生物技术实验心得体会

基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得 、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。

可概括为∶分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。

一. 目的基因的获得

目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源, 不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选

PCR方法

PCR 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。

化学合成法制备基因片段

采用DNA合成仪，对目的基因进行分段合成，然后进行连接，可以得到所需的目的基因。

二、 重组质粒的构建

DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下，连接到合适的载体DNA上，以便下一步转化之用。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲

系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。连接反应的温度在37℃时

有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12～16℃，连接12～16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

三、重组分子的扩增和鉴定

重组DNA分子导入受体细胞

目的基因和载体在体外连接形成重组DNA分子后，需要被导入受体细胞中才能进行增殖和（或）表达。受体细胞是重组基因增殖的场所，所以对受体细胞也应具有几点要求：①容易接纳重组DNA分子；②对载体的复制扩增无严格限制；③不存在特异的能降解外源DNA的内切酶体；④不对外源DNA进行修饰。一般将重组DNA分子导入原核细胞的过程称为转化，而导入真核细胞的过程称为转染。将重组DNA分子和感受态大肠杆菌细胞相混合，使重组DNA分子进入大肠杆菌中，就可以实现重组DNA分子的转化。

重组DNA分子的鉴定

重组DNA分子导入受体细胞后是否得到扩增，扩增后的重组DNA分子是否正确，导入的重组DNA分子是否含有正确的插入片段，重组DNA分子能否表达插入的目的基因，一般可以采用X-gal筛选的方法对重组DNA分子进行鉴定。

四、实验中的注意事项

1、大肠杆菌液体培养基和固体筛选培养基制备：

1) 接种过程中，试管或三角瓶口等，也可通过火焰灼烧灭菌。

2) 培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热灭菌。

3) 在加热过程中应不断搅拌，以防琼脂粉沉淀糊底烧焦，并应控制火力，以免培养基起泡而溢出容器。

4) 注意培养基分装时避免其沾污三角瓶口、试管口。

5) 严格按照高压蒸汽灭菌的灭菌指标（温度、压力、时间）对培养基、器皿灭菌，确保灭菌彻底。

2、大肠杆菌工程菌平板培养：

1) 划线分离时，挑菌量要小，严格无菌操作，避免环境中的杂菌污染。

2) 画线时接中环圈内不能有菌膜产生，会造成接种数过多，结果不明显。

3、PCR扩增目的基因片段：

1) PCR体系所加成分的实际用量，应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的贮备液浓度进行核算。

2) 加样时要认真,吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。

3) Taq聚合酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深，酶量不能过多。

4、回收目的基因与载体连接：

1) 注意调转速

2) 敞开管盖放置

3) 向吸附膜中间位置悬空滴加30ul洗脱缓冲液TE（洗脱缓冲液TE需使用前60℃水浴预热）

4) 盖好管盖，静置10min

5、大肠杆菌液体培养:

1) 接种环节应严格进行无菌操作。

2) 实验中要注意细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞。密度过高或不足均会使转化率下降。菌体密度与震荡培养的转速密切相关，根据测定的菌液OD值调整培养时间。

3) 接种的试管、三角瓶等应做好标记，注明菌种、日期、组别、姓名等。

6、大肠杆菌感受态细胞制备及转化:

1) 所有操作均应在无菌条件和冰上进行。

2) 所使用的器皿必须经过灭菌。并且要防止迹量的去污剂或其它化学物质、杂菌、DNA酶或杂DNA所污染，否则会大大降低细菌的转化效率。

3) 注意转化的质粒 DNA 的质量和浓度。当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。

4) 实验所用的溶液最好用3次蒸馏水配制。

7、筛选重组转化菌落:

1) 在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。不是一开始就4℃，是等菌长出来之后。一般菌长出来就会有蓝色的了，4℃之后会进一步显色。

2) 当出现蓝斑较大，白斑很小附在周围，还有蓝白镶嵌的斑即卫星菌落的时候，可以小心挑取中间的那个菌落，有可能是阳性克隆。

3) 要注意培养时间不宜过长，出现阳性菌落就及时处理，以12-16小时为宜。 4) 培养基中加抗生素的时候，温度不能高了，不烫手为宜，防止抗生素失效。

8、菌液PCR分析:

注意移液枪正确的使用方法，各种量程的调试，一般以接近最大量程的为准。

9、取大肠杆菌重组质粒DNA和酶切分析

1) 《质粒小量提取试剂盒》进行质粒的提取的第三步和第四步之间的时间，操作要流畅快速，决定了实验成败

2) 禁止吸出沉淀

五、总结

在分子生物学中，基因克隆是一种常用的技术。其中关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。

基因工程是把双刃剑。如果不加节制的使用基因工程，让它去为你包治百病，那样你的整体免疫系统也将发生错乱，让你完全可以抵挡的疾病访问造成你的死亡。如果人们想造什么动物就造什么动物，让这些动物急速的泛滥，动物的天敌关系，人类的生态平衡都将被破坏，动物也将超过人类，霸占我们赖以生存的地球。而且，若是谁都想起死回生，我想终有一天我们将因为人口泛滥而灭亡。

