一、扩增
1、LB培养基5ml；
2、抗生素：1000X，即1:1000比例。种类根据细菌抗性决定；
3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；
4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA
1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；
2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。取三次；
3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；
4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH） 200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；
5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；
*备注：S1：S2：S3=5:5:7
6、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；
7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；
8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。重复一遍；
9、空管离心12000xg，1min；
10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）
三、酶切体系
37°两小时以上即可
四、跑胶回收：sost回收失败
1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法
大块胶60ml；小块胶25ml；
需要配置大块胶、大孔胶；
Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；
趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；
倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。所以大槽25cm，150v即可。小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；
4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；
5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；
6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；
7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；
8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；
9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；
10、空离心2min，弃废液；
11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；
12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；
五、连接体系：
16℃ 过夜
六、转化
1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；
2、激活：42℃，90s，不能震动；
3、加500ul LB培养基；
4、37℃，150转摇床，45min；
5、铺板子
七、检测
1、细菌长势良好，对照组不长；
2、酶切检测：
（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；
（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）
5.5ul water
1ul上游引物
1ul下游引物
（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；
（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；
（5）15ul Pcr调节：
显示4°/4°时，结束。
（6）Pcr显示有结果，则将相对应的1ml LB体系扩增，见步骤一、扩增；
（7）重复步骤二、纯化质粒DNA；三、酶切体系；四、跑胶但不回收；
（8）有结果则证明之前的酶切、连接、转化成功。
第二篇：分子克隆操作流程
分子克隆操作流程
——From CXY
各Marker条带大小：
Marker DL2000: 100,250,500,750,1000.2000.3000.5000bp
Marker 1KB: 1,2,3,4,5,6,8,10kbp
Marker DL15000: 250.1000.2500.5000.7500.10000.15000
Day 1
一、 准备
1、 合成含适当酶切位点并带有保护碱基CCC的引物
2、 分别挑含目的片段质粒和载体质粒的宿主菌单克隆，37℃摇过夜
Day 2
二、 提质粒
1、 提含目的片段质粒和载体质粒
2、 nano定量
3、 1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定质粒纯度，看是否混入基因组DNA（两条带），并粗略估计质
粒浓度
上样情况：
Marker 含目的片段质粒 载体质粒
三、 PCR扩增目的片段
1、 体系：
LA taq 0.5ul
10*LA taq buffer II 5ul
dNTP 4ul
含目的片段质粒 0.5ul (0.1ng~10ng)
primer1 and primer2(20uM) 各1ul
ddH2O up to 50ul (38ul)
条件：
94℃ 5min
94℃ 30s
55℃（根据引物Tm值确定） 30s
72℃ 50s（根据目的片段长度确定，1min扩1kb） 72℃ 1min
25cycles
2、 1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段
3、 1%琼脂糖凝胶电泳，看切胶回收目的片段纯度如何
（三）、overlapping PCR扩增目的片段（以真核表达2P2F全抗为例）
1、 从pET32a_scAb_2P2F质粒中扩增VK_CK片段
体系：
pyrobest taq 0.5ul
10* pyrobest taq buffer II 5ul
dNTP 4ul
pET32a_scAb_2P2F质粒 0.5ul (0.1ng~10ng)
primer1:VK5_2_120207 1ul
primer2: CK3_120207 1ul
