分子克隆
实验报告
实验名称： 分子克隆、分子杂交、基因表达检测
实验类型： 综合性
指导教师： 李一博
班级： A
姓名： 孙阳阳
学号： 2014304110100
实验时间： 2015/8/19—2015/8/25
实验一 分子克隆
DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分
实验原理及方法
DNA提取：（CTAB法） CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65°C水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。感受态细胞的制备及质粒的转化
质粒提取：在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA
CaCl2法：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。106 ～ 107转化子/mg DNA。
酶切酶连：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平末端的外源片段，经纯化处理后的DNA用于连接反应；选择克隆载体pUC19多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。
实验材料和试剂
携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液；
携带含有水稻DNA片段的M812载体的大肠杆菌菌液；
氨苄青霉素、卡那霉素；
RNaseA；
碱裂解法试剂
Solution I: Tris.HCl （pH 7.5） 50 mM
EDTA 10 mM
RNase A 100 µg/ml
Solution II: NaOH 0.2 M
SDS 1 %
Solution III: KAC 1.32 M
Using HAC to adjust pH to 4.8
TE (pH 8.0)： Tris.HCl （pH 8.0） 10 mM
EDTA （pH 8.0） 1 mM
苯酚/氯仿、无水乙醇或异丙醇
主要实验步骤
- 两种载体的抽提
- 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的质量
- 两种载体的限制性内切酶消化
- 目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化
- 载体与外源DNA的连接
- 感受态细胞的制备
- 连接子转化感受态细胞
- 重组子筛选及鉴定
实验结果与分析
- 质粒的质量检测，-20℃保存。
电泳结果，只检测条带不有点marker
M5、M6条带较亮有拖带，可能点样偏多
A260/280质较好，提取效果比较好
琼脂糖凝胶电泳点样顺序
pUC19质粒酶切产物(1—4)
pUC19质粒对照（5）
Marker（6）
M812 质粒对照（7）
M812质粒酶切产物（8—11）
- 涂皿生长结果
5,6,7,8蓝白斑不明显，肉眼可见蓝色小斑点。阳性对照蓝色斑点很多也长了白斑。
产生这种结果的原因可能无菌操作有问题，感受态制备不好。
实验二、分子杂交
对于大的基因组，DNA酶切图谱凭肉眼是分辨不开的（EB染色），因为大小不等的分子呈现弥散分布，只有借助灵敏的放射性同位素（或其他发光物质），将靶DNA在凝胶上（膜上）的带型通过特定的探针与之杂交，转换成X光片上直观的带型，才能进行相关分析。另外如果需要鉴定或寻找与已知DNA同源的DNA片段如：染色体步查、基因组文库的评价和利用、阳性克隆的分析鉴定、转基因拷贝数分析等也都需进行DNA的分子杂交实验。杂交探针的标记可以采用同位素或地高辛标记，两种标记探针的分子杂交、洗膜过程和信号检测方法不同。
实验目的：水稻转基因植株的阳性鉴定及拷贝数检测
实验原理：
带正电荷的尼龙膜强度高，不易破损，具有较大的DNA结合容量，它能够吸附变性DNA，核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有同样吸附DNA功能，经向上的毛细吸附作用，在转移缓冲液的带动下把DNA从凝胶上转到膜上。DNA转到膜上是复制胶上的带型，在80-100℃真空干燥2-4 hrs，即可固定DNA。转膜方法一般有两种，即盐转移和碱转移，本实验选用盐转移的方法。
实验过程
- 植物总DNA的抽提
- 植物总DNA质量检测
- DNA的琼脂糖凝胶电泳
- 限制性内切酶操作
- Southern Blotting
- 探针的地高辛标记、杂交、免疫反应及显色
实验结果与分析
植物总DNA浓度检测结果
A260/A280值偏高，可能提取过程中RNA未除尽。
酶切效果检测
琼脂糖凝胶电泳结见DNA酶切图，照胶不太清晰 ， A5-A8酶切条带有，能够看到切开，剩余产物可电泳做分子杂交
分子杂交结果照像
只有marker和阳性对照结果出现
其他均无杂交条带，可能DNA酶切
质量不好，或者电泳胶上边切多了，杂交条带在上面未转到膜上。
实验三、基因表达检测
在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是分子生物学和基因操作的重要内容。Northern 杂交可以测定总RNA或poly(A)+ RNA 中特定mRNA分子的大小和表达丰度，RNA分子在变性琼脂糖凝胶中电泳，按其分子的大小分开，然后将RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，经过体外铰链固定，用放射性同位素标记的DNA或RNA探针与之杂交，放射自显影后即可以得到待测基因RNA表达水平的情况；RT-PCR以mRNA 反转录生成的cDNA作为PCR的模板进行扩增，比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。
