蛋白质分离纯化及鉴定综合实验

一、实验内容

将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液

用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度；

将粗提液通过Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度；

将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。

二、实验过程：

1.蛋白质粗提液制备

溶液配制：0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液

（1）1000ml 0.1mol/L磷酸氢二纳； 磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中，定容至1L；

（2）250mL

2.蛋白质浓度测定

（1）溶液配制

1mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）标准溶液：5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中； 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，避光保存。

（2）0~100ug/mL标准曲线测定：

取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2mL

蛋白质浓度0 20 40 60 80 100 ?g/ml

1mg/mL BSA溶0

液（?l）

蒸馏水（?l）

总体积（?l） 2000 2000 40 1960 2000 80 1920 2000 120 1880 2000 160 1840 2000 200 1800 2000

测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值（OD595）：500uL蛋白质溶液与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，每个溶液3次重复测定。 以OD595值（3次重复的平均值）为X，蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线Y=aX+b，R=？。

（3）测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释100倍（2mL），取稀释液500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，以500uL蒸馏水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均值计算其浓度。

3、Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离

（1）凝胶溶胀：将固体凝胶在一定量的沸水浴中溶胀5h，溶胀后倾去上清液，加入一定量的蒸馏水搅拌，静置使凝胶下沉，倾去上清液，直至无细小颗粒为止。

（2）装柱：蒸馏水冲洗柱子，留少量蒸馏水，打开活塞，将悬浮于水中的凝胶连续灌入柱中，直至凝胶沉淀至柱的4/5体积处。

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（3）平衡：用10倍于柱床体积的0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液洗柱，是柱中的离子环境和样品中的一致。

（4）上样：柱床表面液体正好达到凝胶表面，关闭活塞，将蛋白粗提液（留过20uL供电泳用）缓慢加到凝胶表面，注意不能把凝胶冲起来

（5）收集：打开活塞，使样品流下，样品完全进入凝胶后，缓慢加入0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液（注意不能把凝胶冲起来）使样品继续流出，分部收集流出物，第一管收集1mL，以后每管收集200uL，共收集6管。

（6）稀释20倍，测定每个组分的蛋白浓度，可只测定一个OD595值，计算各组分的蛋白浓度。

4.SDS—PAGE

溶液配制：

100ml 30%凝胶储液（arc/bis）：29.2g丙烯酰胺和0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于80ml蒸馏水中，定容至100ml，避光保存。（该溶液有神经毒性，避免接触皮肤）； 100mL 1.5M Tris-HCl 三（羟甲基）氨基甲烷，pH8.8：18.15gTris 碱溶于60mL蒸馏水中，用HCl调pH至8.8，定容至100ml蒸馏水中；

100ml 0.5M Tris-HCl（缓冲液）,pH6.8：6gTris 碱溶于60ml蒸馏水中，用HCl

调pH值至6.8，定容至100ml蒸馏水中；

10ml上样缓冲液：0.5ml ddH2O（重蒸水，经过两次蒸馏的水） + 2.5ml of 0.5M Tris-HCl, pH6.8 + 2ml 甘油 + 4ml 10% SDS（十二烷基硫酸钠）+77.1mg DTT（二硫苏糖醇）+1ml 0.05（W/V）溴酚蓝；

600ml ：9g Tris碱+43.2g甘氨酸+3gSDS，蒸馏水溶解定容至600ml；

1ml 10%过硫酸铵溶液（现用现配）：0.1g过硫酸铵溶于1ml蒸馏水中。 1000ml固定液：取908ml 50%的甲醇和92ml冰乙酸混匀； 500ml染色液：0.25g考马斯亮蓝，加500ml固定液溶解，过滤后避光保存；

1000ml脱色液：取75ml冰乙酸和50ml甲醇，加蒸馏水定容至1000ml。 凝胶制备

7.5%分离胶（20ml）

10%SDS 0.2ml

ddH2O 11.87ml

10%的AP（过硫酸铵溶液） 0.1ml

TEMED（.四甲基乙二胺） 10?l

30% arc/bis 5ml

1.5M pH8.8 Tris-HCl 2.5ml

4%浓缩胶（10ml）

ddH2O 6ml

30% arc/bis 1.3ml

0.5MpH6.8Tris-HCl 2.5ml

2

10%SDS 0.1ml

10%的AP 0.05ml

TEMED 5?l

灌胶：将电泳板组装好，先灌分离胶至2/3处，水封，分离胶凝固后，吸去水，

灌入浓缩胶至满，插入梳子，注意不要产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子。 样品准备：

分子量Marker、100?g粗提液、100?g分离组分与样品缓冲液混合（哪种，混合比例），煮沸3min，作为电泳样品上样。 电泳装置安装：安好后在正负极分别加入稀释好的电极缓冲液。

