲液组成及离子强度）
二.简答
1.PCR反应体系的成分及作用。
A 模板DNA：为扩增提供模板
B Mg2+:影响反应特异性和扩增片段的产率
C 反应缓冲液：使聚合酶作用环境维持偏碱性
D dNTP：反应底物
E Tap DNA聚合酶：具有5’－3’的聚合酶活性和5’－3’的外切酶活性
F 引物：启动互补链的合成。
2.为得到质量较好的RNA，抽提前应如何准备？RNA抽提过程中，RNA的保存以及以后RNA的操作过程中应特别注意什么？
答：当处理RNA时，移液器专用
保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用；
溶液和试剂分装成小份保存
RNA电泳装置专用（清洗、处理、DEPC处理过的水冲洗）
准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，用0.1％的DEPC在37?C处理溶液1小时后在15psi(1.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。
180－300?C烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品 使用新的、无RNA酶的一次性tubes, tips等
在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶的活性。
材料要新鲜
3.简述放射性同位素对人体的伤害，及操作放射同位素中我们应注意什么？ 答：
4.影响电转化感受态细胞转化效率的因素？
答：（1）细胞的生长状态非常重要，快速生长的细胞最适于制备感受态细胞；
（2）细胞转化效率与所加电场的强度和脉冲持续时间有关。细胞上穿孔的数目和孔径大小随着所加电场的强度和脉冲持续时间的增加而增加，但超过了一定的限度，就会对细胞造成伤害。不同的细胞最适的电压不同，从450v/cm（昆虫细胞）到高于12.5 kv/ cm（细菌
细胞），同时也与所使用的电转化杯有关，对于大肠杆菌而言，0.1cm的杯子使用1.8 kv（18 12.5 kv/ cm），0.2cm的杯子使用2.5kv （12.5 kv/ cm) 。时间一般设置为5毫秒
（3）外源分子的纯度。杂质在转化过程中会转入细胞造成不可预知的影响，且常常增加细胞的死亡率
（4）制备感受态细胞所用的水应达到18MΩ即使用MilliQ级的超纯水，化学试剂应是分子生物学级。
（5）同样原因，所使用的枪头和器皿都应是新的，干净的
尽可能快的稀释转入合适培养基中让细胞复苏
电转化杯的质量非常重要
5.质粒抽提Solution1/2/3以及异丙醇的作用，在操作时应注意什么？
答：（1）solution I 重悬细菌
（2）solution II，其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH 使DNA变性、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开
（3）Solution III 中和后，宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配对就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来，而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。
（4）无水乙醇或95%乙醇或异丙醇：沉淀质粒DNA
注意：加溶液 I后应彻底打匀沉淀和碎块。
加溶液II后放置最好不超过2分钟。
加溶液III颠倒要颠倒混匀，在冰上放置。
三，实验分析
1.描述并图示Puc19载体DNA及其在Hind3位点克隆了外源DNA片段的质粒DNA和水稻总DNA及其在Hind3 和BamH I酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时的带型 2利用质粒载体克隆外源DNA片段时应有哪些步骤，涉及哪些工具酶，获理想效果应注意什么
1. 两种载体的抽提
2. 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量
3. 两种载体的限制性内切酶消化
4. 目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化
5. 载体与外源DNA的连接
6. 感受态细胞的制备
7. 连接子转化感受态细胞
8. 重组子筛选及鉴定
所有操作都应在无菌条件下进行和冰上，DNA纯度要好，转化时器皿应干净。防止星星活性的出现，苯酚氯仿等有刺激性，使用时应戴手套，通风橱。
3.Southern杂交中，同一根杂交管中曝光冲洗后有些组X-光片段信号强，有些组信号很弱，有的样品附近点样孔附近有较强的信号，但有的地方信号较弱，试分析原因。
第二篇：入党积极分子个人总结
入党积极分子自我总结
我于20xx年x月参加了党校举办的第四期入党积极分子培训班的学习，通过各位老师的讲解和对《入党教材》认真细致的学习，使我对中国共 产 党的性质、中国共 产 党的指导思想、中国共 产 党的最终目标和现阶段任务、以及做一个合格的共 产 党员需要具备的条件有了更加深刻的认识。
我深刻认识到，要成为一名共 产 党员，必须要树立坚定的共产主义信念。只有树立了坚定的共产主义信念，才能正确认识党的性质和任务，端正入党动机；才能产生巨大的精神动力，焕发出高度的积极性和创造性，脚踏实地，艰苦奋斗，朝着实现共产主义社会的目标前进；才能有坚强的革命意志，在任何情况下捍卫自己的信仰和事业，为完成党交给的任务不怕艰难险阻，不惜牺牲个人的一切，坚贞不渝地为共产主义事业而奋斗；才能把个人的一生同整个共产主义事业有机地结合起来，真正懂得人生的意义，树立起崇高的共产主义道德情操，自觉地防止腐朽思想的侵蚀，更好地为党和人民工作 中国共 产 党有马克思列宁主义、毛泽东思想、邓小平理论、三个代表作为思想指南，为我们指明了前进的方向。中国共 产 党保持了先进性和纯洁性，并领导我们不断取得社会主义革命和建设的伟大胜利。
作为一名积极加入中共 产 党的新时代青年，树立了正确的世界观、人生观和价值观，增强了党性观念，坚定了理想信念，提高了理论素质和政治水平。我认识到，我们只有把个人价值和社会价值联系起来，才能使自己的人生显得充实亮丽而有意义。我们要勇于打破旧的框架，积极探索，开拓创新，实事求是。我们要在时间中发现真理、检验真理。
我通过这次学习，使我更深一层次了解了党的性质、目标、方针、政策阶级性、先进性、党的根本宗旨、党在社会主义建设事业中的地位和作用。从对共 产 党的认识中可以看到，在党的纪律和组织框架内是适合个人的全面发展的。
我清醒的认识到，要成为一名光荣的党员，就要吃苦在前，享受在后，克已奉公，多作贡献。作为一名新时期的先进青年，先进的大学生，在生活中，克勤克俭，严格要求；在学习上，不断增加新的科学文化知识，不断提高自我政治理论修养；在工作中，时刻以党员的标准来衡量自己，积极工作；时刻准备接受党的考验!