液质联用技术在药物分析中的应用

一、       实验目的

1、了解液质联用的原理及作用；

2、了解该液质联用仪器适用的样品种类及注意事项；

二、       实验原理

液质联用（HPLC-MS）又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。

电喷雾四级杆飞行时间质谱（ESI-Q-TOF-MS）：质谱分析是一种测量离子荷质比的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定去质量。电喷雾电离（ESI）是质谱方法中的一种“软电离”方式，它的原理是：在强电场的作用，引发正、负离子的分离，从而生成带高电荷的液滴。在加热气体（干燥气体）的作用下，液滴中溶剂被汽化，随着液滴体积逐渐缩小，液滴的电荷密度超过表面张力极限时，引起液滴自发的分裂，即“库仑爆炸”。分裂的带电液滴随着溶剂的进一步变小，最终导致离子从带电液滴中蒸发出来，产生单电荷或多电荷离子，进入质谱仪。由于ESI的电离方式可以产生多电荷离子，大大拓宽了测定物质的分子量的范围。四级杆（Quadrupole）主要起选择离子的作用，其后的碰撞池可以将通过四级杆选择的母离子碎裂成子离子，从而获得更多的结构信息。气相离子能够被适当的电场或磁场在空间或时间上按照荷质比的大小进行分离有赖于质量分析器。与其他质量分析器相比，飞行时间质量分析器（TOF）具有结构简单、灵敏度高和质量范围宽等优点（因为大分子离子的速度慢，更易于测量），分辨率也可达到万分之一。

三、       实验仪器

Aglient 6510 Quadrupole Time-of-Flight LC/MS

四、       数据记录及结果处理

样品的LC-MS图如下图1所示，结合表1前可知，该物质为软骨藻酸。

表1  LC-MS数据

图1 LC-MS图

第二篇：液质联用知识

如何利用LC-MS/MS，更快更好的建立生物样品分析方法?

前言： 以前曾在实验室的seminar上，做过一次关于如何建立生物样品分析方法的工作报告。时隔两年，恰逢仪器信息网举办第一届网络原创作品大奖赛，在这里将这几年来对于生物样品分析的一点点感受总结一下，与大家交流、分享。

首先明确一下文中提到的“生物基质”，主要指的是血浆、血清、唾液、尿液或者器官组织等。药物透过机体的各种生理屏障，进入到这些基质中，就是我们所说的“生物样品” (Biosample)。生物样品中的药物浓度极低，我们如何利用灵敏度高的仪器如LC-MS/MS，更好的建立测定生物样品中药物浓度的分析方法呢？下面我主要从以下四个方面进行阐述：


一、色谱-质谱条件的确立
1、质谱条件的确立
当使用液质联用仪对某一个化合物进行定量分析时，我们就需要建立一个质谱分析方法。虽然仪器的型号不尽相同，但原理却是一致的，基本原理如图所示。我们在确定方法时，主要考虑以下几个因素：
（1）化合物的性质：包括化合物的结构、化合物的极性及化合物的pKa值。首先了解化合物的结构，我们可以大概的推断其碎片离子的断裂方式，选择较为稳定的碎片离子作为定量反应的子离子，也可以根据经验判断选用哪种source更为合适；根据化合物的极性大小，我们可以选择一种或几种恰当的溶剂作为溶媒，既能保证完全将样品溶解，又能提高化合物的质谱响应；而清楚化合物的pKa值，有助于我们选择流动相的添加剂及其pH值，从而提高质谱响应。
（2）流动相添加剂的选择：在液相-紫外检测中，我们使用的添加剂的种类繁多，可以是挥发性的酸或者碱（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不易挥发的缓冲盐（如磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸缓冲盐）。但是在液质分析中，基于质谱检测的原理，我们只能使用可挥发的酸碱或缓冲盐，那么种类就会受到极大的限制。在日常分析中使用到的添加剂主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐，见图一。三乙胺在紫外检测中，常作为扫尾剂，但是在液质检测中是绝对禁止的。因为三乙胺进入质谱后不易清除，残留及其严重，能够抑制离子的响应。一旦三乙胺用量增加，时间延长，那么慢慢地质谱就不能灵敏的检测化合物了，所以这点大家要注意，尤其对于液质的初期使用者。
图一