上样：将处理好的样品分别加入样品孔中，记好加样顺序。

电泳：接好电泳仪，通电，先恒压80V电泳，溴酚蓝前沿到达分离胶界面时，

加大电压至120V继续电泳，直到溴酚蓝前沿到达凝胶底部，结束电泳。 剥胶：拆开电泳装置，取出玻璃板，看清点样方向，从玻璃板的一角撬起，凝

胶留在长板上，在右下角切角作标记，用固定液冲下凝胶。

固定：将凝胶放在大培养皿中，用固定液固定1h；

染色：倒去固定液，加入染色液，染色1h，

脱色：倒去染色液，加入脱色液进行脱色，直至看清条带。

凝胶拍照。

三、实验结果

1、

2、 各组分蛋白浓度 电泳结果

四、 分析讨论

分离效果如何？实验设计如何改进？

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第二篇：蛋白质的分离纯化与分析鉴定

蛋白质的分离纯化与分析鉴定

摘要：蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点。根据蛋白质的酸碱性质、分子大小与形状、溶解性质及其与配体亲和性等,对其分离纯化和分析鉴定方法进行了综述。分离纯化某一特定蛋白质的一般方法包括前处理、粗分级分离、细分级分离和纯度鉴定四步，本文重点介绍讨论了步骤三中的几种主要方法。 关键词：蛋白质，分离，纯化，鉴定

一、引言

生物体内的大部分生命活动如催化代谢反应、物质运转、运动的相互协调、兴奋的传导、生长与发育等，均是在蛋白质的参与下完成的。因此,研究蛋白质对了解生命规律、指导工业生产、医药实践有着重大意义,而蛋白质的分离纯化是蛋白质研究中必不可少的一个环节。必须要了解目的蛋白的分子量、等电点、溶解性及稳定性等基本性质才能制定出合理的分离纯化方法。由于不同的蛋白质结构和性质不同,分离方法也不同,例如根据分子大小可使用差速离心、分子筛、超滤或透析等分离技术；根据溶解度大小的不同，使用盐析、溶剂抽提、分配层析、结晶等方法分离；根据所带电荷的不同，可采用电泳、等电点沉淀、离子交换层析等方法；根据结合亲和性，可用新和层析进行分离。蛋白质的分离纯化技术种类是很多的而且发展很快某些技术如以前不多见的超滤分离方法,目前在国内应用已相当普遍，除此之外广泛使用的层析、电泳方面也不断出现新的技术和方法。如层析方面,高压液相色谱是一种具有快速和分辨力的柱层析技术。

二、正文

分离纯化某一特定蛋白质的一般方法包括前处理、粗分级分离、细分级分离和纯度鉴定四步：

一、选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的材料进行预处理。根据分离纯化的原料不同,要采取不同的方法进行预处理。例如动物材料要去掉结缔和脂肪组织；植物和细菌要将细胞壁进行破碎；植物种子的去壳除脂；微生物的菌休和发酵液要进行分离等等。破碎主要采取超声波振荡、研磨、高压挤压或酶处理等方法。组织和细胞破碎以后,选择适当的缓冲溶液将目的蛋白质提取出来,细胞碎片等不溶物质用离心或者过滤的方法除去。

二、分离纯化某一蛋白质首先要将蛋白质从原来的组织中释放出来,并且保持原有的天然状态,不丢失活性物质。常用的溶剂是稀盐酸溶液和缓冲液、某些与脂类结合牢固、或分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取。

三、用适当的方法将蛋自质从抽提液中分离出来并将所需蛋白质和其他杂蛋白分开。由于原料中蛋自质成分复杂往往含有几百种以上，因此提纯一种蛋白质通常需要多步骤完成。

四、纯度鉴定的简便方法是层析法和电泳法、检验有生物活性的蛋白质则用测定活性法。一般要用两种以上的方法相互验证,才能肯定一种蛋白质的纯度。

本文将重点讨论步骤三中的几种主要方法。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。经常与盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小，可选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤以克服这一缺点得到更理想的效果。

