生命学院09级分子生物学实验报告
目录：
实验一 质粒 DNA 的小量制备（P2-P4）
实验二 DNA 的含量、纯度与分子量的电泳法测定（P4-P7）
实验三 感受态细胞的制备及转化（P7-P9）
实验一 质粒DNA的小量制备
一、实验目的
1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。
2．了解制备原理及各种试剂的作用。
3. 制取质粒以备大肠杆菌的培养和电泳。
二、实验材料及试剂
材料：大肠杆菌E.coli，含pBR322质粒。
试剂：
1. LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，用NaOH调pH至7.3左右。如固体培养基则添加15g/L琼脂。
2. 溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T缓冲液）：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。灭菌后存放。
3. 溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)）：预先配制1％SDS母液，临用前一天晚上加入0.2mol/LNaOH，4℃保存。
4. 溶液Ⅲ（pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏水28.5mL。
5. 酚/氯仿液(V/v＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为24:1，然后等量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6)，4℃保存。
6. 无水乙醇
7. 70％乙醇
8. pH8.0 TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20μg/mL。
仪器：
恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL～lmL)、吸头。
三、实验步骤
从菌落中快速提取制备质粒DNA
1．取1.5mL(750uL取两次)菌液置于1.5mL Ep管中，7500rpm离心1min。
2．弃上清，重复步骤1，弃上清，加入150μL GET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀。
3．加入300μL新配制的0.2mol/L NaOH(内含1％SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）2～3次，使之混匀。
4．加入225μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀。
5． 10000rpm离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mL Ep中，如上清液浑浊则需重新离心一次。
6．于上清液中加等体积氯仿，振荡混匀， 10000rpm离心2min，小心吸取上清液，转移至另一1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。
7．向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置３min。用离心机于10000rpm离心5min。小心吸去上清液。
8．用0.5mL 70％乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm离心3min，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上)，备用。
9．用25uL含无DNA酶的胰RNase(20 ug／mL)的TE重新溶解DNA，置于4℃保存，供下午电泳使用。贮存于-20℃备用，可长期保存。
三、实验结果记录与实验分析
在此实验操作中，在进行步骤5时，吸取上清液时亦吸进少量固体，可能使得所制DNA不纯。
四、思考题
1．裂解细菌时需注意的事项有哪些？
答：操作中应注意不可震荡，以免细菌DNA断裂混进质粒中，导致提取质粒DNA不纯。
2．质粒的基本性质有哪些？
答：质粒的性质：原指一切独立于染色体外的遗传因子，但目前一般指微生物细胞中的染色体外 遗传因子。它们是能自主复制的共价、闭合、环状的 DNA 分子，整个质粒通常编码若干个基因。由于 质粒的存在往往可以使宿主细胞具有某些性状，而质粒的丢失并不影响宿主在正常条件下的生存。由质 粒授予宿主的表型有抗生素耐药性的、产抗生素的、降解芳香族化合物的、产溶血素的、糖发酵的、对 重金属耐受性的、产杆菌素的、植物肿瘤诱发的和产硫化氢的。根据质粒的复制类型分为松弛型复制(胞 内维持高拷贝数， 从几个到几十个)和严聚紧型复制(胞内仅 1～3 个拷贝)。 一部分质粒可通过细菌细胞的 接触而转移，使一些对药物敏感的细胞获得对某些药物、金属离子的耐受性或使受体细胞获得另一些特 性。在基因重组技术中，有些质粒可用作基因载体。现在应用的载体基本上是在质粒的基础上改造而成的。
3．碱裂解法提取质粒DNA中各溶液的作用是什么？
答：各溶液的作用如下： 溶液Ⅰ 葡萄糖增稠， 使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部； EDTA 抑制 DNase 的活性。 这一步溶液中还可以加入 RNase，不受 EDTA 影响，并且可以在后续步骤中被除去 溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS 溶液Ⅲ 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸 破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。 这一步的 K 置换了 SDS（十二烷基磺酸钠）中的 Na，得到 PDS （十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS 易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换 所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组 DNA 也被 PDS 共沉淀
4．抽提质粒DNA的方法包括哪几个步骤？
答：DNA 提取分为三个基本步骤： 1、 破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。 2、醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与 DNA 结合的组蛋白。 3、 将 DNA 在冷乙醇或异丙醇中沉淀， 因为 DNA 在醇中不可溶而黏在一起， 这一步也能除掉盐分。
5．如何提高质粒DNA的产量？
答：提取方法都是大同小异的，只要操作上注意量都不会差别很大。所以主要还是看菌液的状态。 如果想抽多一些，就摇多些菌液，一般如果是大质粒，用 5ml 以上菌液摇，多次离心用一管收集，相５ 应增加溶液一二三的量即可。 另外，一般认为，一般摇 16 个小时菌的生长状态比较好。
6．为什么质粒DNA不能反复在4℃、-20℃、室温中放置？为达到这一目的，需要注意些什么？
