如何构建一个大肠杆菌高效表达的分子克隆？

影响基因在大肠杆菌中表达的因素是多方面的，以下我就从载体选择、启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数、表达产物的稳定性、受体细胞代谢等方面说明构建大肠杆菌高效表达的方法。

一、表达载体

表达载体应具有以下条件：

1、能够独立复制。根据载体复制的特点，可分为严谨型和松弛型。严谨型载体伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主中拷贝数很少（1~3个）；松弛型的复制而不依赖于宿主染色体，在宿主细胞中的拷贝数可多达3000个。

2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。

3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。

4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。阻遏子的阻遏作用可由物理（如温度）、化学（如IPTG、IAA等）因素进行调节，这样可人为地选择启动子启动转录mRNA的时机。因外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖。而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。例如可使宿主细胞快速生长增殖到相当量，再通过瞬时消除阻遏，使所表达的蛋白质在短时间内大量积累，同时可减少表达产物的降解。

5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。同时强终止子所产生的mRNA较为稳定。诱导表达时，由于强终止子所致的高水平转录反过来会影响质粒DNA自身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象。因此在外源基因的下游安置强终止子可以克服由质粒转录引起的质粒不稳定。

6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。

二、启动子

启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。

1

启动子是在转录水平上影响基因表达。转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。也就是说启动子会有强弱之分。要获得高校表达必须选择强启动子。由于真核基因启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，因此必须将真核基因编码区连接在大肠杆菌RNA聚合酶能够识别的强启动子控制之下。通常用的强启动子有lac、trp、tac、bla、λPL等，将外源基因插入这类启动子的下游，可以增加基因的表达产量。但是如果启动子太强，RNA聚合酶有时超过了终止信号，引起过度转录和杂蛋白的生成，对宿主细胞的正常生长和基因工程产物的纯化不利，同时影响载体的稳定性。所以一般在多克隆位点的下游要插入一段rrnB核糖体RNA的转录终止子。

启动子具有可控性：

1、乳糖启动子Plac的可控性：

野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高。

野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP结合启动子控制区，进而促进Plac介导的转录。葡萄糖代谢使cAMP减少，也能阻遏Plac介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即Plac UV5。

2、色氨酸启动子Ptrp的可控性：

色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因的表达。

3、λ噬菌体启动子λPL的可控性：

噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的cI突变基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达。但在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达。

三、终止子

2

外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。

在原核生物中，转录终止有两种不同的机制。一种是依赖六聚体蛋白rho的rho依赖性转录终止，rho蛋白能使新生RNA转录本从模板解离。另一种是rho非依赖性转录终止，它特异性依赖于模板上编码的信号，即在新生RNA中形成发卡结构的一回文序列区，和位于该回文序列下游4-9bp处的dA、dT富含区。虽然转录终止子在表达质粒的构建过程中常被忽略，但有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件，因为它们具有极其重要的作用。贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵。这种效应可以通过在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，阻止转录贯穿别的启动子来避免。同样地，在启动目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将最大限度地减小背景转录。另有资料证明，由强启动子启动的转录会使转录通读到复制区，造成控制质粒拷贝数的ROP蛋白的过量表达，从而导致质粒的不稳定。另外，转录终止增强mRNA的稳定性，从而提高蛋白质的表达水平。如果来源于E.coli rrnB rRNA操纵子的两个转录终止子T1和T2串联，则效果更好。

四、核糖体结合位点

1、Shine-Dalgarno（SD）序列

一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低。

2、翻译起始密码子

已知序列的绝大部分（91%）E.coli基因的翻译起始区均含有起始密码子 3

AUG，GUG的利用率为8%，而UUG的利用率则为1%。大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。

3、SD与起始密码子间的距离及碱基组成

SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。

SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍。

4、此外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。

五、密码子

不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。

对E.coli中密码子的使用频率进行系统分析得到以下结论： （1）对于绝大多数的简并密码子中的一个或两个具有偏好； （2）某些密码子对所有不同的基因都是最常用的，无论蛋白质的含量多少，例如CCG是脯氨酸最常用的密码子；

（3）高度表达的基因比低表达的基因表现更大程度的密码子偏好； （4）同义密码子的使用频率与相应的tRNA含量有高度相关性。 这些结果暗示,富含E.coli不常用密码子的外源基因有可能在E.coli中得不到有效表达。通过用常用密码子替换稀有密码子或与“稀有”tRNA基因共表达可以提高外源基因在E.coli中的表达水平。即通过外源基因全合成或者同步表达相 4