3）质谱离子源的选择：质谱出现早期，主要有电子轰击源（EI）、化学电离源（CI）、电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI）。但随着科学技术的进步，源的发展也是日新月异。目前，用于定量的离子源主要是电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源(APCI)，他们的使用范围如图二所示。

图二

ESI源是液相离子化，主要用于分析极性比较大的化合物及大分子化合物；而APCI源是气相离子化，主要用于分析极性较小的小分子化合物。
在掌握以上基本信息后，根据各个型号仪器的标准操作规程（SOP）进行操作，对各个参数进行优化，从而确定质谱分析方法。
2、色谱条件的建立
在液相色谱紫外检测中，要求化合物之间的分离必须达到完全分离，即R》1.5，如果进行定量，那R最好≧2.0，这就给分析工作者提出了很高的要求——准确的配制流动相，精确的调好流动相的pH及添加剂的浓度。但在液质分析中，我们经常使用多反应监测（MRM/SRM）对化合物进行定量，由于MRM要求选择两次离子，因此它具有很高的专属性，基于这点我们对多个化合物同时进行检测时，不需要彼此间达到完全分离就可以对他们进行定量分析。但这里需要强调的一点是，由于生物样品中含有大量的基质，这些基质的存在会严重的干扰和影响化合物的测定，因而我们需要利用色谱将化合物与基质分开，从而降低基质效应的影响，即降低离子抑制。
二、内标的选择

检测时使用内标物的目的是消除操作误差，因此我们在进行生物样品分析时必须选择一个合适的化合物作为内标物。LC/MS/MS法的高专属性使其对内标物与待测物的色谱分离要求不高，但要求内标物色谱行为及提取回收率，尤其是质谱信号响应与待测物的接近；要求在测定过程中内标物受系统误差及碰撞压力变化的影响与待测物一致。所以理想的内标物应为待测组分的同位素标记物，但由于同位素标记物价格非常昂贵且不易获得，我们尝试选用结构相似的化合物（或者同系物）作为内标物。

三、样品预处理方法的选择

根据前人的经验，我们在生物样品预处理中，经常使用到的方法主要有以下三种——沉淀蛋白法（PPT）、液液提取法（LLE）和固相萃取法（SPE），而这三种方法的选择，主要取决于化合物的特性。
分析极性比较大的化合物，优先考虑使用沉淀蛋白法，这种方法操作简单，省时省力；缺点是生物基质中内源性物质去除的不彻底，基质效应较大，使得方法灵敏度不高。
分析极性较小的化合物，我们可以选择液液萃取法，这种方法根据相似相溶的原则进行分离提取，优点在于处理完的样品较干净，内源性物质去除彻底；缺点在于消耗有机试剂的量很大，对操作人员、环境的污染也大。
固相萃取法，在国外使用尤为广泛。它采用固相萃取小柱作（见图三）为分离媒介，小柱中添加了不同填料的固定相，如以键合硅胶为基质的如C18、NH2、COOH、PSA、SAX等，是硅胶的表面活性大为降低，最大程度的降低了极性化合物的不可吸附和拖尾，使样品回收率和重现性得到保障；以高分子聚合物为基质的如PEP、HXN、PAX、PCX等，具有高纯度、高比表面的特点；以吸附型填料为固定相的如硅酸镁、氧化铝等，主要通过表面的极性吸附达到分离的目的。因此，固相萃取法适用于各种极性的化合物，样品处理过程中使用的设备（见图四）简单，柱子活化便捷，基质效应低；缺点是价格昂贵，不太适合我国目前的国情。近年来又出现了96孔板的固相萃取小柱，可以批量处理样品，耗材少，耗时短，大大提高了工作效率。
图三-1