临床诊断中的FISH检测
FISH(即荧光原位杂交)技术作为分子诊断的重要工具,在科研和临床诊断领域都有着广泛的应用。FISH检测是利用荧光基团标记DNA探针,再将标记的DNA探针与样本DNA进行原位杂交,最后在荧光显微镜下对荧光信号进行计数,以此作为诊断的依据。FISH的操作简便快捷,结果直观准确,因此FISH成了许多疾病诊断的首选工具。下面我们将从探针的设计,样本的制备,原位杂交和检测结果的观察等几个方面简单介绍FISH的操作。
探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键。FISH检测的准确性来源于探针的设计。FISH能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的探针。用于FISH检测的探针必须具备很高的特异性,能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片断。而且FISH的探针必须能经受原位杂交的处理而不变性。荧光基团的标记也直接影响了检测的灵敏度和原位杂交结果的检测方式。以著名的探针生产商Vysis公司的LSI系列探针为例:LSI系列探针来源于BAC大片断基因组文库,探针所覆盖的染色体片断总长可达100Kb-400Kb,保证了探针的高特异性和极强的荧光信号;荧光基团采用直接标记法标记,不同波长的荧光基团使探针在荧光显微镜下呈现多种荧光信号,借此我们可以一次检测多个染色体或基因的异常;由于探针具有极强的荧光信号因而对FISH结果的检测也采用直接检测法,即在荧光显微镜下直接观察FISH的信号,而无需抗原-抗体反应对荧光信号进行放大。Vysis探针的设计既确保了探针的特异性和灵敏度,同时直接的镜检也使FISH检测更简便。
FISH检测对被测样本没有特殊的要求。可以是来自骨髓的细胞,也可以是来自羊水的细胞;可以是冰冻切片的样本,也可以是经过石蜡包埋的样本。甚至可以利用尿液样本进行膀胱癌复发的预后。获取的样本细胞也无需经过培养扩增,FISH检测可以显示单个细胞核内染色体的异常情况。
我们以Vysis公司的AneuVysion多色DNA探针试剂盒为例,简要介绍FISH的原位杂交过程。AneuVysion多色DNA探针试剂盒用于羊水细胞的产前诊断,样本是来源于羊水的细胞。试剂盒通过两组5种探针(LSI13/21和CEP18/X/Y)同时检测5个染色体的数目异常,以此为依据进行产前诊断。
样本的制备
1. 1000转/分离心羊水(AF)5分钟。羊水应没有血色或褐色。
2. 用2-5ml的1×胰酶/EDTA溶液(0.05%胰酶,0.53MEDTA4Na的Hank氏平衡盐溶液,不含CaCl2、MgCl2.6H2O、MgSO4.7H2O)悬浮沉淀,37℃水浴15分钟以上
3. 1000转/分离心5分钟
4. 用2-5ml的0.56%KCl溶液悬浮细胞,37℃水浴20分钟。这些处理步骤的目的是使羊水细胞成为悬浮的单细胞。
5. 加0.8-2ml的固定液(3∶1甲醇∶冰醋酸)至细胞低渗液中,轻轻混匀
6. 1000转/分离心悬液5分钟,用1ml新的固定液重新悬浮细胞。4℃保存固定的样本30分钟以上,直至FISH检测前。若要长期保存,-20℃保存在固定液中
7. 制片前根据悬浮细胞数调整悬液的体积。若储存时间超过一个月以上,在制片前用固定液清洗细胞
8. 直接滴加细胞悬液至1-2片预冷的玻片上,每片2个杂交区(每个区域15-25霯细胞悬液) 样本的老化(目的是为了使FISH达到最佳效果)
1. 将样本片子放入2×SSC 37℃1小时
2. 将片子放入新制的胃蛋白酶工作液中(20ul 10%胃蛋白酶溶液中加入40ml0.01NHCl)37℃13分钟
3. 用磷酸盐平衡液(PBS)室温下清洗5分钟
4. 将片子放入快速固定液(0.95%甲醛:1ml的37%甲醛,0.18gMgCl2和39ml的PBS,4℃保存,一个月内使用)室温5分钟
5. 在室温下用PBS清洗5分钟
6. 晾干片子。为了加速晾干可以用带棉塞的巴氏移液管吹打玻片
