分子生物学实验
创新学院生物科学101班 韩宝泉 2010014871
本次大试验我们以大肠杆菌、幼嫩的小麦为原料，分别提取了质粒、DNA、RNA，并以其为主材料进行了诸如PCR、酶切、Southern杂交等实验项目，取得了较为良好的实验效果，以下为实验的总流程：
1. 质粒提取：①质粒1（GFP） 转化涂板 培养 Arabine培养基涂板
GFP表达观察 ②质粒2（P38）主要进行PCR、酶切、Southern杂交三项操作，其中PCR包括电泳检测、探针标记、Southern胶点样、T载体连接（包括转化、蓝白斑筛选、菌落PCR）。
2.植物DNA和RNA的提取：①gDNA提取 Southern胶点样、基因组酶切、基因组PCR ②RNA提取 RT cDNA PCR
实验过程
星期一 20##年5月21日
一、实验目的
1、 学习碱裂解法提取质粒的原理。
2、 学习质粒酶切和电泳分析。
3、 学习琼脂糖凝胶的制备。
4、 学习PCR反应的基本原理和实验技术。
二、实验原理
1、 质粒DNA的提取
利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
2、 琼脂糖凝胶电泳
溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DNA发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng的DNA。
在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。
3、 质粒DNA酶切
限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。
4、聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA
聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术。
PCR进行的基本条件：
①DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）
②引物
③dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
④Taq DNA聚合酶
⑤反应缓冲体系
PCR循环由三个步骤组成：
①变性 使模板DNA解离成单链；
②退火 使引物与模板DNA所需扩增序列结合；
③延伸 DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。
本实验以实验中提取的质粒DNA为模板，进行PCR扩增，大量得到目的DNA片段。
三、实验材料和设备
1、质粒DNA的提取：
含质粒的大肠杆菌，溶液Ⅰ（50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH,1% SDS，必须新鲜配制），溶液Ⅲ（pH4.8的醋酸钾溶液），TE缓冲液（pH 8.0），无水乙醇和70%乙醇。
2、琼脂糖凝胶电泳：DNA样品，TBE缓冲液（5×，用时需稀释10倍），点样缓冲液Loading buffer（10×），溴乙啶(EB)，琼脂糖
3、质粒P38酶切（30ul体系）：EcoRⅠ酶（1ul），P38质粒（10 ul），buffer（10×，3ul）,水（16ul）
4、P38的PCR（30ul体系）：2×Mix（15ul），正向引物P1（1ul），反向引物P2（1ul），P38（1ul），水（12ul）
四、实验步骤及方法
1、 质粒DNA的提取（P38需菌液3ml，GFP需菌液1.5ul）:
①将菌液移入1.5ml 离心管，离心30s（13000rpm），倒去上清液，重复一次，收集3ml 菌液。
②加入100μl预冷的溶液Ⅰ(含5ug/μl RNAase)，用涡旋震荡器充分悬浮。
③加入150μl溶液Ⅱ，快速颠倒温和混匀，室温放置5min。此时溶液应非常粘稠。
④加入150μl 预冷的溶液Ⅲ，温和混匀（此时应有可见沉淀），在冰浴中5min。
⑤12000rpm离心10分钟。转移上清液400ul至另一1.5ml离心管中。
⑥加800μl乙醇到上清液中，混匀， 12000rpm离心10min，除去上清（尽可能除去残液）。
⑦用0.5ml 70% 乙醇洗DNA沉淀一次，离心2min，除去乙醇。开盖干燥10min,加50ul水，快速离心10s,备用。
2、凝胶的制备
将5×TBE缓冲液25ml稀释10倍或250ml溶液。加入1.5g琼脂糖粉，加热混匀于150ml配好的溶液中，制成1%的凝胶溶液，待溶液冷却至60摄氏度左右时，轻轻倒入电泳槽水平板上，除去气泡，待凝固后使用。
3、质粒GFP及P38的凝胶电泳
①在一次性手套上均匀点上一些Buffer。
②用移液枪吸取5ul的GFP使其与Buffer混匀。
③将混合物进行点样。
