双缩脲法测定小麦面粉中蛋白质的含量

实验八 双缩脲法测定面粉中蛋白质的含量

一、目的要求

1．学习双缩脲法的基本原理及操作。 2．通过实验学会制作标准曲线。 二、实验原理：

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。在一定的浓度范围内，紫色络合物颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系（即：颜色的深浅与蛋白质浓度成正比）而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可在540nm处比色用来测定蛋白质含量。测定范围为1－10mg蛋白质/ml。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 三、操作方法：

1．标准曲线的制作。酪蛋白：10mg/ml（如果用干酪素来配制则需用0.05M NaOH做溶剂，也可以用酪蛋白酸水解物直接配制。）

管号

酪蛋白(ml) 蒸馏水(ml) 双缩脲试剂(ml) 1 0 2 3

A540 0

计算出各管浓度（计算出各管浓度，再做标准曲线，那么最后计算的公式中就不用除以6了，这么做好理解些。）

混匀，放置30分钟后，在540nm处以1号管调0点，测定各管吸光度，以吸光度（OD值）为纵坐标，蛋白质浓度（酪蛋白的毫克数）为横坐标绘制

2 3

0.4 0.8 1.6 1.2 3 3

混匀，放置30分钟

4

1.2 0.8 3 5 1.6 0.4 3 6 2 0 3

双缩脲法测定小麦面粉中蛋白质的含量

标准曲线。

四、样品处理

1．0.25g小麦面粉＋0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂（四氯化碳为有机溶剂，在这里作为分散剂，使面粉不成团。）；

2．加塞，在摇床上振摇30分钟，使之充分混匀、反应，然后于实验台上静置10分钟；

3．离心，4000rPm，离心15分钟；

4．取上清比色：OD 540 nm；（在用滴管取上清时要轻、缓，避免沉淀物上浮。对照管是以介质溶液调零，即去除样品后的溶剂，在这里为0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂。）

五、计算

OD值所对应的蛋白质毫克数×25.5/6/200 ×100％ 即面粉中酪蛋白的百分含量。

『双缩脲试剂』：取 1.5g 硫酸铜（CuSO4·5H2O)和 6.0g 酒石酸钾钠

（NaKC4H4O6·4H2O）溶于500ml蒸馏水中,搅拌加入300ml的10％NaOH（或KOH）（可另加 lg KI以防止Cu2+自动还原成一价氧化亚铜沉淀），用水稀释至l000ml。此试剂存于棕色瓶中避光可长期保，若有黑色沉淀产生需重配。

【注意事项】

标准曲线绘制和样品测定应使用同一台分光光度计。注意事项

（1）本法应用范围，因不同书籍报道，数值不一。本实验方法测定范围1—10mg蛋白质/ml。

（2）须于显色后30min内比色测定。30min后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。

（3）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生混浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。

第二篇：实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量

实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量

【实验名称】：双缩脲法测定血清蛋白质含量

室温：20°

（一）实验目的： 1.掌握双缩脲法测定蛋白质的原理。2.学习掌握分光光度计的使用。

3.掌握标准曲线的制作。4.学习分光光度法测定的原理和方法。

（二）实验原理：血清中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。

（三）实验材料与仪器：

1.仪器和材料： 分光光度计、7支试管、1毫升刻度吸管3支、移液器、坐标纸。

2.试剂：6mol/L的NaOH、双缩脲试剂、9g/L的NaCl溶液、蛋白质标准液（10g/L)、待测血清样本。

（四）实验步骤和结论:

1.取7支试管，编号，按照图1操作并记录。

表 1

2.在坐标纸上以各管蛋白质含量为横坐标，光吸收值（两管平均值）为纵坐标，绘制标准曲线。

表2

3、由标准曲线查出待测的血清样本的蛋白质浓度，由表1得出测定管的蛋白质的λ光吸收值为0.317，由表2得出测定管的蛋白质的浓度为1.4g/L

4、按照光吸收法计算公式计算，从标准管中选一管与测定管光吸收值接近者，按公式

C标A测C测?A标

计算待测血清样本的蛋白质浓度，从上可选A测 = 0.317

C标=0.354 ,A标=1.6 g/L; 则得到：C测=1.432 g/L

【注意事项】 ： 1.本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须清洁，整齐、干燥。蛋白质标准液和血清取量必须准确。

2.各管加好样后必须充分混匀。显色反应需在20到30min才完成。

3.3用分光光度计要注意：取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污；液体的体积为比色杯的2/3-3/4;不要将比色杯放在分光光度计上；试验完成后，关闭电源，洗净比色皿。

【思考题】1、蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物，这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。

3、各管加好样并充分混匀后，20到30min才能完成显色反应，所以本实验在加入双缩脲试剂20到30min左右的时间才进行比色，在显色后30min内进行显色，且各管测定时间几乎要相同。