关tRNA编码基因两种策略来实现高效表达。

外源基因全合成：按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法。

同步表达相关tRNA编码基因：对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用。

六、质粒的拷贝数

目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。

解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子在28℃时，每个细胞的质粒拷贝数为60，在42℃时，拷贝数迅速增至300 - 600，在此温度下，受体细胞染色体上的CI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活，因此，用一种手段同时控制质粒拷贝数和基因的表达。

七、表达产物的稳定性

真核基因在原核细胞中表达时，可以产生融合型和非融合型表达蛋白，非融合蛋白指的是不与细菌的任何蛋白质和多肽融合在一起的表达蛋白，这类蛋白质具有近似于原核蛋白质的结构，生物学功能也更接近生物体内天然蛋白质的性 5

质。但当融合蛋白表达时，细胞内降解该蛋白质的蛋白酶由于应急反应，其产量也会大量增加，所以即使原始表达量很高，也会被产生的蛋白酶所降解，而实际产量仍然很低。

可以采取一些方法来提高表达产物在细菌体内的稳定性。如将外源基因构建在融合蛋白表达载体中，产生融合蛋白。融合蛋白与天然真核蛋白相比，在细菌体内比较稳定，不易被细菌蛋白酶所降解。还可以利用大肠杆菌的信号肽或外源基因中自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，避免外源基因被酶降解。也可以采用定点突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，来增加蛋白质的稳定性。此外，选用大肠杆菌蛋白酶缺陷型作为宿主菌，有可能减弱表达产物的降解。

八、受体细胞的代谢

细胞的代谢负荷影响产物的表达效率。大量的外源基因表达产物可能打破宿主细胞的正常生长代谢平衡，如大量氨基酸被用于合成与细胞生长无关的蛋白质，就会影响细胞的代谢过程。有的表达产物对细胞有害，其大量积累可能导致细胞生长缓慢甚至死亡。所以合理调节这种消长关系，才能使宿主细胞的代谢负荷不至过重，又能高效表达外源产物。

减轻宿主细胞代谢负荷的措施是将宿主细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，首先使宿主细胞的生长量达到饱和，在这一阶段中或采用一定的方法抑制重组质粒的复制或不诱导基因产物的合成，以减少宿主细胞的代谢负荷；在

第二阶段再诱导细胞重组质粒的复制或诱导基因产物表达。

6

第二篇：化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

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!!!

三角酵母!氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达"

罗晖童忆舟李强于慧敏沈忠耀"

（清华大学化工系

北京2）$$$0!

摘

要：从三角酵母中提取总H反转录后进行J氨基酸氧化酶（>，.I，?H扩增得到>11I9:,’IE:DK7:D6A->IIK）

基因，经测序可知，与文献中三角酵母的>IIK基因序列的同源性在FFL以上。将>IIK基因用!"#"和$%&M"双酶切后，与相同酶切的大肠杆菌表达载体N转化大肠杆菌/，并筛选得到重组质粒N8/1#06连接，KJ12$5O8/1转化P（>）感受态细胞，得到重组大肠杆菌P（>）／氨基酸>IIK，8/1>IIK。对重组大肠杆菌中的>Q#28"Q#28"1N

氧化酶进行了诱导表达，考察了诱导温度、菌浓度、诱导剂R在J/S用量以及溶氧等因素对酶活的影响。结果表明，菌浓度（’、／／。研究进一步显示，用廉价无毒的#0T、(%2U$RJ/S浓度299’(Q时，>IIK酶活最高达#"U"V9Q$$）乳糖可以替代R当乳糖浓度为#／，／。经过补料分批培养和乳糖诱J/S进行诱导，99’(Q>IIK酶活可达##U3V9Q导，／。>IIK酶活可以达到234V9Q关键词：氨基酸氧化酶，三角酵母，大肠杆菌，乳糖>1中图分类号：W30%

文献标识码：I

文章编号：（）$$$21%#$F#$$!$"1$""%1$!

