南昌大学实验报告

学生姓名： 彭学政 学 号： 6002212005 专业班级：给排水121班 实验类型：√ 验证 □ 综合 □ 设计 □ 创新 实验日期：2014.12.2 实验成绩： 水处理微生物学实验实验设计：

水体中总大肠菌群的检验

一、实验目的

1、掌握水中细菌总数测定方法；

2、掌握多管发酵法（MPN)测定水中大肠菌群的方法；

3、了解大肠杆菌数量与水质状态的关系；

4、了解大肠杆菌的数量在饮用水中的重要作用；

5、掌握污水细菌总数测定方法。

二、实验原理

大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。

多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

1．初（步）发酵试验

发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。

水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。在量少的情况下，也可能延迟到48小时后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48小时后仍不产气的为阴性结果。

2．平板分离

平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo＇s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blueagar，EMB agar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24小时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。

3．复发酵试验

以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。

三、主要仪器设备及耗材

器材：

显微镜、载玻片、酒精灯、10ml移液管、1ml移液管、 锥形瓶、试管刷、电炉、培养皿、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、电热培养箱、灭菌水、烧杯、记号笔、接种环、报纸、镊子、吸水纸、天平、PH试纸、钥匙、乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管）、玻璃棒（搅拌用）、试管架、洗耳球 、10ml量筒、其它实验辅材；

试剂：

酒精、革兰氏染色液一套、蒸馏水

试验水样：自来水

四、实验步骤

准备工作：

（1）制备培养基

1.乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。

2.三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。

3.品红亚硫酸钠培养基：

①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20～30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL，调节溶液pH为7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀，定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121℃灭菌15min，贮存于冷暗处备用。

②平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠，置于另一灭菌试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（灭菌）。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再褪至淡红色为止（不宜加多）。将

此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。立即将此培养基适量（约15mL）倾入已灭菌的平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用，但保存时间不宜超过两周。如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。

4．伊红美培养基：

①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20～30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解。再家人2.0g邻酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液pH值为7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，于121℃高压灭菌15min，贮于冷暗处备用。

②平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液（0.4g伊红溶于20mL水中）和一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于13mL水中），加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。

（2）培养皿及移液管灭菌

(1) 移液管的包装：将移液管的尖端，放在4-5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约 成30°夹角，折叠包装纸包住移液管尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条 螺旋式地包在移液管外面，余下的纸折叠打结。多支包装，待灭菌。

(2) 培养皿的包装：培养皿由一底一盖组成一套，用报纸将8套培养皿包好。 包装好后放入干热灭菌箱灭菌。

测定步骤：

试验水样：自来水

①初发酵试验：于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入10mL水样；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL 1∶10稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。

另外，于装有10ml乳糖蛋白胨培养液的1个试管中（内有倒管），接种大肠杆菌，以作比较。

②平板分离：上述各发酵管经培养24h后，将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基或品红亚硫酸钠培养基上，置于37℃恒温箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落：

a．伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。

b．品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。

③取上述特征的群落进行革兰氏染色：

a．用以培养18～24h的培养物涂片，涂层要薄；

b．将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min后用水洗去； c．滴加助色剂（碘与碘化钾溶液），1min后用水洗去；

d．滴加脱色剂（95%乙醇），摇动玻片，直止无紫色脱落为止（约20～30s），用水洗去；

e．滴加复染剂，1min后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。

④复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。

五、实验数据及处理结果

本组实验所测水样为自来水，在初发酵试验中，所有试管（接种大肠杆菌的试管除外）均不变色，小倒管无气体，可知既不产酸又不产气。

六、结果讨论

结果：由既不产酸又不产气可知，没有大肠杆菌检出。

讨论：这个结果的产生，可能是由于自来水中的大肠杆菌太少，无法检出；也可能是自来水中的大肠杆菌被污染了。

七、体会与建议

1. 进行实验时要有计划，按步骤来进行，并结合具体情况处理。

2. 实验应注意对照。

3. 经过讨论和査标准，得出大肠杆菌及细菌菌落总数的值。

对水质的简单评价：所取自来水水质较好，但不能判断能否饮用，因为饮用水指标有很多，比如透明度，浊度，颜色，电解质种类及含量，pH值等。

参考文献

[1] 环境工程微生物学（第二版）北京：高等教育出版社，2004.7.周群英，高廷耀

[2] 环境微生物学北京：化学工业出版社，2005.3乐毅全，王士男

[3] 环境工程微生物学北京：化学工业出版社，2004.6李建政

[4] 环境工程微生物学北京：高等教育出版社，2001.10胡家俊，周群英

[5] 水处理微生物学（第五版）：中国建筑工业出版社，2011.12 顾夏声

第二篇：大肠杆菌的分离以及药敏试验