生物化学实验报告

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生物化学与分子生物学实验教学中心

一、实验目的

1、掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；

2、熟悉血清总蛋白的临床意义；

3、了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。

二、实验原理

（一）：双缩脲反应

在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应 ，生成紫红色络合物；蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。

三、材料与方法：

实验材料

样品：大牛血清

试剂：双缩脲试剂、蛋白质标准液（70g/L）、生理盐水（0.9%）

器材：试管、加样枪、刻度吸管、洗耳球

设备：1100分光光度计、水浴锅

实验步骤

取3支试管，做好标记(B空白对照，S标准液，U为待测大牛血清)，按下表操作：

a.各管混匀，观察各试管颜色

b.将各试管置于37℃水浴锅中加热20min，观察颜色

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双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价

摘要：目的  评价双缩脲法测定血清总蛋白的方法性能。方法  配制双缩脲试剂，并用所配双缩脲试剂和标准血清蛋白进行批内重复性试验、回收试验、线性范围测定。结果  双缩脲法测定血清总蛋白的批内重复性试验的变异系数CV%为6.42，回收试验平均回收率为109.3%，线性范围测定的R²为0.9877。结论  双缩脲法测定血清总蛋白的性能不高，本人测得的批内重复性试验的变异系数CV%偏大，回收率偏高，线性范围一般，或许这是个人操作因数，因为还有其他同学的结果比较好的。

关键词：双缩脲法；血清总蛋白；方法学评价

双缩脲法测定血清总蛋白至今已经有近100年的历史，其间该方法也得到不断改进，是目前测定血清总蛋白的常用方法之一。《全国临床检验操作规程》推荐Doumas双缩脲配方作为血清总蛋白测定的常规方法^[1]。方法学评价对于医学检验专业学生日后在工作中评价检验方法非常重要，对培养学生逻辑思维和实验室质量控制具有重要作用。本文介绍双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价，对学生练习和掌握方法学评价有重要意义。

双缩脲试剂鉴定蛋白质的原理：双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此，也能在碱性环境中与二价铜离子结合生成紫红色络合物。此反应不需要加热，被用来定性鉴定蛋白质。但请注意：凡含有2个以上肽键的物质或含有1个肽键和1个一CS—NH₂、一CH₂一NH₂、一CH₂0H、一CHOHCH₂NH₂等基团的物质，以及乙二酰乙二胺都有此颜色反应。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽均有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽^[2]。

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双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价

吴文钦

（广东医学院医学检验学院  广东-东莞  523808）

摘要：目的  对双缩尿法测定血清总蛋白进行方法性能评价，达到提高分析方法质量的目的。方法  配制双缩脲试剂，并用所配制的双缩脲试剂与标准血清总蛋白进行批内重复性试验、回收试验以及线性范围评价试验，从而评价双缩尿法测定血清总蛋白的精密度、准确度和线性范围。结果  用分光光度计测定波540nm处的吸光度A，进行相关数据分析，双缩脲法测定血清总蛋白的批内重复性试验的变异系数 CV%为2.36%，回收试验平均回收率为105%，线性范围评价试验R²为0.9980。结论  在严格规范操作下，双缩脲法测定血清总蛋白的精密度高，准确度以及线性范围较好，满足临床对血清总蛋白定量测定要求，是临床测定血清总蛋白的常规方法。

关键词：双缩脲法；血清总蛋白；方法学评价

Biuret method was developed for the determination of protein evaluation methodology

Abstract  Objective  The purpose of the double reduction of urine protein determination of serum total performance evaluation methods, to improve the quality of analytical methods.Methods  Biuret test preparation, and formulated with the biuret test standard serum total protein in the assay reproducibility test, recovery test and linear range of evaluation test to evaluate the double reduction of urine assay precision of serum total protein, accuracy and linear range.Results  A spectrophotometer absorbance at 540nm wave, the associated data analysis, determination of intra-assay coefficient of variation of total serum protein test reproducibility CV% was 2.36%, the average recovery recovery test 105% biuret method, linear evaluation test range R2 is 0.9980.Conclusion  In the strictly regulate the operation, biuret serum total protein, high precision, accuracy and linearity better meet the clinical requirements for quantitative determination of total serum protein, serum total protein conventional methods of clinical measurement.

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双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价

摘要：目的  评价双缩脲法测定血清总蛋白的方法性能。方法  配制双缩脲试剂，并用所配双缩脲试剂和标准血清蛋白进行批内重复性试验、回收试验、线性范围测定。结果  双缩脲法测定血清总蛋白的批内重复性试验的变异系数CV%为6.42，回收试验平均回收率为109.3%，线性范围测定的R²为0.9877。结论  双缩脲法测定血清总蛋白的性能不高，本人测得的批内重复性试验的变异系数CV%偏大，回收率偏高，线性范围一般，或许这是个人操作因数，因为还有其他同学的结果比较好的。

关键词：双缩脲法；血清总蛋白；方法学评价

双缩脲法测定血清总蛋白至今已经有近100年的历史，其间该方法也得到不断改进，是目前测定血清总蛋白的常用方法之一。《全国临床检验操作规程》推荐Doumas双缩脲配方作为血清总蛋白测定的常规方法^[1]。方法学评价对于医学检验专业学生日后在工作中评价检验方法非常重要，对培养学生逻辑思维和实验室质量控制具有重要作用。本文介绍双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价，对学生练习和掌握方法学评价有重要意义。