答：将质粒 DNA 反复在 4℃、-20℃、室温中放置会导致环状的 DNA 的断裂成线性的分子，不能 得到环状的 DNA 分子。 所以为了避免这一问题对于提取的 DNA 因根据使用其的时间不同而作区别地处 理：对于近段时间就要用的质粒 DNA 应置于 4℃冰箱中放置；而对于长时间不用的质粒 DNA，则应保 存在-20℃的冰箱中，因为在相对低的温度下质粒可以保存较长的时间。
实验二 DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定
一、实验目的
1．从以上实验中提取到的质粒DNA，为了能作下一步的酶切，连接及转化实验，必须测定DNA的纯度、含量以及分子量大小。
2．本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，学习检测DNA、含量与相对分子质量大小。
二、实验材料和试剂
材料：自制的质粒DNA、λDNA/ Hind Ⅲ、。
试剂：
1．标准DNAmarker(λDNA/ Hind Ⅲ)
2．限制性内切酶EcoRⅠ或HindⅢ和10X缓冲液
3．酶反应中止液：0.2 5％溴酚蓝(含40％蔗糖)，已配好。
4．溴化乙锭染液（EB）：使用前稀释1000倍，母液已配好。注意：EB是一种诱变剂，配制和使用时应戴好手套，并且不能将该染液洒在桌面或地面上！使用后立即用大量的水冲洗干净。
5．0.5×TBE缓冲液：Tris 2.18g、硼酸1.10g、EDTA-Na20.14g用蒸馏水定容至400mL。可配成5×TBE母液，使用时稀释10倍即可。
6．0.7％琼脂糖
仪器：
37℃水浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、Eppendorf架、恒温摇床、台式小型振荡器、Ep管(1.5mL)、加样器(20uL～lmL)、吸头。
三、实验步骤
（一）质粒DNA的酶解
1．新提的质粒，在10uL的体系中用单一酶（如EcoRⅠ）进行处理，即：
质粒DNA 2μL
10×缓冲液 1μL
EcoRⅠ 0.5μL
ddH2O 6.5μL
2．37℃，保温30min。
3．加入1/10体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。各酶解样品于冰箱中贮存备用。
（二）琼脂糖凝胶板的制备
1．琼脂糖凝胶的制备
称取1.0g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入100mL TBE缓冲液，瓶口倒扣一小烧杯，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为1％。
2．胶板的制备
将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。
将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。
将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。
胶板内的样品小槽
3．加样
用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，以免造成限制酶被污染。加样时，吸头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右。(每块胶板需点一个Marker，这里即为λDNA/ Hind Ⅲ)
4．电泳
加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。
当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停止电泳。
5．染色
将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。染色20min后，用大量水冲洗。
6．观察
在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处显示出红色荧光条带。
用凝胶自动成像仪处理代替。
四、实验结果与分析
电泳结果图：
五、思考题
1．简述EB显色的原理。
答：琼脂糖凝胶中 DNA 最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以 嵌入 DNA 堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与 DNA 的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强 度的饱和溶液中，大约每 2.5 个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的 轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与 DNA 结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。 DNA 吸收 254nm 处的紫外辐射并传递给染料， 而被结合的染料本身吸收 302nm 和 366nm 的光辐射。 这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的 590nm 处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA 复合物 的荧光产率比没有结合 DNA 的染料高出 20-30 倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时， 可以检测到少至 10ng 的 DNA 条带。 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA 或 RNA） 。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小， 所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链 DNA 或 RNA 染色的荧光时通过染料结合到分子内９ 形成较短的链内螺旋产生的。
2．使用溴化乙锭时应注意什么？
答：溴化乙锭是强诱变剂，具有高致癌性！没办法的,只能带手套和自己小心 ,而且做完之后要做如 下处理实验结束后，应对含 EB 的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。 (1) 对于 EB 含量大于 0.5mg/ml 的溶液，可如下处理： ①将 EB 溶液用水稀释至浓度低于 0.5mg/ml； ②加入一倍体积的 0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的 25mol/L HCl，混匀，置室温数小时； ③加入一倍体积的 2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 (2) EB 含量小于 0.5mg/ml 的溶液可如下处理： ① 按 1mg/ml 的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置 1 小时； ② 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。
3．说明不同电压对电泳结果的影响是什么