④P38的点样与GFP的基本一致。
⑤开启电泳槽，电泳后用EB处理后拍照分析。
4、 P38的酶切
按上述30ul酶切反应体系加入原料，快速离心混匀，置于37摄氏度水浴中，备用。
5、 P38的PCR
按上述30ulPCR反应体系加入原料，快速离心混匀，冰浴，设置PCR程序（变性温度94摄氏度，退火温度55摄氏度，延伸温度72摄氏度，最后温度16摄氏度，其中循环30次），运行进行PCR操作，在低温下保存。
五、实验结果
对刚提取出的质粒GFP和P38做电泳，可以观察到我们所提取的DNA的量的大小以及纯度。试验中我们所得到的电泳条带都在上方有一条较亮的条带，且P38的最亮条带较高，说明我们所提取的质粒DNA量足且纯度高。
星期二 20##年5月22日
一、实验目的
1、学习质粒的酶切及电泳分析。
2、学习用电泳结果分析酶切、PCR的工作结果。
3、掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。
4、掌握感受态细胞的制备方法。
5、学会Southern杂交的原理及操作方法。
6、掌握用诱导物诱导外源基因表达的方法。
二、实验原理
1、P38酶切产物电泳分析
限制性内切酶将P38酶切后会生成相应的DNA片段，将其电泳处理会呈现2—3条区带，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。
2、P38PCR产物电泳分析
由PCR扩增出来的DNA片段会很多，因此电泳处理会产生一条粗且非常明亮的条带。
3、质粒载体和外源DNA的连接反应
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。载体与外源DNA的连接是否成功可用蓝白斑筛选。
4、感受态细胞的制备及转化
感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。通常用0.1mol/LCaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源 DNA进入细胞。
5、地高辛标记的Southern杂交
Southern印迹杂交包括两个步骤①把电泳分级的DNA转移到固定支持膜上。②与标记的DNA探针杂交。
地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。
所用的杂交膜可以选择硝酸纤维素和尼龙膜。硝酸纤维素膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电的膜和不带电的膜两种。带正电的膜对核酸结合力强，敏感性也高。不带电的结合力低。敏感性差。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液（0.1×SSC,0.1%SDS）煮沸5-10分钟后去探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。
6、阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达
绿色荧光蛋白（GFP）基因来自海底生物多孔水母，该基因表达产物在紫外光照射下可发出绿色荧光。现已将该基因克隆到阿拉伯糖启动子驱动的原核表达pGLO中，通过阿拉伯糖的诱导，可使该基因在细菌中进行表达。
三、实验材料和设备
1、电泳：Buffer试剂
2、质粒载体和外源DNA的连接反应：P38的扩增引物，T4DNA连接酶，T—easy载体，Buffer
3、感受态细胞的制备及转化：0.1mol/LCacl2，LB液体培养基，氨苄青霉素（100mg/ml），菌液
4、地高辛标记的Southern杂交：P38的扩增产物，P38的酶切产物，P38质粒，DIG Random Labeling Mix，Anti-DIG-AP Conjugate，BCIP/NBT Stock Solution ，Blocking Reagent，20×SSC 0.3M 柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC 0.03M 柠檬酸钠，0.3M NaCl，0.2M EDTA，变性液：0.5N NaoH,1.5M NaCL，中和度： 0.5M Tris-HCl,Ph7.4,3M NaCl
5、阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达：氨苄青霉素，2% 阿拉伯糖，LB固体培养基（添加amp的终浓度为100μg/ml，添加arabinose为培养基的0.2%）
四、实验步骤及方法
1、P38酶切电泳，P38PCR产物电泳
将第一天的P38酶切产物和P38的PCR产物做凝胶电泳，P38酶切产物点样10ul，PCR产物点样5ul。
2、质粒载体和外源DNA的连接反应
