实验十一  细菌质粒DNA的提取和纯化

一、实验目的：

通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状DNA的提取方法。

二、实验原理：

1、细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。

2、质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。

3、碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。

当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在实验室中常用。

三、实验材料：

含有PMD19质粒的大肠杆菌（E. coli.）菌液

四、实验用具和药品：

实验用具：摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL）及塞子、离心管（1.5mL）。

实验药品：

五、实验步骤：

（一）细菌繁殖

第1天晚上： 吸取含质粒的菌液2μL，转移入2mL LB（加入相应抗生素），37℃，过夜振荡（200r/min）培养。

（二）菌体收集

第2天早晨(时间:约2-3h左右)： 1、将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，5000r/min离心30sec；2、弃上清

（三）碱裂解法提取质粒DNA

1、将上述沉淀重悬于100μL冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡（须使沉淀完全分散） (葡萄糖：悬浮细胞；EDTA；抑制DNAase)

2、加入200μL溶液Ⅱ，盖紧管口，轻柔颠倒离心管5_~10次，该过程应小于5min；（NaOH：溶解细胞膜，释放DNA；SDS）                

3、加入150μL冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和地颠倒离心管5_~10次，该过程大于5min；（乙酸钾 ：和SDS 反应生成PDS（十二烷基硫酸钾），沉淀蛋白，同时体积较大的染色体DNA也一起沉淀；冰乙酸 ：中和NaOH ）

4、10000r/min离心5min；

5、上清转移到另一新1.5mL离心管中；

6、加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，室温放置2min（若沉淀不充分，可加入1/10体积3mol/L的醋酸钠）；

7、10000r/min离心5min；

9、弃上清，干燥沉淀；

9、加TE溶解沉淀，保存。

六、实验作业：

思考本实验的关键步骤是什么？

答：本实验的关键是溶液Ⅰ重悬须充分，溶液Ⅲ混合须温和。碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。

七、注意事项：

1、质粒的选取，尽量选择较小的松弛型质粒。

2、提取过程应尽量保持低温。

3、溶液II不可冷冻,现用现配，加入溶液2后不要剧烈振荡，只需轻轻颠倒几次离心管。复性时间不宜过长，一般是5分钟，否则会使染色体复性。

4、沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。

5、应用TE缓冲液溶解沉淀是为了在用苯酚、氯仿抽提时，以减少DNA的损失。

6、50%的乙醇可溶解DNA,故应该极其注意70%的乙醇是否盖子完好,否则稀释的乙醇有可能将所获得DNA溶解掉。

八、讨论与小结：

1.为什么用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。

2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

本次实验是能动性、严谨性很强的实验，因此通过这次实验，我们能把理论和实践更好的联系在一起，将将理论应用到实践，提高了自己的实验能力，同时也加深理论的理解。

要成功完成实验，必须理论知识丰富，全面了解可能导致实验失败的因素，在试验中特别注意。时刻规范操作，否则容易导致实验失败。

第二篇：实验三、质粒DNA的提取

实验三、质粒DNA的提取和电泳

一、实验目的

学习和掌握碱裂解法提取质粒；学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的方法和技术。

二、实验原理

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称

CCCDNA)；开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，（open circular DNA， 简称OCDNA）；线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质粒DNA。

三、主要试剂

1． 溶液Ⅰ

50 mmol/L 葡萄糖

25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris.HCl(pH 8.0)

10 mmol/L 乙二胺四乙酸Na（EDTA）（pH 8.0）

2． 溶液 Ⅱ

0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L NaOH 母液稀释）， 1% SDS，用前等体积混合（新鲜配制）

3． 溶液 Ⅲ

5 mol/L 乙酸钾 60 ml

冰乙酸 11.5 ml

水 28.5 ml

4. 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

5. RNaseA

将RNA酶溶于10 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成

10 mg／ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于－20℃。

7. LB+Amp培养基：LB液体培养基内加入100ug/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温

分解，待培养基温度低于60℃时加入。

8. 50 x TAE：

Tris 242g

冰乙酸 57.1ml

0.5 mol/L EDTA 100 ml

pH 8.0

9. 1%琼脂糖凝胶：

称0.3g琼脂糖，放入250 mL三角瓶内，加入30 mL 1×TAE电泳缓冲液，加热煮沸等其冷至60℃左右，倒入封好的电泳板上。

10. 10X Loading buffer

四、仪器耗材

恒温摇床、冷冻离心机、移液枪一套、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉。

五、实验步骤

（一）细菌的培养

将含有pUC19质粒的大肠杆菌，在LB+Amp100培养基平皿上划线，获得单菌落。（37℃培养过夜）

(二) 质粒提取

1. 将2 mL含Amp（100ug/mL）的LB液体培养基加入试管中，接入上述的含pUC19质

粒的大肠杆菌（单菌落），37℃振荡培养过夜。

2. 取培养物倒入1.5 mL微量离心管中，4000 r/min 离心2 min。

3. 倒出培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4. 将细菌沉淀悬浮于100 uL溶液Ⅰ中，充分振荡混匀，室温放置5-10 min。

5. 加200 uL溶液 Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，颠倒混匀内容物(勿剧烈震荡)，将离心管

放冰上5 min 。

6. 加入150 uL溶液 Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置

5 min 。

7. 12000 r/min ，离心15 min ，将上清转至另一离心管中。

8. 向上清中加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），反复混匀，10000 r/min，离心10 min，

将上清转移到另一离心管中。

9. 向上清加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置15～20min。12000r/min离心

10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

10. 用500 μL 70% 乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气

中干燥。

11. 加入适量（30 μL）的TE其中含有20 ug/ml的RNA酶，使DNA完全溶解，

－20℃保存。

(三)琼脂糖电泳检测

将样品5uL与上样缓冲液0.5 uL混合，用移液枪将该混合样品加入样品孔（记录点样顺序及点样量）。同时加入DNA marker。120v电泳大约20-30min。

六、作业

1、分析电泳图谱。

2、提取过程中，加入酚:氯仿:异戊醇的目的是什么？

3、如果一个DNA 酶解液在电泳后发现DNA 未被切动，你认为可能是什么原因？