层析法：最常用的层析法是凝胶过滤和离子交换柱层析。凝胶过滤又叫分子筛层析，凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，比“网眼”大的蛋白质分子不能进人凝胶颗粒内部,沿着颗粒间隙流动,流程短,流速快,最先流出柱外；比“网眼”小的分子则进人凝胶粒内部,沿着孔道移动,从一个颗粒流出,又进人另一颗粒,所以下移速度慢,随后被洗脱下来。这样溶液中的物质就按不同分子量筛分开了，可用于蛋白质的脱盐、分离、提纯、分析等等。离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。利用此反应将要分离的混合物先在一定pH值的溶液中全部解离；而后流过固相使之与固相的离子进行交换，吸附于固相；再根据混合物中各组分解离度的差别，用不同pH值溶液分别洗脱下来。

等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低；相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。王洪新等研究茶叶蛋白质提取过程发现,pH值为4时茶叶蛋白提取效果最好,提取率达到36.18%,初步纯化得率为91.10%。

亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体的分子能特异而非共价地结合。?

置换色谱法：置换色谱作为一种非线性色谱技术，是指样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂通人色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进，使样品中各组分按作用力强弱的次序，形成一系列前后相邻的谱带，并在置换剂的推动下流出色谱柱。置换色谱的分离行为与样品组分和置换剂在实验条件下的吸附等湿线有直接的联系。置换色谱要求样品组分及置换剂的吸附等湿线应为Langmuir型，而且置换剂相对于被分离的各组分应有最强的吸附能力，其吸附等温线位于所有组分的吸附等温线的上方。?

电泳法：各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。电泳的类型很多，常用的是聚丙烯酞胺凝胶电泳SDS—聚丙烯酞胺凝胶电泳和等电聚焦电泳。在聚丙烯酞胺凝胶中加SDS的电泳称为SDS—聚丙烯酞胺凝胶电泳。SDS能破坏蛋白质中几乎所有的非共价键，使蛋白质变性,并且SDS和蛋白质结合成净负电荷很多的SDS—蛋白质复合物，复合物的电荷量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，同时也改变了蛋白质分子原有构象，使SDS一蛋白质复合物在电泳中的迁移率主要取决于分子量的大小而其他因素的影响可以减少到忽略不计的程度。SDS—聚丙烯酞胺凝胶电泳具有快速、灵敏、分辨率高、重复性好的优点。主要用于蛋白质的分离鉴定和分子量

测定。

等电聚焦电泳是根据蛋白质等电点的不同来分离蛋白质的电泳方法。这种电泳的特点是：在支持物凝胶中加人两性电解质，建立一个由正极到负极,pH由低到高的连续而稳定的pH梯度环境。蛋白质混合物在这种凝胶上电泳时,具有不同等电点的蛋白质就会分别带上正电荷或负电荷,向着与它们各自的等电点相当的pH环境位置,最后聚焦在此位置形成一条集中的蛋白质区带。这样,经过一段时间后,不同的蛋白质组分便被分隔在不同区域之中,各蛋白质聚焦部位的pH值即为它们的等电点。等电聚焦电泳具有分离、制备和鉴定蛋白质等多种功能，它的优点很多,如分辨率高,可将pH值之差小到0.01的蛋白质分开；能抵销扩散作用,使区带越走越窄；无论样品加在什么部位都可以聚焦到等电点；可以直接测出蛋白质的等电点,等等。

三、展望

蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离，提纯和鉴定是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，往往采取几种方法联合使用。如将等电聚焦电泳与SDS—聚丙烯酞胺凝胶电泳结合起来则可达到极高分辨率的分离效果。

理想的蛋白质分离提纯方法,要求产品纯度和总回收率越高越好,但实际上两者难以兼顾,因此,考虑分离提纯的条件和方法时,不得不在两者之间作适当的选择;一般情况下,科研上更多地选择前者,工业生产上更多地选择后者。每当需要提纯某种蛋白质时首先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质,以便选择最佳的分离纯化方法,从而得到理想的效果。

蛋白质提纯鉴定技术的发展将不断促进对蛋白质性质的研究,同时对蛋白质性质的研究也将反过来提高蛋白质分离纯化和分析鉴定技术,两者的互相促进终将会对生命科学的进步作出重大贡献。

参考文献：

1、Lubert Stryer;生物化学;北京大学出版社

2、沈同等;生物化学;人民教育出版社

3、王洪新,胡昌云;茶叶蛋白质提取及初步纯化研究[J];食品工业科技;2004:69-71

4、许亚军,林俊岳;蛋白质提纯研究进展[J];天津化工,2006:9-12

5、夏其昌等;蛋白质和多肤分离分析技术的一些新进展；生命的化学