实验五微生物培养基的配制和灭菌

培养基是将微 生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。培养基为微生物的生长提供营养物质和生存空间。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件；（1）适当组分和比例的营养物质；（2）适宜的pH值；（3）合适的渗透压；（4）保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。培养基的配制是微生物学工作者的主要技术操作之一。

培养基的种类：

根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类：

合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。

半合成培养基：由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。

天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成的。

从培养基的物理状态来分：

液体培养基：不加凝固剂的液态状培养基。

固体培养基：在液体培养基中加入2％左右的凝固剂的固体状培养基或固体状农副产品培养基。

半固体培养基：在液体培养基中加入0.2％-0.5％凝固剂而成的半固体状培养基。

微生物最常用的凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。它不是一种营养物质，只能被极少数种类的细菌分解利用。琼脂是从海藻中（主要是石花菜）提取而制成的。是一种多糖类化合物，主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐，琼脂是一种可逆性胶体，在常规浓度下加热到96C以上即成溶胶状态，融化的琼脂，当温度下降到42℃以下，又凝固为固体。

一、目的要求

l. 了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。

2. 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。

3. 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。

二、实验材料

1. 药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O等。

2. 高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。

3. 其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养血、吸管、各种包装纸防水纸、绳索、棉花、标签等。

三、实验程序

（一）、培养基配制

l. 培养基配制的一般方法和步骤

（1）称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于搪瓷杯中。

（2）溶化：在搪瓷杯中加入所需水量（根据实验需要加入蒸馏水或自来水），用玻棒搅匀，加热溶解。

（3）调pH值（调pH也可以在加琼脂后再调），用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。

表 6-1 琼脂和明胶的特性比较

（4）加琼脂溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全溶化后，补足所失水分，一般数量少，时间短不必补水。

（5）分装：在漏斗架上分装。根据不同的需要进行分装，一般制斜面的装置为管高的1／5 特别注意不要使培养基粘污在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。

（6）包扎成捆、挂上标签。培养基分装好后，塞上棉塞，用防水纸包扎成捆挂上所配培养基名称的标签。

（7）灭菌备用。灭菌后如需制成斜面的，应在下磅后取出，摆成斜面（见图6-1）。培养基经灭菌后，必须放在37℃恒温培养箱中培养 24h，如确无菌生长、方可使用。

图6-1 灭菌的试管培养基趁热摆成斜面

2．三种培养基的配方及具体配制方法

（1）. 牛肉膏蛋白陈琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）。

配方：

本实验将原配方配成各种浓缩液。各种浓度如下：30％牛肉膏、50％蛋白胨、30％氯化钠。以配制200mL培养基为例。

吸取30％牛肉膏2mL；50％蛋白胨2mL；30％氯化钠2mL；加入有刻度的搪瓷烧杯中，然后用自来水补足到200mL。用玻棒搅匀，在电炉上稍加热，调 pH至 7.4，加琼脂4g，加热熔化，用玻棒不断搅拌，至琼脂完全溶解为止，趁热在漏斗架上装试管，（见图6－2）。装带有棉塞的无菌试管，装置1／5的试管高度共12支，作斜面培养基、用铝壳试管帽的里装10mL。约试管高度的 1／2以上，用作分离时倒平板用。

图 6-2 分装培养基图 6-3 将培养基试管包扎成捆

分装完毕，以12支为一捆，用防水纸包扎成捆（图6-3），挂上标签，灭菌备用。

（2）. 马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基（用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基）。

配方：

制备方法配制200mL培养基为例

取上皮马铃薯40g，切成小块、放入无刻度的搪瓷杯中，加水200mL，置电炉上加热煮沸10min，用4层纱布过滤至具刻度的搪瓷杯中，滤液加水补足至200mL。然后加蔗糖4g，加琼脂4g，加热熔化并用玻棒不断搅拌直至琼脂完全溶化分装试管，下面一系例步骤同配细菌培养基相同。