按10ul体系添加2×Buffer5ul，PCR产物3ul，T—easy1ul，T4DNA连接酶1.5ul于1.5ml离心管中，放入离心机中，然后快速离心30s，使反应体系充分混合，室温搁置1h。
3、感受态细胞的制备及转化
①分两次将3ml菌液加入1.5ml离心管中，第一次加入后14000rpm离心1min，弃上清，第二次加入菌液600—800rpm离心1min，弃上清。
②用800ulCaCl2将沉淀吹洗成悬液，然后冰浴5min。
③用4000rpm离心10min然后弃上清，再加入200ulCaCl2重悬液体。
④取两支1.5ml离心管，在其中一管中加入之前的连接产物，再在另一管中加入GFP质粒，，然后分别在两管中加入200ul感受态细胞，冰上放置10min。
⑤在42℃水浴中搁置60s。（热激）
⑥在离心管中加入1ml液体培养基，在摇床上摇菌1h。
4、阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达及蓝白斑筛选
①溶解LB固体培养基2瓶，待温度适宜后在一瓶中加入氨苄青霉素和阿拉伯糖，另一瓶中只加入氨苄青霉素，然后混匀。
②待凝固前倒平板，冷却后方可使用。
③将转化菌涂在8个LB/amp/arabinose平板上，另外的涂在4个LB/amp平板上。
④在之前的连接产物的离心管中加入6ulIPTG和30ulX—gal，然后涂布在4个LB/amp平板上。
⑤37℃培养16小时。
⑥紫外灯下进行检测。
5、地高辛标记的Southern杂交
（1）探针的标记
①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μgDNA至总体积16μl.。
②DNA热变性：把DNA置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。
③加4μl DIG Random Labeling Mix(高效)，混匀后再离心2000/rmp 5分钟。
④置于37℃反应至少120分钟。时间越长，产量越高。
⑤加入2μl EDTA以终止反应。
（2）Soutern转移
①将目的基因经琼脂糖凝胶电泳的胶板从电泳槽中取出，凝胶浸入0.25mol/L HCl 中10分钟（HCl处理的作用主要是通过嘌呤使DNA分子断裂，因而有利于高分子量DNA的转移，但不能处理时间过长）。
②进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20-30分钟。
③把凝胶浸入变性液中，室温浸泡15分钟×2次。
④蒸馏水漂洗凝胶2次。
⑤把凝胶浸入中和液中，室温泡15分钟×2次。
⑥处理凝胶的同时，切一张同样大小的硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜用2 × SSC 浸泡。剪两张Whatman3#滤纸和吸水用的粗滤纸（注意不要用手直接触及膜面）。
⑦准备一个小的解剖盘，在上方搭上长方形玻璃片。转移用平器和支架，解剖盘中放20 × SSC 。在玻璃片上搭上用20 × SSC浸湿过的滤纸桥使得溶液能够虹吸上来。
⑧依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜（注意：检查pH值，用硝酸膜时pH<9），滤纸、吸水纸，瓷砖、砖块，确保各层间没有气泡（否则会发生局部绝缘，气泡处的DNA 难以吸附到膜上）。
⑨于室温转移12-20小时。
五、实验结果
1、P38酶切产物电泳的最上方有一条亮带，是质粒，下方是一片亮带，但亮度暗于质粒的；P38PCR扩增产物电泳的条带最上方是一条较亮的条带，代表质粒，中间部分代表的是扩增出来的DNA片段，最亮，下方是稍亮的一片亮带，代表的是多聚引物。
2、质粒与载体的练接需等到后续试验的蓝白斑筛选才可看到结果，阿拉伯糖的诱导绿色荧光蛋白的表达也需要培养后用紫外线照射才能观察。
3、用于地高辛标记的Southern杂交用时较长，需进一步观察。
星期三 20##年5月23日
一、实验目的
1、掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。
2、学习大分子量DNA酶切的方法及分析。
3、掌握蓝白斑筛选的原理和方法。
二、实验原理
1、植物基因组DNA提取
十六烷基三乙基溴化胺（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。在本实验方案中，首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液，中层为蛋白质和细胞碎片，下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。由于CTAB能溶解于乙醇，在洗涤过程中CTAB即可被除去。
2、蓝白斑筛选
宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。