ddH2O up to 50ul (38ul)
条件：
94℃ 5min
94℃ 30s
65℃（根据引物Tm值确定，可拉梯度） 30s
72℃ 50s（691bp，1min扩1kb）
72℃ 1min
25cycles
电泳鉴定片段大小（691bp），切胶回收（柱子吸附70bp~20kbp），可DNA定量并再次电泳鉴定回收质量
2、 从pET32a_scAb_2P2F质粒中扩增VH片段
体系：
pyrobest taq 0.5ul
10* pyrobest taq buffer II 5ul
dNTP 4ul
pET32a_scAb_2P2F质粒 0.5ul (0.1ng~10ng)
primer1:VH5_2_120207 1ul
primer2: VH3L_120207 1ul
ddH2O up to 50ul (38ul)
条件：
94℃ 5min
94℃ 30s
65℃（根据引物Tm值确定，可拉梯度） 30s
72℃ 50s（394bp，1min扩1kb）
72℃ 1min
25cycles
电泳鉴定片段大小（394bp），切胶回收（柱子吸附70bp~20kbp），可DNA定量并再次电泳鉴定回收质量
3、 从pMD18T-IgG质粒中扩增CH(IgG)片段
体系：
pyrobest taq 0.5ul
10* pyrobest taq buffer II 5ul
dNTP 4ul
pET32a_scAb_2P2F质粒 0.5ul (0.1ng~10ng)
primer1:CH5L_120207 1ul
primer2: CH3_120207 1ul
ddH2O up to 50ul (38ul)
条件：
94℃ 5min
94℃ 30s
65℃（根据引物Tm值确定，可拉梯度） 30s
72℃ 50s（1001bp，1min扩1kb）
72℃ 1min
25cycles
电泳鉴定片段大小（1001bp），切胶回收（柱子吸附70bp~20kbp），可DNA定量并再次电泳鉴定回收质量
4、 再次扩增VK_CK片段
体系：
pyrobest taq 0.5ul
10* pyrobest taq buffer II 5ul
dNTP 4ul
VK_CK第一轮扩增片段 0.5ul (~50ng)
primer1:VK5_1_120207 1ul
primer2: CK3_120207 1ul
ddH2O up to 50ul (38ul)
条件：
94℃ 5min
94℃ 30s
65℃（根据引物Tm值确定，可拉梯度） 30s
72℃ 50s（730bp，1min扩1kb）
72℃ 1min
25cycles
电泳鉴定片段大小（730bp），切胶回收（柱子吸附70bp~20kbp），可DNA定量并再次电泳鉴定回收质量
5、 overlapping连接VH片段和CH片段
体系：
pyrobest taq 0.5ul
10* pyrobest taq buffer II 5ul
dNTP 4ul
VH第一轮扩增片段 0.5ul (50ng)
CH第一轮扩增片段 0.5ul (50ng)
primer1:VH5_1_120207 1ul
primer2: CH3_120207 1ul
ddH2O up to 50ul (38ul)
条件：
94℃ 5min
94℃ 30s
65℃（根据引物Tm值确定，可拉梯度） 30s
72℃ 50s（1420bp，1min扩1kb）
72℃ 1min
25cycles
电泳鉴定片段大小（1420bp），切胶回收（柱子吸附70bp~20kbp），可DNA定量并再次电泳鉴定回收质量
6、 加A尾（pybest 外切酶）
体系
A-Tailing enzyme 0.5ul
10*A-Tailing Buffer 5ul
dNTP Mixture 4ul
末端平滑DNA片段 补齐至50ul（0.5~5ug）
ddH2O
条件
72℃反应20min，冰上静置1~2min
7、 连接T载体
pMD18-T vector 1ul
上述A-Tailing DNA溶液 4ul（0.1~0.3pmol）
ddH2O 0
Solution I 5ul（等体积）
条件
16℃反应30min
8、 转化
10ul上述产物转化100ul DH5a，涂板37℃生长过夜
四、 分别酶切载体质粒和目的片段
1、 体系：
酶1 and 酶2 各1ul
10* Buffer N（参照说明书选择合适buffer） 5ul
100*BSA 0.5ul
载体质粒20ul（<1ug，少好防止载体自连或者载体转入感受态降低克隆阳性率） 或者scFv_2P2F片段 补齐（越多越好）
to 50ul ddH2O up
条件：
37℃ 2~4hr
2、 1%琼脂糖凝胶电泳，先小样鉴定酶切情况，再大样切胶回收载体质粒（酶切片段无需切
胶回收只需过柱纯化，柱子吸附70bp~20kbp）。小样时未酶切载体质粒应比酶切载体质粒跑得快（环状比线性快，偶尔反之），酶切载体质粒应当看到切下的小片段（与染料结合能力与片段大小有关，因此条带可能较弱，且<50bp条带看不清，如果看不清在大样回收时应密切关注是否有切下的小片段）。如果以上两点不符合，有可能酶切失败，需重新配制酶切体系加酶量且拉长酶切时间（如果载体质粒未切开，目的片段一般也未切开，也需重新配）。
上样情况：
小样：Marker 未酶切载体质粒 酶切载体质粒 酶切片段
大样：Marker 酶切载体质粒
五、 连接
1、 体系：
T4 DNA Liganse 1ul
10* T4 Buffer 2ul
质粒酶切产物 2ul
目的片段酶切产物 15ul
条件：
16℃ 1hr（或过夜）
或者室温30min（或2~3hr）
六、 转化
1、 取10ul连接产物转化相应感受态（通常为DH5a）
Day 3
七、 菌落PCR鉴定阳性克隆，并划板存菌37℃生长过夜
1、 体系：
LA taq 0.5ul
10*LA taq buffer II 5ul
dNTP 4ul
primer3 and primer4(20uM，载体上引物，或载体加目的片段引物) 各1ul
单克隆菌落
ddH2O up to 50ul (38ul)
条件：
94℃ 5min
94℃ 30s
55℃（根据引物Tm值确定） 30s
72℃ 50s（根据目的片段长度确定，1min扩1kb） 72℃ 1min
25cycles
2、 1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性克隆
Day 4
八、 酶切鉴定并测序
1、 挑阳性克隆37℃摇~8hr
2、 送至测序公司测序（载体两侧引物和目的片段上游反向引物）
3、 提阳性克隆质粒
4、 酶切鉴定阳性克隆质粒是否为假阳性（选做）
体系：
酶1 and 酶2 各0.5ul
10* Buffer N（参照说明书选择合适buffer） 2ul
100*BSA 0.2ul
阳性克隆质粒 5ul(1ug)
to 20ul ddH2O up
条件：
37℃ 2~4hr
1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定酶切成功与否，同样看未酶切与酶切跑得快慢，以及切下片段大小。
上样情况：
Marker 未酶切质粒 酶切质粒
end