肝糖原的提取、鉴定与定量
一、实验目的
1. 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。
2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。
3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。
4. 熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。
5. 正确掌握溶液转移的操作。
6. 正确操作使用分光光度计。
二、实验原理
（一）肝糖原的提取、鉴定
糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。
糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。
CuSO4十2NaOH═ Na2 SO4+Cu(OH)2↓
2Cu(OH)2十C6H12O6 ═ 2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O
2CuOH═ Cu2O↓(红色)+H2O
Cu(OH)2 ═ CuO↓(黑色)+H2O
（二）肝糖原的定量
糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物—5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10-100μg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。
三、材料与方法：以流程图示意
实验材料：
（一）仪器
1. 普通离心机，室温~100℃恒温水浴箱（×2），分光光度计，精度为10mg级电子天平（×1）
2. 剪刀（×1），镊子（×1），研钵（×1）
3. 试管架（×1），（100×15）mm试管（×3）
4. 刻度吸量管（2mL×1，5 mL×2），1000μL微量可调取液器（×1）
5. 100mL容量瓶（×1）
6. 白瓷反应板（×1）
（二）实验样品和试剂
1. 鸡肝。
2. 95％乙醇。
3. 0.31mol/L(5％)三氯醋酸溶液。
4. 0.15mol/L NaCl溶液。
5. 12mol/L HCl。
6. 12.5mol/L(50％)NaOH。
7. 碘试剂。
8. 班氏试剂。
9. 5.35mol/L(30％)KOH溶液。
11. 标准葡萄糖液(50mg/L)。
12. 17mol/L(90％)H2SO4(用于制备蒽酮显色剂）。
13. 蒽酮显色剂：称取蒽酮0.20g，用17mol/L H2SO4溶解至100 mL。此试剂不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用4-5d。
实验方法：
吸取1mL量溶液时使用可调微量取液器，吸取1mL以上量溶液时使用刻度吸量管。
（一）肝糖原的提取与鉴定
操作流程如下：
鸡肝约1.0g，剪碎
＋5%CCl3COOH 1 ml
研磨至乳状
＋5%CCl3COOH 3 ml
研磨成肝匀浆
全部转入离心管中，离心3分钟（4000 r / min）
沉淀（弃去） 上清（取2 ml）
＋2ml 95%乙醇，混匀，静置10分钟
离心5分钟（4000 r / min）
上清（弃去） 沉淀
＋蒸镏水1 ml
沸水浴2分钟，溶解沉淀
白瓷板孔穴中 糖原溶液1ml
＋浓HCl 5滴
加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 沸水浴15分钟，冷却
糖原溶液2滴 ＋50%NaOH 5滴
呈色对比 糖原水解液2滴 糖原水解液
＋班氏试剂4滴
混匀
沸水浴2分钟，观察变化
注意事项
1. 肝糖原提取一步，向上清液中加入95％乙醇后，务必注意混匀。由于上清液为水溶液，比重大于95％乙醇，溶液分成两层。总量相对较多，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。
2. 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，20，30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下（通常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。