基因工程知识一种让科技发展的手段，而不是我们的目的，我们要遵循自然规律，正确的对待基因工程，正确的对待生活。

第二篇：生物实验心得体会

实验心得体会

在真正投入到创新实验计划当中之前，我以为不会很难。因为课内实验我们也做了很多，只要做好预习工作，好好听老师的讲解，再加上自己多动脑筋，几乎没遇上什么比较大的困难，实验完成起来也比较快。各种各样的实验加起来，涉及的知识面很广，学到了很多，让自己对于这样的研究与实验工作也更加感兴趣。

但是真正开始创新实验计划时，发现我仿佛进入了一个新的空间。一切要从头学起，从最简单的做起。与高年级的学长比起来，自己的基本实验技能与专业知识少的可怜，面对那些精密的仪器与无数的文献资料，信心一下子被浇熄了大半。每天跟在学长后面做着清洗瓶子，到扫卫生，摘桑叶，诸如此类的体力活。貌似什么也学不到，看着学长学姐一言不发的熟练操作，却一点也摸不到头脑。 有时真的懊恼的有些想泄气，但幸亏老师常常与我们开会讨论，开导鼓励我们，他还时常有意无意地启发我们的安全防范意识。古语说的没错:耳濡目染。一天天下来，不知不觉当中，我们的实验技巧越来越熟练，对于一些仪器的基本操作也能单独上手，学长学姐很有耐心地一次次纠正我们犯下的或大或小的错误，并不厌其烦的叮嘱我们注意安全。

渐渐地我们可以单独完成一些比较系统全面的实验工作。但错误当然也是不可避免的，而且人往往要犯错之后才能明白如何不犯错和为什么不要犯下这样的错误。比如因为我们某一步的实验操作不规范，导致最后的实验结果不尽入人意，无法纳入最后的总结分析中，也就是说我们白忙活一场。其实这样的失败也未尝不是一件好事，通过它我们更加清晰地认识到这个实验步骤的原理、影响及具体细节。

重复这是整个实验过程中常做的一件事，面对规律性不强的实验结果，我们只有一次次反思，重新再来，如果一而再再而三的重复失败，我们就只得求助于学长学姐和老师们了，但是这样具体的操作细节中失误，非当事人又是无法完全了解的，还是需要我们自己一点一点的去摸索。

当然整个实验过程中最困难的还要数自行设计实验的具体步骤了，老师所能给的知识一个全面概括的指导意见，让我们不致发生方向性的失误。老师也给了我们一些相关的文献资料，但同样的道理，具体到某一方面我们还是要自己去搜索，筛选，概括。有时甚至要面对一些英文文献，仅凭我们已有的英文水平还过于单薄。困难就是让人来解决的。我们摸索前进，自己跑到机房查资料，下载翻译软件，制定实验方案，阅读大量晦涩难懂的文献，失败了就再来一次，总结后再勇往直前。困难一个接着一个，但既然选择了这条路，我们就要毅然决然的走下去，不管后面的路是沼泽泥泞还是荆棘丛生。

终于我们的实验数据慢慢变得有规律起来，面对棘手的麻烦我们也能镇定自若，实验的因素探索一个个完成，一点点接近于目标。回望之前，发现与取得的成绩，获得的知识相比，以前都算不了什么。

不得不承认，通过这项本科实践创新训练项目，我们学到了很多，得到了很多，有些是书本上永远也学不来的，有些仅靠我们自己摸索几乎为不可能的，有些仅凭我们自行监督是无法坚持下来的。

在这里要感谢关心爱护我们的老师，学长学姐还有同届同学以及学弟学妹，没有你们我们无法完成这项艰巨的工作。

实验一 :本次试验中对交换机的基本配置的学习研究有了新的体会，在计算机上配置交换机的基本配置，掌握交换机命令行各种操作模式的区别，以及模式之间的切换。实现上有了一定的突破，在配置过程中用到的命令，让我感觉到英语也要多学习，尤其是专业英语，对配交换机有很大方便！

实验二：这次实验关于交换机的全局配置，通过交换机的全局的基本配置，让我充分明白配置交换机的设备名称和配置交换机的描述信息必须在全局配置模式下执行。Hostname配置交换机的设备名称。当用户登录交换机时，你可能需要告诉用户一些必要的信息。你可以通过设置标题来达到这个目的。你可以创建两种类型的标题：每日通知和登录标题。Banner motd配置交换机每日提示信息motd message of the day。Banner login配置交换机登录提示信息，位于每日提示信息之后。

实验三：做实验既能加深我们对实验原理的理解和认识，学会应用这些原理，又能煅炼我的动手能力，通过这次实验让我明白对于网络，我们要树立重视实践更甚于重视理论的观点！业余时间扩宽计算机网络硬件方面的视野，尤其希望可以去电信公司的机房参观学习，提高个人修养与能力；加强本实验小组内部各成员之间的交流，现在的团队合作精神很重要，要及早的去培养。