答：在低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同 分子量的 DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越 大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小，也会产生拖尾现象。但电压过低，DNA 移动速 度会很慢，电泳时间较长。所以实际做电泳实验时应根据不同 DNA 片段和实验要求选择合适的电压。 通常使用的电泳电压为 90~120V。
4．如何判断DNA的纯度？
答：测定 DNA 浓度与纯度利用紫外可见分光光度计分别测定在波长 260nm 处、280nm 处 DNA 的 吸光率，然后计算其浓度与纯度。 对于纯的核酸溶液，测定 A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量。核酸的比吸光 系数是指浓度为 1ug/ml 的核酸水溶液在 260nm 处的吸光率， 天然状态的双链 DNA 的比吸光系数为 0.020， 变性 DNA（即单链 DNA）和 RNA 的比吸光系数均采用 0.022。 DNA 纯度可以 A260/A280 的比值表示：纯的 DNA 样品比值为 1.8，纯的 RNA 样品比值为 2.0。核 酸样品中若含有蛋白质或苯酚等杂质，此比值则显著降低。
实验三 感受态细胞的制备及转化
一、实验目的
1．学习和理解影响细胞感受态的因素，掌握感受态细胞的制备方法。
2．掌握质粒的转化方法。把体外DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。
二、实验材料和用具
材料：自制的质粒DNA、大肠杆菌(E.coli)菌种(DH5α菌株)。
试剂：
LB琼脂平板 (无抗生素)、
LB琼脂平板 (含50μg/L氨苄青霉素)、
LB液体培养基5mL(无抗生素)、
LB液体培养基100mL(无抗生素)、
LB液体培养基5mL(含50μg/L氨苄青霉素)、
0.1mol/LCaCl2溶液(灭菌备用)。
仪器：
恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、冷冻离心机、离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。
三、实验步骤
(一)大肠杆菌感受态细胞的制备
1．从新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃振荡培养过夜，直至对数生长期。将该菌悬液以1：50接种于50mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养3～4h。
2．取5mL培养液放入离心管中， 5000rpm离心10min。
3．可用加样器将残余液体尽量去净，用1mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30min。
4． 5000rpm离心10min。
5．弃上清，加入200μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态细胞悬液。
6．制好的感受态细胞可在冰上放置，24h内直接用于转化实验，也可加入占总体积95％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于Ep管中，-70℃条件下可保存半年至一年。
(二)细胞转化
取200μL摇匀后的感受态细胞悬液，进行下一步的转化，转化如下（单位：μL）：
样品组即为我们的转化组：100μL感受态细胞＋2μL质粒DNA
对照1为受体菌对照组：100μL感受态细胞＋2μL无菌水
对照2为质粒DNA对照组：100μL0.1mol/LCaCl2＋2μL质粒DNA
将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42℃水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却3～5min。上述各管中分别加入400μL LB液体培养基，使总体积为500μL，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养45~60min，使受体细胞恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。
(三)平板培养
取各样品培养液100μL分别接种于含氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的LB平板培养基上（分别记为Amp—和Amp＋），涂匀。37℃培养24h，待菌落生长良好且未相互重叠时停止培养。
四、实验结果
注意事项：
1．这一个实验中的所有操作均要为无菌操作，在超净工作台内进行。
2．细胞转化中，42℃水浴90s要准确操作。
3．制备感受态细胞过程中，需要在冰上放置的一定不要在室温中放置。
五、思考题
1．感受态细胞制备好后，为什么在转化前还要在冰上放置？
答：细菌处于 0℃，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞会膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面（因为 DNase 会消化外源 DNA，如形成抗 DNase 的物 质有利外源 DNA 的生存） ，从低温突然提高到 42℃短时间热刺激，应激反应下可产生大量 cAMP，而 cAMP 可改变细胞膜通透性，促使细胞吸收 DNA 复合物，从而大大提高转化率。
2．思考转化后平板培养应有的结果、分析自己培养的情况。
答：实验涉及两种菌体，一为不含氨苄抗性基因的细胞，二为含有氨苄抗性基因的细胞。细胞一 因为不含苄抗性基因， 所以会被氨苄杀死或抑制生长， 所以这种细胞只能在不含有氨苄的培养基上生长。 细胞二为含有氨苄抗性基因的细胞，能对氨苄产生抗性，故而这种细胞既能在不含有氨苄的培养基上生 长，又能在含有氨苄的培养基上生长。 A 组中只有菌体和 CaCL2 而无抗性基因，所以只有在不含氨苄的培养基上才能看到菌落，而在含有氨苄的培养基上不可能有菌落，否则为培养基染菌。 B 组中只有 CaCL2 和含有抗性基因的质粒而没有细胞，所以不管在那种培养基上都不应该长出菌 落，否则即为染菌。 C 组中含有 CaCL2、含有抗性基因的质粒和不含氨苄抗性基因的大肠杆菌细胞。在 CaCL2 的作用 下，细菌细胞壁结构发生变化，导致含有抗性基因的质粒进入细胞，此过程即为转化。此时的细胞即为 细胞二，所以不管是在含有氨苄的培养基上还是在不含有氨苄的培养基上都能观察到菌落。且在含有氨 苄的培养基上观察到的菌落数应该比在不含有氨苄的培养基上都能观察到菌落数少，因为转化这个过程 的效率不是 100%，没有转入抗性基因的细胞就不能在含有氨苄的培养基上生长。
观察平板，与理论相符，但菌落的数量明显偏少。
实验感想：
此次分子生物学实验时间安排上比较紧凑，操作较以往实验也要精细。整体而言倒不见得比以往的实验要难，但事实上我所学到的东西却比从之前的生物学实验中学到的要多得多。因为这个实验不再是零散的大家做完就回去总结这个实验然后准备做下一个实验，这次实际上就是一个两天内完成大实验，它教会我们生物学实验对时间的严格要求，对试剂的准确把握，给我留下的记忆非常深刻。尽管个实验很小，但却教会我科学，尤其是生物学的严谨性。