氨基头孢烷酸（3，311I9:,’E-C6(’A’X6,:E6E:DNN

是生产半合成头孢菌素的重要中间体，一般31I?I）

由头孢菌素?（?）经化学法或酶-C6(’A’X:,?，?J?NN

［，］2#法脱去其侧链得到。目前，人们研究较多的是两

待于进一步提高。本文以三角酵母为出发菌株，对>IIK进行了分子克隆并在重组大肠杆菌中进行了

表达条件的优化。

头孢菌素?在>氨基酸步酶法制备31I?I。首先，1氧化酶（>，的作用下，1I9:,’IE:DK7:D6A->IIK）

，这个中间体产生一个具酮基的中间体和一个MK##不稳定，很容易被同时产生的M化学氧化脱羧，K##氨基头孢烷酸（S转变成戊二酰基131(+@6X(131Y，，然后在S69:,’E-C6(’A’X6,:EIE:DSQ131I?I）Q1NN

生成331I?I酰化酶的作用下脱去侧链，1I?I。氨基酸氧化酶是一种典型的黄素蛋白，广泛>1

存在于动物内脏及微生物中。>IIK的底物专一性较低，可以作用于几乎所有的>氨基酸，也可以作1用于各种具有>氨基的化合物（如头孢菌素?）。通1常认为>并且非IIK是由几个亚基构成的多聚体，

［］共价结合了一个辅酶———5I>"。>IIK的主要来［，］"!、猪肾源有：三角酵母（)*+#-#/+/0%*+%1+2+/）,.［］4（3#*"+-45+6-49/%*+9&7）、腐皮镰孢霉（8

［］［］%3）、红酵母（:、尖镰孢/#2%-+;#6#<#*92%,*%"+2+/）

［］［］0F（8和曲霉（>9/%*+9&#=/#*9&）/4*+229/）7..,

#材料和方法

#$#质粒和菌株

（Z）购自.大肠杆菌8/1#06’[6-,公司；NB

（>、PQ#28"）/KJ12$5O分别购自JX’9-6公司和B三角酵母（)为R,[:@X’-,公司；*+-##/+/0%*+%1+2+/）B,.本实验室保藏。

#$%工具酶和试剂

各种试剂盒购自J工具酶购自X’9-6公司，B微生物培养用=、/6\6H6公司，-6A@-7@X6E@J-@’,-N为K其他化学试剂均为国产或进口]KR>公司产品，分析纯。

#$&’()引物

根据三角酵母>氨基酸氧化酶E1>.I核酸序列，设计了引物，上游引物序列为4O1

，下游引物序?I//IIII/?S//S1"O（北列为4O1?/IIISS///SSI?S1"O京赛百盛基因技术有限公司合成），分别引入了!"#"和$%&M"酶切位点。

#$*总)+,的提取

三角酵母用=，取#J>培养基培养约#$C9Q菌液，离心收集菌体，用;&/’@6(H.I提取试剂盒

等，其中三角酵母的>IIK在31I?I工业上应用最广。由于野生菌株的培养条件较高，表达的>IIK水平也较低，人们通常将野生株的>IIK基因在重组大肠杆菌或酵母菌中进行表达，但表达水平仍有

"通讯作者。

：；：；：/-(0%12$1%#30442!5670%12$1%#33$"$!8196:(;<=1>?8!96:()@A:,C+6)-D+)E,B

作者简介：罗晖（，男，江西人，在读博士生，研究方向为分子生物学。8：2F34G）196:((+’C+:FF!96:(A)@A:,C+6)-D+)E,B收稿日期：，修回日期：#$$"1$01#F#$$"12#12F

氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

（!，从三角酵母中提取总("#$%’公司）)*。&!"#反转录，置于冰上，+,的总()*于-./温育0.$12!

／／加入终浓度为0..$#4,的随机引物、56.$#4,3!反应总体积为57)8!9及0:反转录缓冲液，.,，!

。+5/保温+6$12!"$目的基因的扩增

在6.,反应体系中进行;**<基因的!=(扩!增，加入6加入5,反转录产物作为模板，>6?的!发酵罐中（装液量为5，进行补料分批培养，通气,）量约为5／，溶氧控制在0发酵#+,$12.P#5.P，温度B用+／。培养BE->.-/，$#4,)’<E调节3I后，流加葡萄糖，流加速度为0／，流加B。菌6$,II体生长到对数中期时，降温至5并加入5／A/，$$#4,的乳糖进行诱导。

,结果和讨论

,"!三角酵母’(()基因的克隆

"

#;)*聚合酶，加入终浓度为6.3$#4／,的引物，..!

