蒽酮比色法
蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应,反应后溶液呈蓝绿色,在620nm处有最大吸收。本法多用于测定糖原的含量,也可用于测定葡萄糖的含量。 蒽酮比色法测糖试验 蒽酮比色法测定多糖含量
1、蒽酮比色法测糖试验
一 实验目的 掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法
二 实验原理 蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反应,反应后溶液呈蓝绿色,在620nm处有最大吸收。
三 实验器材及试剂
马铃薯干粉
可调试移液器或移液管
可见分光光度计(723型)
电子分析天平
水浴锅
电炉子
蒽酮试剂:取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中,以80%H2SO4定容到1000ml,当日配制使用。
标准葡萄糖溶液(0.1mg/ml):100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中,定容到1000ml备用。
四、操作
1.制作标准曲线
取7支干燥洁净的试管,按表1顺序加入试剂,进行测定。
以吸光度值为纵坐标,各标准溶液浓度(mg/ml )为横坐标作图得标准曲线。
表1 蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作
沸水浴中准确煮沸10min,取出用流水冷却,室温放10min,于620nm处比色
葡萄糖浓度(mg/ml)
2.样品含量的测定
样品液的制作:
精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min(不时摇动)—→取出,
3000rpm离心10min(或过滤)—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形瓶中—→再从中取出1ml,再定容到10ml的容量瓶中
样品液的测定:
(1)取4支试管,按照表2加样(加蒽酮时需要冰水浴5min冷却) 表2 蒽酮比色法定糖——样品的测定
(2)加样冷却完成后置沸水中煮沸10min,取出流水冷却放置10min,620nm处比色测量各管OD值。
(3)以1号试管作为调零管,2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线
上查出样品液相应的含糖量。
3.结果计算:
C×V
w = ————×100%
m,
式中w:糖的质量分数(%)
C:从标准曲线中查出的糖质量分数(mg/ml)
V:样品稀释后的体积(ml)
m:样品的质量(ml)
2、蒽酮比色法测定多糖含量
一 试验原理
植物在个体发育的各个时期,代谢活动也发生相应的变化,碳水化合物的代谢也不例外,其含量也随之发生变化。了解可溶性糖含量的变化,在生理上和实践上都有重要的意义。这里介绍的是蒽酮比色法,糖在硫酸的作用下生成糖醛,糖醛再与蒽酮作用,形成一种绿色的络合物,颜色的深浅与糖含量有关。方法简便,但没有志一性,对于绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮反应,产生颜色。
二 仪器药品
721型分光光度计 分析天平
研钵 恒温水浴锅
烧杯 容量瓶
三角烧瓶 大试管
移液管 漏斗
乙醚 草酸钠
饱和醋酸铅
葡萄糖标准溶液:称取已在80℃烘箱中烘至恒重的葡萄糖100mg,配制成500ml溶液,即得每ml含糖为200μg的标准溶液。
蒽酮试剂:称取1g经过纯化的蒽酮,溶解于1000ml稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml浓硫酸(比重1.84)稀释成1000ml而成。
三 操作步骤
1.可溶性糖的提取
称取重约5g的新鲜植物叶子,于研钵中乙醚少许,仔细研磨成均匀的浆状物,倒入烧杯中,用70℃热水洗涤研钵,洗液并入烧杯中,再加蒸镏水30─40ml。将烧杯放在水浴锅中加热,保持温度70─80℃约半小时,冷却后1滴1滴地加入饱和中性醋酸铅,以除去蛋白质,直至加入醋酸铅时不再形成白色沉淀为止。然后将此混合物连同残渣一并洗入100ml容量瓶中,加水至刻度,充分振荡。以干燥漏斗将滤液过滤于一干燥的三角烧瓶中,瓶中事先放有少量(约0.2─0.4g)草酸钠粉末,以除去滤液中过量的醋酸铅,使生成草酸铅沉淀,再行过滤,所得的透明滤液即为可溶性糖提取液。
2.显色及比色