7. 将片子浸泡在70%的乙醇中。用乙醇冲洗1分钟
8. 从70%乙醇中取出,依次放入85%、100%乙醇中重复以上步骤
9. 根据需要降解片子
样本DNA的变性
1. 片子的制作前将湿润的杂交盒(盒的边缘用1×3英寸的杂交膜或杂交纸密封)放入37℃孵箱内预热至37℃
2. 在科普林氏染色缸中加入变性溶液,73±1℃水浴30分钟以上。使用前测量温度。
3. 每次使用前测定变性溶液的PH值,确保在7.0-8.0之间。将样本片子浸泡入73±1℃变性溶液中5分钟降解样本的DNA。每个染色缸中的片子不能超过4张。
4. 用镊子拿出片子立刻放入室温的70%乙醇洗液中,漂洗片子除去甲酰胺。片子放入乙醇溶液中一分钟
5. 从70%的乙醇中拿出片子,依次放入85%、100%乙醇中重复上述步骤
6. 用吸水纸从玻片的底部吸去多余的乙醇,并抹干片子的外缘
在加入探针溶液前将片子加热至45-50℃2分钟(不得超过)
注意:假如在探针准备杂交前,片子的闲置会超过2分钟,请将片子放入盛有100%乙醇的染色缸中保存。在预热前不要让片子干燥
探针的预备
1. 让探针加热至室温,降低探针的粘度,使用合适的移液管
2. 振荡混合。用微型离心机将内容物离心(1-3秒)至底部。轻轻振荡再次混匀
3. 注意:该探针已经经过变性可直接与样本片子反应。若探针是非降解型,需进行73℃5分钟的变性 杂交
1. 在片子上,将10ul的CEP18/X/Y混合探针加到一个反应区,将10斓腖LSI13/21混合探针加至另一个反应区。将22mm×22mm的盖玻片立刻覆盖反应区,使探针溶液弥漫整个覆盖区。气泡会干扰杂交,因此必须排除气泡
注意:在盖玻片覆盖前,不能在多目标区加探针溶液;盖玻片应37℃预热
2. 用树胶封片:用5ml的注射器吸去树胶,在盖玻片的四周加上树胶
3. 将封好的片子放入37℃预热的杂交盒中,盖紧盖子,37℃孵育6-24小时
杂交后的冲洗
1. 在科普林染色缸中加入0.4×SSC/0.3%NP-40。将染色缸放入73±1℃的水浴中半小时以上,使0.4×SSC/0.3%NP-40溶液的温度达到73±1℃。每批使用前都必须确保0.4×SSC/0.3%NP-40溶液的温度达到73±1℃
2. 在科普林染色缸中加入2×SSC/0.1%NP-40,放置至室温。两种洗液使用过一天后就应丢弃
3. 挪去树胶和盖玻片,将片子立即放入73±1℃装有0.4×SSC/0.3%NP-40的科普林染色缸中,漂洗3秒左右。其他片子同样操作,然后孵育2分钟。不要同时操作4片以上。假如操作4片以上,取保0.4×SSC/0.3%NP-40的温度在73±1℃
注意:在洗浴前不能揭去盖玻片。当最后一片进入洗液后,开始计时2分钟
4. 将片子放入装有2×SSC/0.1%NP-40的科普林染色缸中室温放置5-60秒,漂洗1-3秒
5. 在暗处风干(一个关上的抽屉或是柜子就可以满足要求)
6. 加入10霯DAPIⅡ复染,盖上盖玻片。暗处避光保存
储存
在暗处-20℃保存杂交玻片。玻片在上述的条件下可以保存超过12个月而不影响荧光信号的强度。为了长期保存还可以用盖玻片密封防止干燥。片子存放于-20℃下
FISH结果的观察
在荧光显微镜下观察时,应先对片子的适用性进行评估。评估的标准如下:
? 探针信号的强度:信号应该明亮、清晰和容易分辨。信号是明亮紧凑的卵圆形或纤维状,弥散的卵圆形 ? 背景:背景应该是黑色,没有粒状或是朦胧的荧光
? 交叉杂交/目标特异性:探针应该特异性地只和目标DNA结合。
假如出现上述任何一种达不到标准,应重新进行杂交。
选择最好的视野区,计数细胞核
用25倍物镜观察杂交区样本的分布。选择样本分布稀疏的区域,在此区域内没有间期核或中期扩展的重叠,可以观察到部分的间期核。避免选择细胞密集、重叠或核的边界模糊无法辨认的视野。避免视野下出现成团的细胞。只计数信号不连续的细胞。
计数扫描:
用40倍或63倍的物镜,从选择区域的左上开始计数,从左往右,计数中期扩展和间期核边缘的信号数。依据荧光信号的计数结果,结合染色体计数标准作出正确的诊断。