（3）. 淀粉琼脂培养基（高氏一号Gause’I），用干分离和培养放线菌，是一种合成培养基。

配方：

制备方法配制（以配制200mL）培养基为例：

吸取配方液：1％KNO320mL；1％K2 HPO410mL；1％MgSO4·7H2 O10mL；l％NaCl10mL；1％FeSO4 7H2O0.02mL．加水补足至 200mL，置电炉上加热.用另一只搪瓷杯称取可溶性淀粉4g，从200mL中取出少量加入淀粉中，用玻棒调成糊状，待液体沸腾后将淀粉糊洗入培养液中，搅匀，调pH至 7.4，加琼脂 4g，加热至琼脂完全溶化为止，趁热分装试管，以下一系例步骤同于配制细菌培养基的操作方法。

3. 无菌水的制备

无菌水，为下一次微生物分离实验中所需用而准备。

100mL三角瓶（装有玻璃珠），装自来水45mL，试管中装9mL自来水，塞上棉塞，包扎灭菌备用。三角瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。

（二）分离培养微生物常用器皿的准备

1. 清洗一些玻璃仪器：如三角瓶试管，培养皿、吸管等。

2. 棉塞的制作：装培养基和分离培养需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞梯塞的作用为过滤空气，使试管内外空气可以流通，但外界空气中杂菌不能进入，避免污染、试管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口约1-2mm处，用解剖针塞入少许棉花，（约1-1.5cm 长）以防止细菌吸入口中，井避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适宜。吹时以能通气但不使棉花塞下滑为准。

教师示范做试管棉塞，同学每人做5支试管棉塞。棉塞要求不紧不松，两头光滑。试管棉塞的长度约3cm左右。塞入试管内部分约占2/3，头部稍大约占1/3左右，见图6-4。

图6-4 试管棉塞的规范要求

1. 正确式样2. 管内部分太短，管外部分太松3. 外部过小

4. 整个棉塞太松5. 管内部分过紧，外部太松

3. 包装培养皿和吸管等。为了使培养皿、吸管、三角玻棒等洗净，干热灭菌后，不让表面暴露，以保证无菌状态，为此干热灭菌前先用旧报纸包装妥当（见示范），每组同学包培养皿6只（一包）。

吸管的包装，将塞好棉花的吸管尖端，放在4~5cm宽的长纸条的一端，约成45°角左右，折叠纸条，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌，见图6-5。

图6－5吸管灭菌前用纸包卷示意图

（三）培养基和玻璃器材的灭菌方法

灭菌的方法，通常可以分为四大类：（1）加热灭菌：包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒；（2）过滤去菌；（3）射线灭菌和消毒；（4）化学药剂灭菌和消毒。

在本实验中，介绍与培养基和玻璃器材灭菌有关的部份灭菌方法。

l. 干热灭菌法（即热空气灭菌法）

干热灭菌一般是利用电热烘箱作为干热灭菌器。前面所包装好的玻璃器皿，如带棉塞的三角瓶，试管、包装好的吸管、培养皿等，放入电热烘箱中。

打开烘箱顶部的通气孔，接上电源加热，使箱内空气的温度达到160℃~170℃，关闭通气孔使箱内的温度保持在160℃左右并维持1.5-2h。时间一到，切断电源。待温度下降60℃~70℃以下，方可打开箱门取灭菌物品，否则骤冷后易使箱内玻璃仪器破损。

2. 加压蒸气灭菌法

利用高压灭菌器，使水的沸点在密闭的灭菌器内随压力升高而增高（见表6-2），来提高蒸汽的温度和灭菌的效率。

在同一温度下湿热的杀菌效率比干热大，因为微生物细胞蛋白质在湿热情况下，易干凝固（见表6-3）。同时湿热的穿透力强，当水蒸汽与被灭菌的物品相接触后，便放出汽化潜热，逐步提高被灭菌物品的温度，直至与水蒸汽的温度相等，达到平衡为止，从而提高灭菌效率。

表6－2 灭菌器内空气比例与温度之间的关系

表6－3 蛋白质含水量与凝固温度之间的关系

手提式高压灭菌锅灭菌的操作步骤如下：

（1）在灭菌器内加入一定量的水（有的灭菌器内加水至止水线）。将用防水纸包扎好的灭菌物品如培养基、无菌水等，放进灭菌器内。

（2）接通电源，进行加热。

（3）当压力到达5bl/in2时，打开放气阀，使锅内的空气和水蒸汽一同排出，直至压力表的压力恢复到零，然后关闭排气阀，继续加热。

（4）当压力表＊的压力到达15bl/in2（即 1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度达到121℃，维持30min不变。对热不稳定的培养基灭菌时，应适当降低压力，延长时间。