吸取上述糖提取液1ml,放入一干洁的试管中,加蒽酮试剂5ml混合之,于沸水浴中煮沸10分钟,取出冷却,然后于分光光度计上进行测定,波长为625nm,测得吸光度。从标准曲线上查得滤液中的糖含量(或经直线回归公式计算),然后再行计算样品中含糖百分数。
3.绘制标准曲线
取标准葡萄糖溶液将其释成一系列不同浓度的溶液,浓度分别为每ml含糖0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg。按上述方法分别测得其吸光度,然后绘制A026-糖浓度曲线,或进行直线回归求得直线方程。
4.计算样品中含糖百分数(% )
设V为植物样品稀释后的体积(ml)
C为提取液的含糖量(μg/ml)
W为植物组织鲜重(g)
则得计算式如下: %=C×V/(W×1000000)×100%
[a]多糖含有几百个或更多残基,但只有一个还原基团,因此它的还原能力极弱,对于他们的测定,应先将它们用酸水解成单糖组分。
蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法,糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物,该衍生物与蒽酮发生反应,反应后溶液呈蓝绿色,于620nm处有最大吸收。因此可用此方法测定多糖含量。
[b]试剂
2g/L蒽酮试剂:溶解2g蒽酮于1L浓硫酸(98%的浓硫酸)中,当日配制使用。
0.01g/L葡萄糖溶液(可加几滴甲苯作防腐剂)
0.1g/L糖元溶液
[c]实验器材
试管及试管架 吸量管(1ml,5ml) 恒温水浴箱(100℃) 制冰机 紫外分光光度计 滴管 白瓷板
四 制作标准曲线
准确称取0.1g葡萄糖(分析纯),溶解并用蒸馏水定容至100ml后,分别取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分别加入到50的容量瓶中,并用蒸馏水定容到50ml,配成浓度分别为20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml于试管中,再加入3ml的蒽酮试剂,迅速浸入冰水中冷却,待几支试管均匀加完后,一起浸入100℃恒温水浴箱中,为防止水分蒸发,应在试管口上加盖一个玻璃球或者加一个塞子,自温度重新升至100℃起计时,准确保温10min后取出,用流动水冷却,然后,于室温中平衡片刻(约10min左右),在分光光度计上,波长620nm处,用0.5cm厚度的比色杯,以空白管做对照空白(此处的空白是指不加葡萄糖的蒽酮试剂,其他反应条件都一致),进行比色。
既得标准曲线。
如下表格
[d]样品测定
如上述条件一致,但要记得用除去蛋白质的样品溶液进行测定,否则会影响测定结果。
样品含糖量计算:
C×V2×D
样品含糖量(%)=----------------------×100%
W×V1×10
其中C----在标准曲线上查出的糖含量(ug),
V2---提取液总体积(ml)
V1---测定时取用体积(ml)
D-----稀释倍数
W-----样品重量(g)
10-----样品重量单位g换算成ug的倍数
注意事项:
1.一定要注意温度要控制在100℃
2.从100℃开始准确计时10min,然后迅速冷却,于室温中平衡10min.
3.蒽酮要注意避光保存。配置好的蒽酮试剂也应注意避光,当天配制好的当天使用。
4.试管要保证干燥清洁,无残留水滴。
第二篇:蒽酮比色法测总糖
蒽酮比色法测总糖:
实验步骤:
1、可溶性糖的提取:准确称取烟叶样品0.100克,置于离心管中,加入8毫升80%乙醇,于80℃水浴浸提30分钟,冷却后于4000转离心5分钟,收集上清液,残渣再加入8毫升80%乙醇,再次浸提,重复两次,将三次提取的上清液合并于100毫升容量瓶中并定容至100毫升。
2、总糖的测定:取提取液1毫升(或0.5毫升,视情况而定)于试管中(空白中用1毫升蒸馏水代替),加入蒽酮试剂5毫升,摇匀,于
,冷却后在620nm波长处比色 。
蒽酮试剂:1克蒽酮溶于72%的H2SO41000ml(98%的H2SO4+240的蒸馏水),棕色瓶冰箱保存2~3周。
3、标准曲线的绘制:取干洁试管6支,依次加入葡萄糖标准液(100μg/ml)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml和蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml,再分别加入蒽酮试剂5毫升,于沸水浴中加热10分钟,冷却后在620nm波长处比色,记录OD值,绘出标准曲线。
4、计算:C=AN/W
C—样品总糖含量(μg/g)
W—样品重量(g)
A—标准曲线查得的糖量(μg)
N—样品提取液占样品反应液的倍数