实验四：这次实验总体来说没什么困难，都是一些基本的交换机配置，但是最后的思考题中提出一些问题还是很有意思的，配置起来也很有趣。主要是查看交换机的系统和配置信息。主要要到的技术原理是查看交换机的系统和配置信息命令要在特权模式下执行。Showversion查看交换机的版本信息，可以查看到交换机的硬件版本信息和软件版本信息，用于进行交换操作系统升级时的依据。Show mac-address-table查看交换机当前的MAC地址表信息。Show running-config查看交换机当前生效的配置信息。

实验五：通过这次实验，让我明白了一个道理磨刀不误砍柴工。前期的知识储备、文献储备、材料准备、方法准备可以避免手忙脚乱，充分的预实验使你充满信心。一步一个脚印，就不必“从头再来”。最不能容忍的是在开始的几步偷懒，造成后面总有一些无法排除的障碍。这次实验让我学会了VLAN（Virtual Local Area Network，虚拟局域网）是指在一个物理网段内，进行逻辑的划分，划分成若干个虚拟局域网。VLAN最大的特性是不受物理位置的限制，可以进行灵活的划分。

实验六：这次实验总体来说没什么困难，都是一些基本的交换机和Vlan配置，但是最后的思考题中提出一些问题还是很有意思的，配置起来也很有趣。让我明白了千万不能把时间全部消耗在实验台上。看文献、看书、看别人的操作、听别人的经验、研究别人的思路，边做边思考。要学会比较，不要盲从。否则，会被一些小小的问题困扰许久。要想让自己知识更加的丰富，只有让自己的理论与实践相应的结合起来；才会学到更加丰厚的知识和地道的经验！

实验七：通过这次实验，让我体会到对于网络，我们要树立重视实践更甚于重视理论的观点，做实验既能加深我们对实验原理的理解和认识，学会应用这些原理，又能煅炼我的动手能力，人总是有一点虚荣心的。只把成功的步骤或漂亮的结果记到实验记录里，是很多人的做法。殊不知，许多宝贵经验和意外发现就这样与你擦肩而过。客观、真实、详尽的记录是一笔宝贵的财富。

实验八：计算机网络的实验在做了几周后终于把交换机有关的实验的全部做好了！个人感觉通过这几次实验，自己在计算机网络方面有了很多的了解，对计算机网络也有了更多的兴趣！让我明白了英语也要多学习，尤其是专业英语，对配置路由，交换机有很大方便，根据需要加深网络编程语言的学习；多看看<网络工程师>方面的书,对了解网络有很大帮助.对于网络，我们要树立重视实践更甚于重视理论的观点！

实验九：本次试验中对路由器命令行各种操作模式学习研究有了新的体会，在计算机上配置路由器命令行各种操作模式，掌握路由器命令行各种操作模式的区别，以及模式之间的切换。实现上有了一定的突破，在配置过程中用到的命令，让我感觉到英语也要多学习，尤其是专业英语，对配交换机有很大方便！

实验十：这次实验关于路由器端口的基本配置，通过路由器端口的基本配置，让我充分明白

锐捷路由器接口Fastethernet接口默认情况下是10M/100M自适应端口，双工模式也为自适应，并且在默认情况下路由器物理端口处于关闭状态。路由器提供广域网接口（serial高速同步串口），使用V.35线缆连接广域网接口链路。在广域网连接时一端为DCE（数据通信设备），一端为DTE（数据终端设备）。要求必须在DCE端配置时钟频率（clock rate）才能保证链路的连通。在路由器的物理端口可以灵活配置带宽，但最大值为该端口的实际物理带宽。

实验十一：通过查看路由器的系统和配置信息实验，加深我们对实验原理的理解和认识，学会应用这些原理，又能煅炼我的动手能力，通过这次实验让我明白对于网络，我们要树立重视实践更甚于重视理论的观点！业余时间扩宽计算机网络硬件方面的视野，尤其希望可以去电信公司的机房参观学习，提高个人修养与能力；加强本实验小组内部各成员之间的交流，现在的团队合作精神很重要，要及早的去培养。

实验十二：通过这次实验，让我明白做过实验的人都经历过失败和挫折。有些失败应当在预实验阶段发生，你这时能坦然接受。假如不做预实验，在正式的实验中遇到，你的挫折感就很明显。假如你因为赶时间而误操作，你会沮丧。假如你能因为目前心浮气燥而果断地放一放，就可以避免悲剧的发生。假如你早上进入实验室之前还不知道今天要干什么，你最好想好了再去。最大的错误是重复犯同样的错误。记住，屡教不改者不适合做实验，要想让自己知识更加的丰富，只有让自己的理论与实践相应的结合起来；才会学到更加丰厚的知识和地道的经验！