实验原理：
mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR；RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。
实验目的：检测基因的表达水平
实验过程
- 植物总RNA的抽提（trizol）
- RNA电泳
- mRNA的反转录
- PCR技术
- RT-PCR
实验结果与分析
RNA质量检测：电泳
没有明显的两条带，28S和18S没有区分，有拖带。
出现此结果的原因，RNA提取过程中有降解，电泳过程中RNA降解
RT-PCR电泳结果
有明显的条带，marker不太好亮度不够，
也表明RNA反转录不错
第二篇：分子科学与工程专业寒假社会实践个人总结心得体会报告
分子科学与工程专业
寒假社会实践
个
人
总
结
本文个人原创，绝非复制
本文包括分子科学与工程专业社会实践目的、实践内容、心得体会三部分，共4页。
学 院： 专 业：分子科学与工程专业 班 级：分子科学与工程专业1109班 姓 名： 学 号： 实践时间：
一、社会实践目的
实践是检验真理的唯一标准。作为分子科学与工程专业的当代大学生，社会实践活动可以说是每个分子科学与工程专业学生假期的必修课。随着时代发展，分子科学与工程专业与时俱进、日新月异。为了更好地了解分子科学与工程专业在社会实践中的应用，更好地理论联系实际，我特地参加了分子科学与工程专业相关岗位的实践活动。
分子科学与工程专业相关岗位社会实践活动可以充分检验自己大学分子科学与工程专业的基本理论掌握情况和分子科学与工程专业知识应用能力。通过分子科学与工程专业相关岗位社会实践活动，也让我们在假期中摆脱计算机网络、青春偶像剧的诱惑和束缚，让我们分子科学与工程专业的大学生走出自己的小天地，去熟悉社会上分子科学与工程专业的实际应用情况，了解分子科学与工程专业自身发展趋势与积极意义，并发现国内时势及身边热点话题，关注周边地区的经济发展。
在分子科学与工程专业相关岗位社会实践活动探索的过程中，肯定也会遇到困难，那么利用分子科学与工程专业相关知识处理并解决困难的同时，我们分子科学与工程专业的实际应用的能力也在不知不觉中提高。不仅如此，我们在分子科学与工程专业相关岗位社会实践活动也会让我们学习到在分子科学与工程专业课本上没有的知识与技能，让我们清楚的了解到分子科学与工程专业背后一些用书本无法获取的知识财富，如值得每一位分子科学与工程专业学生思考并能反映分子科学与工程专业发展中所存在的不足，这些都会帮助分子科学
与工程专业的我们从更新更高的层次去了解社会、锻炼自己，促进自身世界观、人生观、价值观的良好发展。
二、社会实践内容
大学第一年的学习生活很快就结束了，通过在大学一年的学习我了解到了许多分子科学与工程专业的相关知识，掌握了分子科学与工程专业的实践技能，也知道了不少课本中所没有的知识。“求实、创新、严谨、勤奋”的校风让我更是明白在以后学习、生活过程中用该怎样去做；培养“高水平、高素质、高技能”的分子科学与工程专业人才要求一直鼓舞并促使我想这样的高度去进发，去努力拼搏。 因此，配合好、落实好、实施好关于这学期大学生假期社会实践活动，让自己的分子科学与工程专业知识得到更好的应用和延伸，我有幸参加了分子科学与工程专业相关岗位的见习。
我在分子科学与工程专业相关岗位见习任务有：①负责单位分子科学与工程专业相关资料的整理；②利用大学分子科学与工程专业知识和计算机知识帮忙策划分子科学与工程专业工作简报、拟写见习单位报告或季度总结、并利用分子科学与工程专业知识撰写各类公文文件以及工作电脑维护与管理等。③利用大学分子科学与工程专业知识，协助解决单位分子科学与工程专业相关方面遇到的问题。
三、社会实践心得
通过次分子科学与工程专业相关岗位社会实践活动，我以“善用
分子科学与工程专业知识，增加分子科学与工程专业经验，提高分子科学与工程专业实践能力，丰富假期生活”为宗旨，利用假期参加分子科学与工程专业相关岗位社会实践活动，接触分子科学与工程专业相关岗位，了解分子科学与工程专业发展趋势，从分子科学与工程专业相关岗位社会实践活动中检验自我，这次分子科学与工程专业相关岗位社会实践活动收获不少，我认为这以下几点是在分子科学与工程专业相关岗位社会实践活动中不可缺少的。
第一、在分子科学与工程专业相关岗位社会实践活动要善于与别人沟通，我们在分子科学与工程专业相关岗位上都要与其他人合力完成任务，同事给你意见，特别是分子科学与工程专业资深前辈的意见，要认真听取，耐心、虚心的接受，这样会使我们分子科学与工程专业知识得到更好提升、事半功倍。
第二、在分子科学与工程专业相关岗位要有自信。没有分子科学与工程专业岗位工作经验没有关系，重要的是你要相信的你的分子科学与工程专业能力不比别人差，社会分子科学与工程专业工作经验也是积累出来的，如果没有一次，那又何来第二次，第三次呢？有自信心才能使我们分子科学与工程专业学生更要活力，更要精神。
第三、在分子科学与工程专业相关岗位工作中过程要不段丰富分子科学与工程专业知识，知识犹如我们人体内的血液，如果我们缺少了血液身体就会衰竭，作为分子科学与工程专业的大学生缺少了分子科学与工程专业知识，头脑就会枯竭。
以上就是我此次假期分子科学与工程专业相关岗位的社会实总
结，其中有许多见解还未成熟，特别是分子科学与工程专业知识有待进一步提高，还有许多偏激的观点，有什么不足之处，还请分子科学与工程专业老师批评指正。