注意:以上介绍的步骤由Gene公司提供,仅供参考,具体的操作以产品说明书为准
为了进一步简化操作,Vysis公司还推出FISH杂交仪和自动预处理系统,配合AI公司的染色体扫描计数系统,更能使FISH检测和分析实现自动化,大大节省了研究者的时间和精力。
FISH检测的操作简便,但是这并不意味着随便。相反,FISH对检测的条件要求很高。检测过程中的温度、试剂的酸碱度,反应的时间都会对结果产生影响。因此在操作中应注意:
? 杂交前样本的老化相当重要,尤其是胃蛋白酶的浓度、消化的时间掌握不好,直接影响杂交的效果。若消化过度,细胞出现“鬼影”或整个组织消失成为废片;若消化不足,则显示持续的自发荧光或者差的DAPI染色
? 操作过程中的温度控制应严格按照产品说明书,而且在反应前把液体预温到所要求的温度,检测中所使用的设备例如盖玻片、载玻片都应注意预热
? 各步骤时间应准确,每次操作都要迅速
? 为防止淬灭,杂交后的洗脱和晾干要注意避光。可以加入抗淬灭剂
? 此种片在-20℃避光保存1周。若要长期保存,应加入抗淬灭剂
只有细心的操作,FISH才能真正成为准确而简便的诊断工具。
第二篇:荧光原位杂交技术(FISH)技术在疾病分型诊断中的应用
荧光原位杂交技术(FISH)技术在疾病分型诊断中的应用.txt铁饭碗的真实含义不是在一个地方吃一辈子饭,而是一辈子到哪儿都有饭吃。就算是一坨屎,也有遇见屎壳郎的那天。所以你大可不必为今天的自己有太多担忧。荧光原位杂交技术(FISH)技术在疾病分型诊断中的应用
生命科学的发展,生物技术的进步使我们对疾病本质的认识不断地深入,也使我们拥有更多新的治疗方法和药物应对疾病的威胁。如何准确有效地利用这些新的治疗方法和药物治愈疾病是我们迫切需要研究的内容。如何对疾病进行正确的分型和诊断却是上述工作的基础。只有全面地把握病情,并在此基础上进行准确的判断和分析,才能为病患制定及时有效的治疗方案。因此我们要求疾病的诊断工作能提供更为准确和及时的结果。而古老的“望、闻、问、切”和传统的常规手段已远远无法满足我们对疾病诊断的要求,迫切需要将新的技术引入疾病诊断领域。
荧光原位杂交技术(Florescence In-Situ Hybridization简称FISH)是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性,荧光信号的直观性和原位杂交的高准确性结合起来,通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交,在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数,从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断,为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。自20世纪80年代末,Pinkel和Heiles将FISH技术引入染色体检测领域后,FISH技术就在临床诊断及科研工作中得到了广泛的运用,显示出与一些传统技术相比的明显优势。
与传统的免疫组织化学法(IHC)相比,FISH具有良好的稳定性和可重复性。目前免疫组织化学法正广泛应用于肿瘤等多个领域的临床诊断。免疫组化的检测对象是疾病相关的蛋白。由于蛋白的表达和本身的构象受各种因素的影响很大(例如酸、碱和变性剂),检测条件的稳定性对检测结果至关重要。此外,免疫组化检测结果的判断依赖于检测者对显色结果的主观判断,对于一些弱阳性的结果,不同的检测者容易产生分歧。上述的因素都可能影响医生对病情的最终诊断。荧光原位杂交技术检测的对象是细胞中的DNA,致密的双螺旋结构使DNA可以历经千百万年而依然保持良好,其结构稳定,不易被环境条件影响,为荧光原位杂交技术的稳定提供了良好的基础。此外,荧光原位杂交结果的判定借助于对荧光的颜色判断和信号计数,客观地量化了检测地结果。如果借助于相应的FISH操作系统(例如Abbott-Vysis公司的Hybrit杂交仪和VP2000样本预处理系统)和染色体成像系统(例如AI公司的CytoVision)就能实现整个FISH操作的自动化,最大限度的降低操作者和检测者的主观因素,确保结果的准确性。