$#4／,7)8!9，0:!=(缓冲液，!=(条件为：+/6$12；@+/0$12，6A/0>6$12，-5/5>6$12

，共B.个循环；-5/0.$12。"%目的基因的克隆

将!=(扩增的;**<基因片段和3C8D5A’质粒分别用$%&"和’()E"进行酶切，用8+;)*连接酶连接目的基因和载体片段，连接产物转化大肠杆菌8<!D0.FG，挑取菌落进行!=(筛选，得到重组3C8D;**<质粒，转化H,50（;CB）感受态细胞，得到重组大肠杆菌H,50（;CB）／3C8D;**<。"&’(()的诱导表达

重组大肠杆菌H,50（;CB）／3C8D;**<于B-/过夜培养，转接适量菌液至,H培养基（含卡那霉素浓度6.!

&／$,），B-/培养5I后，加入一定浓度的!8K或乳糖进行诱导，不同温度下继续培育约5.#5+I，收集菌体，测定酶活或进行L;LD!*KC分析。

"*’(()酶活的测定

取0$,菌液，离心收集菌体，用0$,.>0$#4／,磷酸盐缓冲液（3EA>.）将菌体重悬，加入.>0$,..$$#4／,丙氨酸溶液和.>0$,牛肝过氧化氢酶+..?），B-/反应06$12后加入.>+A$,5$&／$,对二硝基苯肼溶液（用5$#4／,E=4溶液配制）终止反应，放置0.$12，然后加入0>-$,B$#4／,)’<E溶液显色，于66.2$处测定吸光度。;**<酶活力单位定义为每分钟氧化脱氨生成0!$#4酮酸所需的酶量。

"!+补料分批培养

种子培养基：每升含酵母粉6&，蛋白胨0.&，氯化钠0.&，3E值->.。发酵培养基：每升含葡萄糖&，蛋白胨0.&，酵母粉6&，)’5E!<+?05E5

<M&，NE5!<+0>6&，=’=45.>.5&，O&L<+?-E5

<.>6&，卡那霉素6.$&，3E值->.。接种前加入=’=45、O&D<+、

卡那霉素和葡萄糖。补料用葡萄糖浓度为..&

／,。上罐培养时，将种子以6P的接种量接种于6,

从三角酵母中提取得到总()*，经过反转录和!=(扩增后，扩增产物用.>-P琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，扩增得到一条特异性很好的;)*条带，其分子大小与;**<基因推测值（0.-0Q3）相符，表明;**<基因的克隆成功。

,",’(()基因’-(测序和重组质粒的构建

将扩增得到的;**<基因用$%&"和’()E"双酶切，切胶回收对应的;)*条带，与用相同酶切处理的质粒3C8D5A’连接，连接产物转化大肠杆菌8<!D0.FG，挑取菌落进行!=(筛选，得到重组3C8D

;**<质粒。经;)*测序验证，所得的质粒为;**<重组质粒，且基因序列正确，与文献［+

］报道的三角酵母;**<基因相比，基因的同源性在@@P以上。

将重组质粒转化宿主H,50（;CB），得到重组大肠杆菌H,50（;CB）／3C8D;**<。在5A/下将重组大肠杆菌用.>6$$#4／,的J!8K诱导，诱导前后的菌体用L;LD!*KC检测（图0），可以看到：在B@R;的位置上有一明显的诱导蛋白条带，其大小与;**<的分子量相符，说明;**<在大肠杆菌中能够顺利表达。

图!

!5@!!J!0（!6LB

卷

出），即重组菌表达出了有活性的!氨基酸氧化酶。"而出发菌株三角酵母野生株的!几##$活性很低，乎不能催化%由此证明了三角&%生成’(")"#%#，酵母!##$基因的重组大肠杆菌构建成功。!"#重组大肠杆菌的诱导表达

实验表明，在不同的!"#"$最佳诱导菌龄的确定：生长时期进行重组菌的诱导，得到的酶活和比活有很大的不同。对于本菌株，加入诱导剂*+,下，在0／菌体浓度!"5+-&.’浓度为/012234(时，///

由于乳糖不仅可作为诱导剂，同时还能被菌体代谢利用，因此涉及到乳糖转运以及菌体生理代谢等方

［］66面的一系列复杂变化，使乳糖的诱导规律比较复

杂。

在!!"#"&溶氧对!##$酶活的影响：##$诱导

过程中，通过对溶氧的控制有时能够得到较高酶活。对相同培养状态的菌液分别在不同溶氧情况（下进行-*//2(和1/2(的摇瓶）&.’诱导表达，结果发现：尽管二者总酶活相当，但低溶氧（1/2(摇!60/左右（属于对数生长中期）加入诱导剂效果比较好。由于!##$会影响到菌体细胞壁的合成，即对菌体的生长有毒性，如果过早加入-&.’，诱导产生的!##$会抑制菌体的生长，从而影响酶活和比活的提高。

