标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量

一、标准曲线

一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

二、蛋白质含量测定方法

1、凯氏定氮法

2、双缩脲法

3、Folin-酚试剂法

4、紫外吸收法

5、考马斯亮蓝法

三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作

（一）、试剂：

1、考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H₃PO₄，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H₃PO₄。

2、标准蛋白质溶液：

纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

（二）、器材：

1、722S型分光光度计使用及原理（）。

2、移液管使用（）。

（三）、标准曲线制作：

1、

2、以A_595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

1）、利用标准曲线查出回归方程。

2）、用公式计算回归方程。

3）、或用origin作图  ，测出回归线性方程。即A_595nm=a×X(   )+6

一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

（四）、蛋白质含量的测定：

样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A_595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A_595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A_595nm值太大，可以稀释后再测A_595nm值，然后再计算。

（五）、注意事项：

1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。

4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。

药品的配制（磷酸缓冲液的配制）

一、药品的配制步骤

（一）、实验准备：

1、            准备所需的药品和玻璃仪器。

2、            洗涤。（怎样洗涤算干净？）

（二）、计算：

1、百分比浓度计算：

1)、G/V比

例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水。

2）、V/V比：

例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X,  X=75ml。取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水。

乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100 ml，200 ml混合。

3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。

2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。

1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml。

M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g   摩尔数=G（g）/摩尔质量

2）、0.1mMNaCl配100ml

mM=毫摩尔数/体积（L）    称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 

毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量

3）、0.1uNaCl配100ml

mM=微摩尔数/体积（L）    称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg

微摩尔数=G（ug）/摩尔质量   称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug

3、            混合溶液配制的计算：

如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM         溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制。

注意：1、分别标定体积计算

2、分别配制再混合，但总体积不能   为100ml

（三）、标量：

1、根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器，如量筒或移液管。

2、电子分析天平的使用。

（四）、溶解：

1、根据药品配置要求选择溶剂。蒸馏水，双蒸水，无离子水等。

2、只能用烧杯溶解。注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤烧杯三次左右，直到洗涤干净。

小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根据分子式和所学的常识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）。

如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解，但pH应在被要求的范围内。

3、加热促进溶解，但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好。如:配0.1%的淀粉，水裕加热（温度在80-90^。C），过量会糊化。

（五）、定容：

1、用容量瓶定容；

2、用玻璃棒引流或用小漏斗；

3、用溶剂加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。要求刻度与液体凹面相切为止（眼睛可视）；

4、上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可。(注意不再定容了，防止溶液漏掉。)

（六）、装入试剂瓶，贴上标签。

标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等。

（七）、清理实验场所。

二、磷酸缓冲液的配制。

（一）、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸缓冲液。用磷酸氢二钠—磷酸二氢钠做缓冲液。

选用药品：Na₂HPO₄·12H₂O（碱）和NaH₂PO₄·12H₂O（酸）配缓冲液100ml。书中说明。

（二）、计算 ：

1、注：书中有注明配置的量。

2、计算：Na₂HPO₄·12H₂O称取71.64×0.1=7.164g

NaH₂PO₄·12H₂O称取 31.21×0.1=3.121g

3、含有不同结晶水的换算。

书中配1/15mol/L的缓冲液配1L，书中用Na₂HPO₄·2H₂O需要11.87g/L但用Na₂HPO₄·12H₂O需多少g？

11.87=（178/358）×X，X=23.87g。

（三）、分别配制缓冲液各100ml（根据需要确定配制的量）。

即：0.2M  Na₂HPO₄·2H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O100ml。

（四）、按书中的量配制取量再混合。

如：pH=6.8，分别去缓冲对49ml和51ml。

（五）、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值，检测配置是否准确。

（六）如配50mM pH =6.8的缓冲液100ml ，以你配制的母液稀释即可。

计算：50×0.1=0.2×1000×X （L）；X =0.025L；

取0.2M  pH=7.2的缓冲液25ml，用蒸馏水定容至100ml即可。

第二篇：实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

实验二 考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量

一、目的与要求

1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法

2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。

二、实验原理

考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。

考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。

附：

（一）、分光光度法原理：

光的吸收定律（朗伯-比尔定律）：一束单色光(强度为I0)通过某吸光物质的溶液时,其光能量的被吸收与该物质浓度的关系符合朗伯—比尔定律即当入射光波长、温度和溶液的厚度一定时，吸光度与溶液的浓度成正比。

用公式表示为：T = I／I0 则 A = lg（1／T） =Kbc

式中 T — 透光率 I — 透过光强度 I0 — 入射光强度 A — 吸光度 K — 比例常数 b — 溶液的厚度 c — 溶液的浓度

（二）、离心机的使用说明：

1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。

2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。

3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。

（三）、分光光度计的使用说明：

1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。

2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=0.00。

3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。

4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。

5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。

三、试剂与器材

试剂：

1、0.9％NaCl 9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。

2、标准蛋白质：称取50mg结晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶里。

3、染液：考马斯亮蓝G-250 0.5g，溶于250mL95%乙醇，再加入500mL85％(W／V)磷酸，保存于棕色瓶中，称为母液。取150 mL然后加蒸馏水定容到1000mL，保存于棕色瓶中，备用。

器材：

试管；吸管10mL、l5mL、lmL、0.1mL；721分光光度计 四、操作方法

标准比较法测定样品提取液中蛋白质的含量

1.待测样品制备：称取新鲜豆芽2根，取其下胚轴，称重后放入研钵中，加5mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用5mL蒸馏水分两次次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，然后在2000r/min离心5min，弃去沉淀，上清液转入10mL离心管中，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。

2.取三只试管按照下表操作：

样品提取液（mL） 标准蛋白质（mL） 0.9%生理盐水（mL） 考马斯亮蓝（mL）

A595 3.结果计算

U待测管 0.1 0 0 3 放置5min

S 标准管

0 0.1 0 3 放置5min

B对照管

0 0 0.1 3 放置5min 调零

样品蛋白质含量(μg/g)= AU×结晶牛血清蛋白的含量（μg/ml）×提取液总体积（ml）

/AS×测定所须提取液体积（ml）×样品鲜重（g）

要点提示：

1．Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。

2．有些阳离子，如K+ 、Na+ 、Mg2+ 、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。

3．蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。