PCR由于灵敏度高,操作简便快捷是近年来应用比较多的基因诊断技术,但PCR诊断技术的假阴性和假阳性的比例较高,对同一样本也只能作一次分析,不能重复实验结果。随着探针技术的不断发展,FISH目前的灵敏度已经接近或达到PCR的水平,并能很好弥补PCR技术的局限。FISH技术不仅有极低的假阳性、假阴性的比例(以Abbott-Vysis的产前诊断探针为例,29,000例的使用结果证实正确率高达99.9%),还能对同一样本进行多次的FISH操作以及利用不同颜色的荧光探针一次检测多个染色体或基因的异常,大大节省了检测的时间。此外,通过FISH可以对染色体或特定基因的数目异常,特定片断的缺失、易位和重排进行诊断研究。
荧光原位杂交技术目前已经广泛应用在产前及植入前、肿瘤的预前和预后以及血液类疾病的诊断分型领域。
1、 荧光原位杂交技术在产前/植入前诊断中的应用。
染色体疾病是一类由染色体异常引起的遗传性疾病,目前的种类已经超过1000多种。例如21号染色体三倍体引起的Down综合症使得患者发育迟缓、智力低下,13号染色体的三倍体使患者智力严重缺陷且伴有兔唇。各种染色体疾病在人群中的爆发率相当高,仅在新生儿中,发病率就高达7.3‰,而18号染色体三倍体所引发的Edward综合症在人群中的爆发率也高达1/2000。因此,有必要在出生前对胎儿进行产前诊断,及时发现异常胎儿,并辨明胎儿所患染色体疾病的种类,从而采取相应的措施。研究表明13、18、21、X和Y染色体异常所引起的疾病占新生儿染色体疾病的85%-90%。通过上述五条染色体的分析,我们就可以对目前新生儿常见的Down、Patau、Klinefelter、Edward和Turner综合症进行分型诊断。传统的产前诊断,以羊水细胞的核型分析为主。根据羊水中期细胞染色体的形状和带型,将染色体进行配对,制成染色体图谱,以此对染色体疾病进行诊断。核型分析需要大量的中期细胞,为此在取得羊水细胞后,需要将细胞培养7-21天。漫长的等待时间既不利于及时诊断,也对被检测者造成巨大的心理压力。此外,核型分析仅能诊断染色体数目和大片断的异常,对小片断的缺失无能为力。FISH技术作为准确而快捷的分子诊断工具,在产前诊断领域的优势非常明显:对被测细胞并无特殊的要求,可以做到即取即测,整个过程仅需19个小时,利用不同颜色的荧光探针还可以同时检测多条染色体的异常。以首个通过美国FDA认证的Abbott-Vysis公司产AneuVysion多色DNA探针试剂盒为例,利用5种不同颜色的荧光探针能同时检测13、18、21、X和Y染色体的异常,一次FISH检测仅需要16个小时,对染色体异常样本的检测正确率达到99.9%,对于染色体正常样本的检测正确率达到100%。
近年来,随着体外授精(in vitro fertilization, IVF)技术,精子细胞浆内注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技术的成熟,越来越多的患不孕症的夫妇选择体外受精。但是各种药物的使用和产妇的高龄使得体外受精的胎儿获得染色体疾病的风险高于一般的胎儿。因此必须对体外受精获得的受精卵进行植入前遗传病诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)。植入前诊断的对象是体外受精获得的生殖细胞或胚胎细胞,主要有以下三种来源:极体细胞、卵裂球细胞及囊胚期细胞。目前植入前诊断主要以卵裂球细胞为对象。为了避免卵裂球细胞取材过多影响胚胎的发育,每个胚胎只能取得2个细胞进行植入前诊断,技术要求非常高。FISH技术在该领域,同样获得了良好的效果。Abbott-Vysis公司开发的MultiVysion PGT试剂盒是首个通过美国FDA认证,应用于植入前诊断的产品。该试剂盒利用带有五种不同荧光的探针,一次性检测单个卵裂球细胞染色体的正/异常。临床使用结果证明该试剂盒对异常细胞的检出率高达99.9%。随着该技术的不断成熟,已逐渐成为产前/植入前临床诊断领域的主要手段。