（5）灭菌时间一到，切断电源，待压力下降至零时，才能打开排气孔，然后打开灭菌器盖，取出物品。如果灭菌后的固体培养基要做成斜面，需趁热放置。还需检查培养基灭菌是否彻底。

3. 间歇灭菌法

常采用阿诺（Arnold）氏灭菌器和柯赫（Koch）氏灭菌器或蒸笼灭菌，常压条件下蒸汽温度不超过100℃。在没有高压灭菌器设备的情况下或不宜加压灭菌的物品，可采用此法灭菌。

方法是：待灭菌物品放在灭菌器或蒸笼里，每d蒸煮1次，每次煮沸lh，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死的残留芽孢萌发成营养体，以便下1次蒸煮时杀灭。

4. 过滤除菌法

一些不能加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），可以用过滤除菌法，一般用细菌过滤器进行除菌。（教师示范）

细菌过滤器中的过滤板常用陶瓷、硅藻土或石棉等做成，过滤板孔眼很小，细菌不能通过。因此，过滤后的液体就除去了细菌。在进行过滤除菌前，整个细菌过滤器和接受液体的器皿，必须要包装妥当并进行加压蒸汽灭菌后方可使用。

下面介绍石棉板滤器的构造及其操作方法。石棉板滤器又称蔡氏（Scitz）滤器，它是由石棉制成的圆形滤板和一个特制漏斗组成（见图6-6a）。此漏斗分上下两节。上节为圆形金属筒，下节为金属漏斗。两节由三个活动螺旋固定，便于装卸。使用时拆开两节，将滤板放在漏斗上的金属筛板，再加上上节，然后将螺旋扭紧，将欲滤溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张无菌的新滤板。石棉板滤器因容积大小不同而有各种型号，石棉板也有不同规格型号使用时必须根据需要搭配妥当。图6-6b为一个注射器装备滤器，用于不便高压蒸汽灭菌的维生素液或其他溶液的除菌和气体的除菌，极为方便。

图6－6 过滤除菌装置a. 蔡氏过滤器b. 注射器滤器装置

5. 紫外线灭菌

波长260~280nm之间的紫外线有很强的杀菌能力，一般紫外灯管能产生253.7nm的紫外光，杀死力强而稳定，但穿透力弱一般只适宜物体表面、空气灭菌。例如接种室、培养室、手术室、药厂包装室等空气灭菌。一般30w灯管、9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时，先喷洒石碳酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。

在进行微生物接种和分离等操作时，常须用紫外线来杀灭接种室（箱）空气、台面等处的微生物。（参观示范）

紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力较弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。

紫外线对眼粘膜及视神经有强烈的损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以不能直接在紫外线灯开启下工作和用眼睛直视开启的紫外灯。

6. 化学药剂消毒灭菌

微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂，详见表6-4。

表6－4 各类化学药剂消毒灭菌的浓度、作用方式和用法

思考题

1、配固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？

2、培养基中加琼脂的作用是什么？

3、干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？

4、如何检查培养基灭菌是否彻底？

第二篇：培养基的制备与灭菌

实验八  培养基的制备与灭菌

一、目的要求

1.         掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。

2.         掌握培养基的配置方法。

3.         掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、基本原理

    正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代

谢类型的多样性．因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序却大致相同．例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。

三、实验材料

1.         药品：待配各种培养基的组成成分、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。

2.         仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。

3.         其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。

四、操作步骤

（一）玻璃器皿的洗涤和包装

1．玻璃器皿的洗涤

玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。

2．灭菌前玻璃器皿的包装

（1） 培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。

（2） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约1~1.5cm。塞棉花时．可用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。

先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管压紧．在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。