3. 糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。
（二）肝糖原定量测定
操作流程如下：
鸡肝0.10 g
＋30%KOH 1.5ml （用吸量管）
沸水浴15分钟
冷却，全部转入100 ml容量瓶中
加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液
糖原的测定
取3支试管，按下表操作。
混匀，沸水浴10分钟，冷却。在分光光度计620 nm波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）。
计算：
四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。
（一）结果
1.鉴定实验中的呈色对比
1) 结果：
2) 结论：如图所示，加入提取的糖原溶液后，颜色变浅（碘液稀释后变浅），但并未变成红棕色，所以用这种鉴定方法鉴定不出有糖原的存在。
2.鉴定实验中葡萄糖还原反应
1) 结果：
2) 结论：水浴后，溶液的颜色加深，但并未生成红黄色沉淀，所以用这种鉴定方法鉴定不出有糖原的存在。
3.肝糖原定量测定实验
1) 结果
定量实验中沸水浴后空白管、标准管和样品管的颜色（从左至右）
吸光度测定结果
2) 结论：
根据上式计算，代入 A样品=， A标准=，肝组织重(g)=，
可得
此鸡为不饱食鸡。
第二篇：肝糖原提取和测定
肝糖原的提取和鉴定
一、实验目的
1.了解肝糖原的性质并掌握其提取的方法。
2.熟悉肝糖原的鉴定方法。
二、实验原理
肝糖原是糖在体内的重要储存形式之一。其储存量虽然不多，但在代谢过程中，它是动物体内糖的重要的来源之一。肝糖原的合成或分解对血糖浓度的调节起着重要的作用。
糖原属于高分子糖类化合物，微溶于水，无还原性，与碘作用变成红棕色。提取肝糖原是利用三氯醋酸破坏肝组织中的酶，且肝组织中的蛋白质也被三氯醋酸所沉淀，而糖原仍留在溶液中。过滤除去沉淀，滤液中的肝糖原可借加入的乙醇而沉淀。将沉淀的糖原溶于水，即可得到糖原溶液。
糖原与碘作用呈红棕色。糖原被酸水解为葡萄糖，可用班氏试剂检验。利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定组织中糖原的存在。
三、实验材料、仪器和试剂
1. 材料：
小白鼠等动物新鲜肝脏组织
2. 仪器：
（1）天平 （2）研钵 （3）离心机
（4）离心管 （5）恒温水浴锅 （6）试管
（7）广泛试纸 （8）移液管 （9）洗耳球
Page 1 of 3
（10）电炉 （11）量筒 （12）滤纸
3． 试剂：
（1）10%的三氯醋酸溶液
（2）5%的三氯醋酸溶液
（3）95%乙醇溶液
（4）浓盐酸
（5）20%的NaOH溶液
（6）碘液：(取碘1g、碘化钾2g溶于500mL蒸馏水中)
（7）班氏试剂：(将硫酸铜17.3g溶于100mL温蒸馏水中；取柠檬酸钠173g和无水碳酸钠100g溶于700mL温蒸馏水中，待冷却后，将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠和碳酸钠混合液中，最后用蒸馏水稀释至1000mL)
四、操作步骤
(一)肝糖原的提取
（1）肝匀浆的制备：迅速处死小白鼠，立即取出肝脏，用滤纸吸取附着的血液。称取约1g肝脏置研钵中，加入少许石英砂及10%的三氯醋酸溶液1mL，研磨至呈乳状后再加入5%的三氯醋酸2mL，继续研磨，直至肝脏组织已充分磨成均匀糜浆。
（2）提取糖原：将制备好的肝匀浆以3000r/min的转速离心10min。取上清液于另一离心管并量取体积，加入等体积的95%乙醇溶液，混匀后静置10min，使糖原呈絮状析出。将沉淀溶液以3000r/min的转速离心10min，弃去上清液，将离心管倒置于滤纸上1～2min，向沉 Page 2 of 3
淀中加入蒸馏水1mL，用细玻璃棒搅拌至溶解，即成糖原溶液。
(二)肝糖原的鉴定
（1）与碘的呈色反应：取小试管2支，一支加入糖原溶液10滴，另一支加入蒸馏水10滴，然后两管各加入碘液2滴，混匀。观察两试管中溶液的颜色变化，并解释现象。
（2）糖原水解液中葡萄糖的鉴定：在剩余的糖原溶液中加入浓盐酸3滴，放入沸水浴中加热10min，取出冷却，用20%的NaOH溶液中和至中性(用pH试纸检测)。然后加入班氏试剂2mL，再置沸水浴中加热5min，取出冷却。观察管中沉淀的生成，并解释现象。
五、注意事项
（1）实验用小白鼠在实验前必须饱食，因为空腹时肝糖原易分解而使其含量减少。
（2）肝脏离体后，肝糖原会迅速分解，所以在杀死动物后，所得刚脏必须迅速用三氯醋酸溶液处理。
Page 3 of 3