2、 荧光原位杂交技术在肿瘤疾病分型诊断领域的应用。
随着生命科学研究的深入,我们已经开发了许多针对肿瘤的有效药物。但是这些药物的使用依赖于对患者病情准确而及时地诊断。目前传统的肿瘤诊断手段是免疫组织化学的方法,即利用抗原-抗体的显色反应,对肿瘤相关蛋白进行检测。最终根据组织样本中蛋白显色反应的不同诊断患者的病情。由于蛋白本身的不稳定性和结果判定的主观性,致使免疫组织化学
的检测结果容易受病理以外的因素影响。例如对于乳腺癌,致病机理很多,市面上已经有一些针对与淋巴结组织中Her-2基因过表达相关的乳腺癌治疗药物,因此检测Her-2基因不仅具有一般的诊断意义,更直接影响医生的用药及整个治疗方案。面对Her-2蛋白免疫组织化学的检测结果,医生经常为弱阳性结果的判定而苦恼不已。研究表明,Her-2基因的过表达往往伴随着Her-2基因的大量扩增;而在Her-2蛋白没有过表达的组织中,不存在Her-2基因的大量扩增。于是Abbott-Vysis公司设计了PathVysion Her-2 FISH检测试剂盒,利用橘红的HER-2基因荧光信号和17号染色体的绿色荧光信号对患者的淋巴结组织石蜡样本进行检测。检测者只需计算橘红的HER-2基因荧光信号和17号染色体的绿色荧光信号数目的比值,很容易做出判断,制定合适的药物或其它治疗方案。该试剂盒的使用不但避免了传统的免疫组织化学检测中对操作者经验和技能的极高要求,还第一次将直标型探针引入了石蜡的组织样本,大大扩增了荧光原位杂交技术的应用范围。出于同样的目的,Abbott-Vysis公司为膀胱癌患者设计的UroVysion检测试剂盒,利用四种不同的探针,不但弥补了传统检测技术的缺陷,这种检测对象为尿液的非侵入性的诊断技术,不会对患者本身造成损伤,保证了膀胱癌的预前和预后诊断。此外,Abbott-Vysis公司还将荧光原位杂交引入了前列腺癌和肺癌诊断领域,不断推出新的产品。
3、 荧光原位杂交技术在白血病分型诊断领域的应用。
白血病在我国被列为十大高发性肿瘤之一,在我国的北方爆发率尤其高。白血病可分为急性/慢性粒细胞白血病和急性/慢性淋巴细胞白血病。随着研究的深入,我们逐渐发现上述白血病与染色体上特定片断的缺失、易位和重排有关。不同类型的白血病病发机理和治疗方案不尽相同。因此准确地对上述白血病进行分型诊断对于制定相应的治疗方案至关重要。由于白血病的病发涉及了染色体和基因水平的变化,常规的检测手段对此无能为力。目前该领域的主要诊断手段就是荧光原位杂交技术技术。只要设计出相应基因、染色体的探针,荧光原位杂交技术就能直观地反映染色体和基因的异常情况。例如,研究表明慢粒主要与费城染色体的产生有关。研究9号和22号染色体间易位和重排不但有助于我们了解慢粒的形成机理,而且是我们判断慢粒并制定相应的治疗方案的依据。但是目前的常规细胞生物学研究手段无法满足我们的需要,Abbott-Vysis公司的LSI BCR/ABL系列探针,利用橘红和绿色的探针,能一次性检测费城染色体的存在,并利用该系列中不同的探针设计可以直观地反映出相关染色体的断裂和重组的情况。此外,该公司还提供各种白血病、淋巴瘤诊断的探针,以及能准确反映染色体上片断易位和重排的全染色体涂抹荧光探针(WCP),反映染色体上特定片断缺失或过量扩增的LSI系列探针。利用这些工具,大大加速了这些疾病分子机制的研究。
随着FISH相关技术M-FISH、CGH等的不断发展,以及近年来微阵列技术(Microarray)的不断成熟,Abbott-Vysis公司还推出了世界上第一个染色体组芯片GenoSensor Array 300,将287个疾病相关的基因集成在一张芯片上,通过一次扫描即能检测287个疾病相关基因的正/异常,使大规模筛查基因相关疾病成为了可能。我们相信,FISH技术作为直观的基因、染色体检测技术,必将在临床的疾病诊断中发挥更大的作用。