（二）液体及固体培养基的配制过程

1．液体培养基配制

1)      称量：一般可用0.01g天平称量配制培养基所需的各种药品，先按培养基配方计算出各成分的用量．然后进行准确称量。

2)      溶解：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水)，用玻璃棒搅动，加热溶解。

3)      定容：待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。

4)      调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达到所需pH为止。

5)      过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。

2．固体培养基的配制

    配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1.5~2％)加

入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。

（三）培养基的分装

    根据不同需要，可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。

1．试管的分装

取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹佐玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内。装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15×150 mm时，液体培养基可分装至试管高度1／4左有为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1／5(约3—4mI)，半固体培养基分装量为管高的1／3为宜。

2．三角瓶的分装

   用于振荡培养微生物时，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液体培养基；若用于制作

平板培养基用时，可在250 m1三角瓶中加入150ml培养基，然后再加入3g琼脂粉(按2％计算)，灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。

（四）棉塞的制作及试管、三角瓶的包扎

    为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。

1．试管棉塞的制作

制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的团孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞．然后直接压入试管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞。

制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2／3在试管内，1／3在试管外。目前也有采用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上。

将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用记号笔注明培养基名称及配制日期，灭菌待用。

2．三角瓶棉塞制作

通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上。

在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。

（五）培养基的灭菌

培养基经分装包扎后，应立即按配制方法规定的灭菌条件进行进行高压蒸汽灭菌。

（六）斜面和平板的制作

1．斜面的制作

将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面。斜面长度不超过试管长度l／2为宜。如制作半团体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至凝固。

2．平板的制作

将装在三角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50℃左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于50℃，培养基易于凝固而无法制作平板。

平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入10~15mL培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。

（七）培养基的灭菌检查

灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好取出1~2管(瓶)，置于37℃温箱中培养1~2天，确定无菌后方可使用。

（八）无菌水的制备

在每个250mL的三角瓶内装100mL的蒸馏水并塞上棉塞或硅胶塞。在每支试管内装4.5mL蒸馏水，塞上棉塞或硅胶塞。再在棉塞上包上一张牛皮纸，高压蒸汽灭菌。0.1MPa灭菌20~30min。

五、实验内容

1.         根据要求清洗各种玻璃器皿，并进行包扎。

2.         根据要求配制各种培养基。

3.         用电热鼓风干燥箱对玻璃器皿进行干热灭菌。

4.         用高压蒸汽灭菌锅对所配各培养基灭菌。

六、实验报告

1.         简述移液管和培养皿的包扎注意事项。

2.         简述配制培养基的基本步骤及注意事项。

3.         为什么微生物实验室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞入一小段棉花，再用报纸包起来，经高压蒸汽灭菌后才能使用?

4.         为什么微生物实验室所用的三角瓶口或试管口都要塞上棉塞（硅胶塞）才能使用？

5.         配制培养基时为什么要调节pH？

6.         高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短？

附录      灭菌技术

一、目的要求

了解消毒和灭菌的原理，并掌握各种灭菌方法的操作步骤。

二、实验材料

1.         仪器或其他用具：上述包扎的培养皿、试管、移液管等，电热鼓风干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，微孔滤膜过滤器，0.22μm滤膜，注射器，镊子，玻璃涂棒。

2.         培养基：上述配制的培养基及生理盐水

三、基本原理

在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此必须对所用器材、培养基和工作场所进行灭菌和消毒。灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物，包括微生物的营养体、芽孢和孢子。实验室常用的灭菌方法包括直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。这些方法的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的。

四、操作步骤

（一）干热灭菌法

干热灭菌是在电热干燥箱内利用高温干燥空气（160℃~170℃）进行灭菌，它是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。此法适用于玻璃器皿如移液管、试管和培养皿的灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品不能采用干热灭菌。

细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160℃~170℃），时间长（1~2h）。但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

干热灭菌使用的是电热干燥箱（干燥箱）。

具体操作步骤如下：

1.       装入待灭菌物品：将包好的待灭菌物品放入电热干燥箱内，关好箱门。

堆积时要留有空隙，物品不要摆放得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电热干燥箱内壁的铁板、温度探头，以防包装纸烤焦起火。

2.         升温：接通电源，打开开关，适当打开电热干燥箱顶部的排气孔，旋动恒温调节器，使温度逐步上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示电热干燥箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160℃~170℃，则需要转动温度调节器使红灯亮，如此反复调节，直至达到所需的温度。

3.       恒温：当温度升到160℃~170℃时，借助恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。干热灭菌过程中，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。

