授课对象：06级检验1-5班 课 时：1学时
血清总蛋白测定(双缩脲法)
目 标：1.掌握双缩脲法测定总蛋白的原理及注意事项。
2.熟练测定操作步骤。
3.了解TP测定的主要临床意义。
实验用品：水浴箱（37℃），721型分光光度计，双缩脲试剂，双缩脲空白试剂，蛋白
标准液（70g/L），生化质控血清等。
内 容：
原理：
蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与铜离子作用生成紫红色的络合物，产生的颜色强度在一定范围内与蛋白质的含量成正比，与同样处理的蛋白标准液比较，经计算或查标准曲线即可求出血清蛋白质含量。
蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与铜离子作用生成紫红色的络合物与两分子尿素缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形成的紫色物质的反应相似，故称之为双缩脲反应。
※ 双缩脲结构: H2N—OC—NH—CO—NH2试剂:
试剂：
1．154mmol/L NaOH溶液
2．6mol/L NaOH溶液
3．双缩脲试剂：称取硫酸铜(CuSO4·5H2O)3.0g,溶于500mL新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，加酒石酸钾纳(NaKC4H4O6·4H2O)9.0g，碘化钾5.0g，待完全溶解后，加入6mol/L Na2OH 100ml,最后加蒸馏水至1000mL。
4．蛋白质标准液：市售。
操作：(按下表)
加 入 物(ml) 待 测 血 清 蛋白标准液 154mmol/L NaCl 双缩脲试剂
R(测) 0.1 - 0.4 5.0
S(标) - 0.1 0.4 5.0
B(空) - - 0.5 5.0
混匀,置37℃10min(25℃30min).以”B”管校”0”, λ=540nm比色,读取A值计算。
计算及结果报告：
血清总蛋白(TP)=A测/A标×C标
结果报告：
被检者：
TP__________g/L［60～80g/L］
＿＿＿年＿＿月＿＿日 检查者：＿＿＿＿
附注：
1.由于各种血清蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用mol/L表示。
2.双缩脲反应并非蛋白质的颜色反应。凡分子内含有两个或两个以上氨基甲酰基（－CONH2），不论是直接相连还是通过一个氮或碳原子间接连接，均可呈双缩脲反应。如缩二脲，草酰二胺２，丙二酰胺等
3.双缩脲试剂中酒石酸钾钠的作用是络合铜离子，以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性；碘化钾能防止两价铜离子还原．
4.高脂，黄疸及溶血标本应作清空白对照来校正误差。含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现混浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色．
5.血清TP＞100g/L时，需作稀释处理，结果乘上稀释倍数． 临床意义：
1.清总蛋白生理性波动：长久卧床者比直立活动者约低3～5g/L；新生儿比成人低
5～8g/L；60岁以上的老人约比青壮年低2g/L。
2.清总蛋白增高：
①血液浓缩：腹泻、呕吐等。
②合成增加：如多发性骨髓瘤等。
3.清总蛋白降低：
①血液稀释：过多注射低渗溶液，各种原因引起的水钠潴留。
②摄入量不足和消耗增加：营养不良、慢性肠胃炎、严重结核病等。 ③合成障碍：肝脏疾病。
④蛋白质丢失：严重烧伤时大量血浆渗出，肾综合症等。
课后小结：
第二篇：双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价
双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价
吴文钦
（广东医学院医学检验学院 广东-东莞 523808）
摘要：目的 对双缩尿法测定血清总蛋白进行方法性能评价，达到提高分析方法质量的目的。方法 配制双缩脲试剂，并用所配制的双缩脲试剂与标准血清总蛋白进行批内重复性试验、回收试验以及线性范围评价试验，从而评价双缩尿法测定血清总蛋白的精密度、准确度和线性范围。结果 用分光光度计测定波540nm处的吸光度A，进行相关数据分析，双缩脲法测定血清总蛋白的批内重复性试验的变异系数 CV%为2.36%，回收试验平均回收率为105%，线性范围评价试验R2为0.9980。结论 在严格规范操作下，双缩脲法测定血清总蛋白的精密度高，准确度以及线性范围较好，满足临床对血清总蛋白定量测定要求，是临床测定血清总蛋白的常规方法。
关键词：双缩脲法；血清总蛋白；方法学评价
Biuret method was developed for the determination of protein evaluation methodology
Abstract Objective The purpose of the double reduction of urine protein determination of serum total performance evaluation methods, to improve the quality of analytical methods.Methods Biuret test preparation, and formulated with the biuret test standard serum total protein in the assay reproducibility test, recovery test and linear range of evaluation test to evaluate the double reduction of urine assay precision of serum total protein, accuracy and linear range.Results A spectrophotometer absorbance at 540nm wave, the associated data analysis, determination of intra-assay coefficient of variation of total serum protein test reproducibility CV% was 2.36%, the average recovery recovery test 105% biuret method, linear evaluation test range R2 is 0.9980.Conclusion In the strictly regulate the operation, biuret serum total protein, high precision, accuracy and linearity better meet the clinical requirements for quantitative determination of total serum protein, serum total protein conventional methods of clinical measurement.