三、实验材料和设备
1、植物基因组DNA提取，酶切，PCR：
小麦幼苗、液氮、抽提液、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、Buffer、BamHI酶、Mix、引物等。
2、菌落PCR：菌落、Mix、P1、P2、水等。
3、转化板的观察：转化培养皿
四、实验步骤及方法
1、植物基因组DNA提取：
①取0.15g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中，加入700μl抽提液（65℃预热）混匀，放入65℃水浴中，裂解40-60分钟，期间温和混匀几次。
②取出裂解好的DNA ，加入700μl 氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀， 10000rpm离心5分钟。
③取上清于新管中（不要混入氯仿），加入700μl （约0.8-1倍）预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃放置半小时以上。
④将析出的DNA 离心，14000rpm，10分钟。
⑤去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，12000rpm离心2min，然后开盖干燥10min，再用100μl水溶解沉淀。
2、菌落PCR和菌落PCR产物的电泳：
①从菌落中挑去无色的菌液。
②按30ul反应体系：2×Mix15ul，菌液1ul，引物1和2各1ul，水2ul加入试剂，快速离心混匀。
③其他过程同一般PCR过程。
④PCR反应完成后，将产物电泳分析，点样20ul。
3、基因组DNA酶切、PCR及它们产物的电泳：
①酶切反应体系（20ul）：10×Buffer 3ul，DNA 20ul，酶（BamHI）1ul，水6ul；
PCR反应体系（30ul）：2×Mix 15ul，基因组DNA 1ul，P1和P2各1ul，水1ul。
②按上述反应体系加入反应物后，1000rpm离心20s混匀，酶切的置于37℃反应4h，PCR的离心管则置于PCR仪进行反应。
③待反应完成后，电泳分析，两种反应产物各点样20ul。
4、转化板的观察（蓝白斑的筛选）：将培养箱中培养的培养皿拿出，在紫外灯的照射下观察所产生的菌落的颜色。
5、地高辛标记的Southern杂交中硝酸纤维膜的固定及预杂交：
①从前一天放置的多层吸水纸及滤纸下取出转移膜，用2×SSC漂洗数次，以洗去不易吸附在膜上的凝胶。
②将洗净的硝酸纤维膜置于两层滤纸中间放入普通烘烤箱中80℃下烘烤3h。
③3h后，将转移好的硝酸纤维膜装入杂交管中，贴壁放置，赶走杂交膜与管壁间的气泡。
④加入20ul standard buffer，65℃预杂交4—20h。
⑤将制备好的DNA探针沸水浴加热10min，然后迅速插入冰中，全部加入杂交管。
⑥使用与预杂交相同的温度，65℃杂交过夜。
五、实验结果
1、gDNA的电泳凝胶上，最上的一条带较亮，代表gDNA，下面的一片稍暗是RNA杂带。
2、gDNA酶切的结果是条带均匀分布的多条亮带，这是因为酶切不是特异性的，所以在合适位点都可进行切割，于是片段大小随机分布，条带也随之分布。
3、菌落PCR和gDNAPCR在胶的上方都有PCR产物的较亮的条带。
4、实验结果显示在转化的培养皿上未发现蓝色菌落，则连接较为成功，载体和外源DNA大致全部连接上。
星期四 20##年5月24日
一、实验目的
1、掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各项操作要求。
2、学习从细胞或组织的RNA中用RT—PCR扩增目的基因的技术和操作。
二、实验原理
1、植物RNA提取、定量及电泳分析：
RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带，如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带。
2、RT—PCR扩增目的基因cDNA：
普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因，但真核生物的基因中大多包含内含子，所以从染色体DNA为模板扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表达。人工去除内含子是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA聚合酶，在oligo（dT）的引导下合成mRNA互补的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的5，和3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。