如果在酶催化反应体系中加入6"234／(的辅酶#!，!##$的酶活将有所提高，

提高幅度甚至可达/8左右。这说明在!##$的表达过程中，!##$和7#!的生成量并非十分匹配，由于菌体合成的#!量不够，因此影响了部分!##$的活性。

"#"!诱导剂-&.’浓度对酶活的影响：诱导剂&.’有一定毒性，

对菌体生长不利，对外源蛋白表达的影响也很大。在*+,下，当菌体浓度!"5//约为6时，用不同浓度的-&.’对重组菌进行诱导，然后分别检测!##$活性。诱导剂-&.’浓度为

2234／(时酶活达到最高值，此后随着-&.’用量的增大，菌体的酶活反而有所下降。在/0/12234／(的-&.’浓度下，!##$酶活也能达到一个较高水平。

"#"#诱导温度对!##$酶活表达的影响：

在高温下诱导表达重组大肠杆菌的外源蛋白时，很容易生成没有活性的包涵体。当9(*6（!:;）／<:."!##$

菌体浓度!"5//为6时，加入诱导剂-&.’浓度为012234／(，然后分别在*1,、*+,、;/,、;=,下进行诱导，菌体的!##$活性检测结果显示：在*+,下诱导可以得到相对较高的酶活，温度过高或过低对!##$的表达都不利。

"#"%乳糖诱导的初步研究：由于-&.’价格昂贵且有毒，而乳糖作为一种廉价无毒的诱导剂，引起了人们的关注。本文对乳糖替代-&.’作为诱导剂进行了初步研究。*+,下，分别用/01、6、601、*、;、1、/、61、*/2234／(浓度的乳糖进行诱导，结果表明：在乳糖浓度为*2234／(时即能起到很好的诱导效果，酶活达到**0)>／2(，相当于-&.’诱导时的

)8左右（-&.’诱导时，!##$酶活最高可达;0;>／2(）。乳糖诱导!##$的规律与-&.’类似。

瓶）情况下诱导的比酶活更高。这可能是因为!##$的辅因子7#!的氧化受氧浓度的影响所致。

表$溶氧状态对’(()表达的影响

.@A4B6-CD4EBCFB3DGHII34JBG3KLM

BC（!N$N）3C!##$@FOHJHOL!##$@FOHJHO／（L%

B44GBCIHOLPBFHDHF@FOHJ>／2(）!"5//／［<HO>／（L!"5//?2

(）］QHM

R!N$NF3CGHOH3C*60+10);0+*(3S!N$NF3CGHOH3C

*/0?

;0+

101/

!"%补料分批培养表达’(()

对于大肠杆菌的高密度培养，(9培养基不足以提供足够碳源，需采用补加碳源的方法来提高菌体密度和酶活。经过补料分批培养及乳糖诱导，发酵液的菌浓度!"5//可以达到*)，!##$酶活最高达到6)1>／2(，而文献报道的三角酵母!##$的重

组菌的最高表达值为*;>／2(［6*］

，因此本研究中!##$酶活的表达已能满足工业应用的需求。在补

料分批培养过程中，!##$比活也比摇瓶中的高，达到501>／（!"5//

?2(）。但是仍存在菌体合成辅酶7#!量不足的问题，如果菌液中适当添加7#!，!##$酶活甚至能达到*/+>／2(

（图*）。图!

7+7!-6!/!6?*

2期

罗

晖等：三角酵母&氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达+

22O

!结论

从三角酵母中提取总!反转录后进行$"#，%!扩增，得到&并将其克隆到大肠杆菌表达##’基因，载体(，经筛选得到重组菌/（&／)*+,-.0,1)2）

结果表明，)*+&##’。对重组菌进行了诱导表达，(

诱导温度、诱导初始菌浓!、诱导剂5"3$*6用量44等对酶活的表达均有较大的影响。用乳糖替代5$*6作为诱导剂也有较高的&##’表达水平。通

过补料分批培养，可以使菌浓和酶活都达到一个很高的水平。

参

考

文

献

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