Key words Biuret method; Total serum protein; Evaluation Methodology
为满足临床医疗对实验室检验的不断要求，实验室需要不断引进新方法或者改进原有的方法。引进或改进新方法在进入临床应用时，需要对其进行方法性能评价，达到提高分析方法质量的目的。双缩脲法测定血清总蛋白至今已经有近100年的历史，其间该方法也得到不断改进，是目前测定血清总蛋白的常用方法之一 [1]，《全国临床检验操作规程》推荐Doumas双缩脲配方作为血清总蛋白测定的常规方法[2]。方法学评价对于医学检验专业学生日后的工作中评价方法非常重要，对培养学生逻辑思维和实验室质量控制具有重要作用。本文介绍用所配制的双缩脲试剂与标准血清总蛋白进行批内重复性试验、回收试验以及线性范围评价试验，从而评价双缩尿法测定血清总蛋白的精密度、准确度和线性范围。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 分光光度计
1.1.2 试剂 配制双缩脲试剂的基本试剂有NaOH、硫酸铜结晶、酒石酸钾钠、碘化钾。30g/L 蛋白质标准液60g/L ,蛋白质标准液，150g/L 蛋白质标准液，待测血清标本，蒸馏水。
1.2 方法
1.2.1 批内重复性试验
1.2.1.1 取13支试管,分别标记空白管1支,标准管2支,测定管10支,按表1添加试剂。
表1 试剂添加
充分混匀，37 ℃水浴10 min或室温放置30min，在波长540nm处比色，以空白管调零，测定各管吸光度。
1.2.1.2 结果记录和处理
待测样品浓度：血清蛋白质 (g/L)=A测/A标×30
平均值： SD=(∑Si2)½
Si^2= ∑(Xi- x)^2/n-1，CV%= (SD÷x)×100
表2 双缩脲法重复性实验测定蛋白总浓度
1.2.1.3 讨论评价
批内重复试验测得数据的平均蛋白浓度为60.59g/l,方差SD为2.05,变异系数CV%为2.36%<2.5%，实验表明，双缩脲法测定血清总蛋白质的精密度可接受。
1.2.2 回收试验
1.2.2.1 样品制备:
基础样品 ：待测样品0.45mL + 蒸馏水0.15mL
回收样品1：待测样品0.45mL + 150 g/L 蛋白溶液0.05mL + 蒸馏水0.1mL
回收样品2：待测样品0.45mL + 150 g/L 蛋白溶液0.1mL + 蒸馏水0.05mL
回收样品3：待测样品0.45mL + 150 g/L 蛋白溶液0.15mL
1.2.2.2 取10支试管，分别标记空白管1支，标准管1支，样品管8支，样品管每个样品做2管，取平均值，按表3添加试剂。
表3 添加试剂
混匀后37℃水浴10分钟或室温放置30分钟，540nm波长比色，空白管调零。
1.2.2.3 结果记录和处理
加入浓度(g/L) =150×(回收样品中加入的150 蛋白溶液体积/0.6)
回收浓度=回收样品测得浓度-基础样品测得浓度
回收率=(回收浓度/加入浓度) ×100%
表4 蛋白质测定的回收试验结果（g/l）
1.2.2.4 讨论评价
一般要求回收率在95%-105%，最理想的回收率为100%，本实验测得的平均回收率为105%，在参考范围95%-105%内。实验结果显示回收样品1的回收率>回收样品2>回收样品3，符合回收率越接近100%，分析物在纯溶液或复杂的基质检测环境中反应能力越强，受基质影响越小，反之受基质影响越大的原理。实验表明随着150 g/L 蛋白溶液加入量的增多，待测样品的回收程度越差，影响待测样品的准确测定。因此，为了提高测定结果的准确性，尽可能减少待测样品中干扰物的含量。
1.2.3 线性范围评价试验
1.2.3.1 样品制备（采用稀释法制备）
检测样品1：150 g/L 蛋白溶液1mL
检测样品2：125 g/L 蛋白溶液1mL
检测样品3：100 g/L 蛋白溶液1mL
检测样品4： 75 g/L 蛋白溶液1mL
检测样品5： 50 g/L 蛋白溶液1mL
检测样品6： 25 g/L 蛋白溶液1mL
检测样品7： 5 g/L 蛋白溶液1mL
检测样品8： 1 g/L 蛋白溶液1mL
1.2.3.2 取17支试管，分别标记空白管1支，样品管16支，8个样品每个做2管，取平均值，按照表5添加试剂。
表5 添加试剂
匀后37℃水浴10分钟或室温放置30分钟，540nm波长比色，空白管调零。
1.2.3.3 结果记录和处理
表6 双缩尿法线性评价试验
图1 双缩尿法线性评价试验
1.2.3.4 讨论评价
建立回归方程y=0.002x-0.001，R2=0.9980，从剂量反应曲线结果来看，R2=0.998大于0.995，线性关系是比较好的。理想的情况是该方法的线性范围的上限应能使95%的临床标本不经过稀释均能得到正确的测定结果。实验表明该方法能满足分析范围和临床可报告范围的要求。
2 总结讨论
本文介绍双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价，经过配制双缩脲试剂，并用所配制的双缩脲试剂和标准血清蛋白进行批内重复性试验、回收试验、线性范围测定。在批内试验中，变异系数CV%为2.36%<2.5%,则认为该方法的精密度可接受。在回收试验中，一般要求回收率在95%-105%，本试验测得的平均回收率为105%。虽然测得的结果准确度不是很高，但也在可接受的范围内，另外，回收管设置三种浓度为的是测定高、中、低不不同浓度的回收率。在线性范围测定试验中，本实验测得的R2=0.998大于0.995，线性关系比较好，理想的情况是该方法的线性范围的上限应能使95%的临床标本不经过稀释均能得到正确的测定结果。实验表明该方法能满足分析范围和临床可报告范围的要求。
如果能排除个人操作误差的因素，在严格规范操作下，双缩脲法测定血清总蛋白的精密度高，准确度以及线性范围较好，总的来说，双缩脲法测定血总清蛋白的方法性能较高。
参考文献
[1] 赵玉柱.菲林试剂与双缩脲试剂的比较[J].生物学通报,2011,46(7):15-16.
[2]叶应妩,王毓三.全国临床检验操作规程[M].3版.南京:东南大学出版社,2006:266-271.