三、实验材料和设备
1、RNA提取与纯化：
暗培养7天的小麦苗，DEPC处理的ddH2O，RNA提取液（含有Tris 、LiCl 、EDTA、SDS），8mol/L的Li Cl，水饱和酚，无水乙醇，氯仿
2、RT—PCR：
RNA模板，cDNA引物，反转录缓冲液，dNTP，AMV反转录酶，RNA抑制剂（RNasin），Taq酶，10×PCR缓冲溶液，引物（P1、P2）
3、阿拉伯糖诱导的绿色荧光蛋白表达的检测：
培养大肠杆菌的培养皿，紫外灯
四、实验步骤及方法
1、RNA提取和纯化与电泳分析：
①取植物叶片2克，放在液氮中磨成粉末。
②液氮挥发完之前，倒入含有10 毫升RNA提取液的1ml于离心管中，冰浴待研磨好植物叶片后加入粉末。然后迅速反复倒置混匀，直至看不见任何团状物为止。立即加入等体积氯仿，剧烈反复倒置混匀5分钟。
③12000rpm离心15分钟，吸管取上清500ul，再加入500ul的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置5—10分钟。
④12000rpm离心15分钟，用DEPC处理过的70%乙醇清洗。
⑤12000rpm离心2分钟，弃上清，打开离心管的盖子晾干10min。
⑥加入30 ul DEPC 处理过的水溶解RNA。
⑦从离心管中去10ulRNA做电泳。
2、RT—PCR：
（1）RNA的反转录
①从上述电泳结果中选取电泳结果较好的样品，并从它们相应的试管中取5ul按12ul体系，再加入6ulDEPC处理过的H2O和1ul oligo primer放入新的离心管中。
②将它们混合后,65℃水浴5分钟，破坏其二级结构，使RNA变性。
③取出离心管，置于冰浴5分钟，然后按下列体系加入试剂：4ul buffer ( 5×) ，1ulRNasin，2uldNTP ( 10mM)，1ulRTase。
④置于 42℃水浴, 1 小时。然后在70℃水浴中5min，使酶失活，反应终止，得到cDNA。
（2）PCR扩增DNA
①在灭菌的0.5ml离心管中，依次加入：15ul 2×Mix，1ul cDNA，引物1和2各1ul，12ul水，并快速混匀。
②按下面的设置程序进行扩增。
94 ℃ 180s
94 ℃ 45s
30 cycles: 55 ℃ 60s
72 ℃ 90s
72 ℃ 600s
③再用上述PCR产物取20ul跑胶。
3、地高辛标记的Southern杂交的显色反应：
①杂交结束后将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20℃以备下次使用。
②取出杂交膜，用Wash Solution I 洗5分钟，重复做3次。
③保温冲洗：用 Wash Solution II 于68℃冲洗15分钟，洗2次。
④经过杂交及杂交后的冲洗后，将膜置于冲洗液中平衡1min。
⑤用奶粉制的封闭液将膜室温封闭过夜。
4、阿拉伯糖诱导的绿色荧光蛋白表达的检测：
从培养箱中拿出培养皿，用紫外线照射两种培养皿，观察是否有绿色荧光的菌落。
五、实验结果
1、DNA分析电泳中跑出的条带中，最上面的一条是28S，中间的是18S，在下方的区域分布的代表叶绿体内的DNA，由于28S与18S之间没有杂带，说明我们提取的RNA较纯。
2、cDNA的分析电泳中主要有两条亮带，上面的为gDNA，下面的代表cDNA。因为gDNA是基因组DNA，基因中包含很多内含子，而cDNA是反转录来的，没有内含子，因此分子量较gDNA较小，于是电泳中后者跑得快，则其位于下方。
星期五 20##年5月25日
一、实验目的
学习BCIP/NBT显色检测法。
二、实验原理
以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BCIP/NBT显色，敏感性很高。
三、实验材料和设备
以前制备的置于封闭液中的地高辛标记的Southern杂交膜，封闭液，Anti—DIG—AP，显色液
四、实验步骤及方法
1、用封闭液1：2500稀释 Anti-DIG-AP。
2、加稀释好的Anti-DIG-AP，37℃反应60分钟。
3、用冲洗液洗15分钟，洗3次，每次100ml。
4、按1：50配制底物显色液。
5、显色缓冲液20ml平衡2分钟后倒掉。
6、在每张膜所在的培养皿中加2ml底物显色液（将膜及显色剂封在塑料袋中，开始避光显色。显色过程中可以观察。一般数分钟即开始出现颜色，显色过程可以持续至12小时。应绝对避免震动，以免出现颜色带的移位）。
7、当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以终止反应。结果可以进行照相记录。
五、实验结果
1、PCR所跑的条带较多，比酶切的条带要大，因为引物与酶切的位点有差别。
2、酶切的胶带显示：下面的带代表酶切，上面的代表的是未被酶切的残余质粒，而质粒中下部最多的是双螺旋的质粒。