双缩脲试剂鉴定蛋白质的原理：双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此，也能在碱性环境中与二价铜离子结合生成紫红色络合物。此反应不需要加热，被用来定性鉴定蛋白质。但请注意：凡含有2个以上肽键的物质或含有1个肽键和1个一CS—NH₂、一CH₂一NH₂、一CH₂0H、一CHOHCH₂NH₂等基团的物质，以及乙二酰乙二胺都有此颜色反应。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽均有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽^[2]。

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授课对象：06级检验1-5班 课 时：1学时

血清总蛋白测定(双缩脲法)

目 标：1.掌握双缩脲法测定总蛋白的原理及注意事项。

2.熟练测定操作步骤。

3.了解TP测定的主要临床意义。

实验用品：水浴箱（37℃），721型分光光度计，双缩脲试剂，双缩脲空白试剂，蛋白

标准液（70g/L），生化质控血清等。

内 容：

原理：

蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与铜离子作用生成紫红色的络合物，产生的颜色强度在一定范围内与蛋白质的含量成正比，与同样处理的蛋白标准液比较，经计算或查标准曲线即可求出血清蛋白质含量。

蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与铜离子作用生成紫红色的络合物与两分子尿素缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形成的紫色物质的反应相似，故称之为双缩脲反应。

※ 双缩脲结构: H2N—OC—NH—CO—NH2试剂:

试剂：

1．154mmol/L NaOH溶液

2．6mol/L NaOH溶液

3．双缩脲试剂：称取硫酸铜(CuSO4·5H2O)3.0g,溶于500mL新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，加酒石酸钾纳(NaKC4H4O6·4H2O)9.0g，碘化钾5.0g，待完全溶解后，加入6mol/L Na2OH 100ml,最后加蒸馏水至1000mL。

4．蛋白质标准液：市售。

操作：(按下表)

加 入 物(ml) 待 测 血 清 蛋白标准液 154mmol/L NaCl 双缩脲试剂

R(测) 0.1 - 0.4 5.0

S(标) - 0.1 0.4 5.0

B(空) - - 0.5 5.0

混匀,置37℃10min(25℃30min).以”B”管校”0”, λ=540nm比色,读取A值计算。

计算及结果报告：

血清总蛋白(TP)=A测/A标×C标

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实验一:双缩脲法测定蛋白质含量

一  目的  掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。

二  原理

双缩脲(                           )是两分子尿素经180℃左右加热,放出一分子氨( NH3)后得到的产物。在强碱溶液中，双缩脲与CUSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。其原因是含有两个及以上肽键或类似肽键有化合物都具有类似双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与CU2+络合成紫红色的络合物。其颜色的深浅与被测样品中蛋白质浓度呈正比，而与蛋白质分子量和氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该法对样品中蛋白质含量要求相对较高，一般在1—10mg/L蛋白质。tris（三甲羟基氨基甲烷）、一些氨基酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、草二酰胺、多肽等会于扰该测定。

在一定浓度范围内，反应后颜色与被测样品蛋白质含量呈线性关系，即蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大吸收峰（吸光度）。

   将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白质溶液同时与双缩脲试剂反应，并在540nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品中的蛋白质含量（浓度）。

   由于本法操作简便、迅速、蛋白质浓度与光密度的线性关系好，故对蛋白质快速而不需要十分精确的测定可用此法。

三  仪器与器材

可见光分光光度计、水浴锅、分析天平、振荡机（器）、漏斗、试管架、具塞三角瓶（100ml）

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实验八  双缩脲法测定面粉中蛋白质的含量

一、目的要求

1．学习双缩脲法的基本原理及操作。

2．通过实验学会制作标准曲线。

二、实验原理：

双缩脲（NH₃CONHCONH₃）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO₄形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。在一定的浓度范围内，紫色络合物颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系（即：颜色的深浅与蛋白质浓度成正比）而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可在540nm处比色用来测定蛋白质含量。测定范围为1－10mg蛋白质/ml。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

    此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

三、操作方法：

1．标准曲线的制作。酪蛋白：10mg/ml（如果用干酪素来配制则需用0.05M NaOH做溶剂，也可以用酪蛋白酸水解物直接配制。）

计算出各管浓度（计算出各管浓度，再做标准曲线，那么最后计算的公式中就不用除以6了，这么做好理解些。）

混匀，放置30分钟后，在540nm处以1号管调0点，测定各管吸光度，以吸光度（OD值）为纵坐标，蛋白质浓度（酪蛋白的毫克数）为横坐标绘制标准曲线。

四、样品处理

1．0.25g小麦面粉＋0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂（四氯化碳为有机溶剂，在这里作为分散剂，使面粉不成团。）；

2．加塞，在摇床上振摇30分钟，使之充分混匀、反应，然后于实验台上静置10分钟；

3．离心，4000rPm，离心15分钟；

4．取上清比色：OD 540 nm；（在用滴管取上清时要轻、缓，避免沉淀物上浮。对照管是以介质溶液调零，即去除样品后的溶剂，在这里为0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂。）

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