4.       降温：切断电源，自然降温。

5.       开箱取物：待电热干燥箱内温度降到60℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。同时，应将温度调节旋钮调到零点，并打开排气孔。电热干燥箱内温度未降到60℃以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。

（二）高压蒸汽灭菌

高压蒸汽灭菌是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，在一定的压力下保持15~30分钟进行灭菌。此法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。

将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅夹套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，获得高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在相同的温度下，湿热灭菌的效果好于干热灭菌。有三点原因：在湿热灭菌中菌体吸收水分，蛋白质容易凝固变性，蛋白质随着含水量的增加，所需凝固温度降低；湿热灭菌中蒸汽的穿透力比干燥空气大；蒸汽在被灭菌物体表面凝结，释放出大量的汽化潜热，能迅速提高灭菌物体表面的温度，从而增加灭菌效力。

实验室常用的灭菌锅有非自控手提式高压蒸汽灭菌锅和自控式灭菌锅，其结构和工作原理是相同的。本实验介绍的是非自控手提式高压蒸汽灭菌锅，自控式灭菌锅的使用可参考厂家说明书。具体操作步骤如下：

1.         加水：首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没过加热蛇管，与三角搁架相平为宜。切勿忘记检查水位，加水量过少，灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。

2.         装料：放回内层锅，并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。

3.         加盖：将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气，并打开排气阀。

4.         排气：打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排气孔中排出。一般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽，沸腾后约需5分钟。

5.         升压：冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始上升。

6.         保压：当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所需的时间。如本实验中采用0.1Mpa，121.5℃，20分钟灭菌。

灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气阀，维持所需压力。

7.         降压：达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表的压力降至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼伤操作者。

8.         无菌检查：将已灭菌的培养基放入37℃恒温培养箱培养24h，检查无杂菌生长后，即可使用。

（三）过滤除菌

有些物质，如抗生素、血清、维生素、糖溶液等采用加热灭菌法时，容易受热分解而被破坏，因而要采用过滤除菌法。过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法，该方法最大的优点是不破坏溶液中各种物质的化学成分。过滤除菌法除实验室用于溶液、试剂的除菌外，在微生物工作中使用的净化工作台也是根据过滤除菌的原理设计的，可根据不同的需要来选用不同的滤器和滤板材料。

应用最广泛的过滤器种类有：

1.         微孔滤膜过滤器：是一种新型过滤器，它由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盒组成，出口处可连接针头，入口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盒之间，旋紧盒盖，当溶液从针筒注入滤器时，各种微生物被阻留在微孔滤膜上面，而液体和小分子物质通过滤膜，从而达到除菌的目的。其滤膜是由硝酸纤维素、醋酸纤维素等制成的薄膜，有孔径大小不同的多种规格（如0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm等），实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。该滤器的优点是吸附性小，即溶液中的物质损耗少，过滤速度快，每张滤膜只使用1次，不用清洗。

2.         蔡氏（Seitz）过滤器：是一种金属制成的过滤漏斗，其过滤部分是一种用石棉纤维和其他填充物压制成的片状结构。溶液中的细菌通过石棉纤维的吸附和过滤而被去除，但对溶液中其他物质的吸附性也大，每张纤维板只能使用1次。

3.         玻璃过滤器：是一种玻璃制成的过滤漏斗，其过滤部分是由细玻璃粉烧结成的板状构造。玻璃滤器的规格很多，5号（孔径2~5μm）和6号（孔径<2μm）适用于过滤细菌，其优点是吸附量少，但每次使用后要洗净再用。

本实验采用微孔滤膜过滤器进行过滤除菌，具体操作步骤如下：

1.         组装、灭菌：将0.22µm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌后待用（0.1Mpa，121.5℃，灭菌20分钟）。

2.         连接：将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液的注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。

3.         压滤：将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拔出。

压滤时用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。

4.         无菌检查：无菌操作吸取除菌滤液0.1mL于肉汤蛋白胨平板上，均匀涂布，置37℃恒温培养箱培养24小时，检查是否有杂菌生长。

5.         清洗：弃去塑料滤器上的微孔滤膜，将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜，组装包扎，再经灭菌后使用。

整个过程应严格按照无菌操作，以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象。