华南师范大学实验报告

学生姓名                         学号              

实验时间                         年级              

指导老师                         组别                

实验六：高效液相色谱法用于有机农药残留的分离与定量分析

一、实验目的：

1、            应用高效液相色谱法对磺胺类抗生素的定性和定量检测

2、学习谱图和数据的处理方法

二、实验原理：

磺胺族抗生素包括磺胺嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺甲噁唑，等, 被广泛应用到水产、畜禽类养殖中。它们被添加到动物饲料中, 以促进动物的生长以及防治各种疾病, 如果不能严格控制停药期, 很容易造成在动物肉和组织中残留, 给人体健康带来危害, 因此世界各国对畜禽肉中的磺胺族残留都有严格的限量要求。GB/T 5009.116- 20## 用液相色谱法检测畜禽肉中的磺胺类药物残留量, 操作简单快速,但是该方法灵敏度比较低。

高效液相色谱采用液体作为流动相，由于样品溶液中的各组分在色谱柱中固定相和流动相中的分配系数不同，当试样随流动相进入色谱柱后，组分就在两相间进行反复多次的分配，由于固定相对各种组分的吸附能力不同，各组分在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定柱长后彼此分离，依次从色谱柱流出，达到分离、分析及测定的目的。从色谱柱中流出的成分通过检测器时样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

三、实验仪器与试剂：

仪器：岛津液相色谱仪，SPD-20A检测器，LC-20AT泵，微量进样器，C18色谱柱

试剂：磺胺嘧啶标准溶液，磺胺吡啶标准溶液，磺胺嘧啶-磺胺吡啶混合液（1：1），乙腈（AR），0.05%甲酸溶液

样品的配制：

0.05%甲酸溶液：取0.25ml的甲酸标准溶液用去离子水定容至500ml的容量瓶中。

磺胺嘧啶标准溶液与磺胺吡啶标准溶液：分别称取0.10g的磺胺嘧啶、磺胺吡啶用甲醇定容至100.0 mL，用0.45µm滤膜过滤（先在一次性注射器加上0.45µm滤膜，然后把活塞杆拉出来，把要过滤的溶液倒进去再把杆推进滤出溶液。）得到磺胺嘧啶和磺胺吡啶的分别为1 mg/mL（1000ppm）。分别吸取磺胺嘧啶和磺胺吡啶标准溶液各5mL，置于10 mL容量瓶中磺胺吡啶和磺胺嘧啶-磺胺吡啶混合0.5 mg/mL（500ppm）

四、实验步骤：

1、准备

1.1准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，超声脱气20min。（这里用的是流动相是乙腈(B)和0.05%甲酸溶液(A)，分别用有机相系和水相系的0.45µm滤膜过滤，超声脱气20min。）

1.2根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。

1.3配制样品浓度为1000ppm（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45μm滤膜过滤。（即分别称取0.10g的磺胺嘧啶、磺胺吡啶用甲醇定容至100.0 mL，用0.45µm滤膜过滤（先在一次性注射器加上0.45µm滤膜，然后把活塞杆拉出来，把要过滤的溶液倒进去再把杆推进滤出溶液。）得到磺胺嘧啶和磺胺吡啶的分别为1 mg/mL（1000ppm）。分别吸取磺胺嘧啶和磺胺吡啶标准溶液各5mL，置于10 mL容量瓶中磺胺吡啶和磺胺嘧啶-磺胺吡啶混合0.5 mg/mL（500ppm）。

2、开机

接通电源，依次开启不间断电源、B泵、A泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站（即电脑桌面上的CS-Light Real Time Analysis）。

3、参数设定

3.1波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按[func]键接着按[Enter]键，用数字键输入所需波长值281nm。

3.2流速设定：在A泵显示初始屏幕时，按[func]键，用数字键输入所需的流速（柱在线时流速一般不超过1.0 mL/min）。

3.3流动相比例设定：在A泵显示初始屏幕时，按[conc]键，用数字键输入流动相B乙腈的浓度百分数(20%)。

4、更换流动相并排气泡

4.1将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；

4.2逆时针转动A/B泵的排液阀180°，打开排液阀；

4.3按A/B泵的[purge]键，pump指示灯亮，泵大约以9.9ml/min的流速冲洗，3min（可设定）后自动停止；

4.4将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。

5、进样

5.1进样前在CS-Light Real Time Analysis中:(1)点击“单次分析”，接着点击“样品记录”，在样品记录名称中输入所要检测得样品名称，然后点击“数据文件”选择该样品储存在哪里，最后在“数据储存的文件夹”后面输入该样品名称，点击确定。(2)在信号采集菜单中设定停止时间和延迟时间。

5.2进样前按检测器[zero]键调零，按软件中 [零点校正] 按钮校正基线零点，再按一下 [查看基线] 按钮使其弹起。

5.3用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取20 mL。

7、数据处理

7.1在桌面双击“CS-Light Postrum Analysis”，点击确定按钮后，在“文件夹目录中”选中该样品记录双击鼠标，在谱图上单击鼠标右键的“显示设置”，在“显示设置”中选择“展开色谱”的“时间”“0”到“20”后点击确定

7.2用鼠标点击“编辑”选择“积分”中的“最小峰面积/高”输入“最小峰面积值”，然后又点击“定量”在“定量方法”中选择“面积归一法”，然后点击查看。

8、关闭仪器

分析完毕后，关闭色谱工作站，再自上而下关闭仪器。

五、实验数据记录

以20%乙腈-甲酸作为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为281nm。

对磺胺嘧啶、磺胺吡啶作定性分析得到以下数据：

图一、磺胺吡啶的液相色谱图

表一、磺胺吡啶的液相色谱分析数据表

图二、磺胺嘧啶标准溶液的液相色谱图

表二、磺胺嘧啶的液相色谱分析数据表

图三、混合液的液相色谱图

表三、混合液的液相色谱分析数据表

图四、数据对比分析图

六、数据分析与讨论

1、定性分析

用色谱法进行定性分析的任务是确定色谱图上每一个峰所代表的物质。在色谱条件一定时，任何一种物质都有确定的保留值、保留时间。因此，在相同的色谱操作条件下，可通过比较已知纯物质和未知组分的保留值定性。如待测组分的保留值与在相同色谱条件下测得的已知纯物质的保留值相同，则可以初步认为它们是属同一种物质。

在以20%乙腈-甲酸作为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为281nm时，分别以磺胺吡啶标准溶液和磺胺嘧啶标准溶液进样，确定磺胺吡啶出峰的保留时间为10.866min，磺胺嘧啶的保留时间为9.482min。在混合液分析中，高效液相色谱图中有两个色谱峰，保留时间分别为9.399min和10.764min，根据定性分析的原理可知：1号峰保留时间9.399min与磺胺嘧啶的保留时间相近，所以确定1号峰为磺胺嘧啶的色谱峰，同理可得2号峰为磺胺吡啶的色谱峰。

2、定量分析：

在气相色谱中，定量测定是建立在检测器信号（色谱峰面积）的大小与进入检测器组分的量成正比的基础上。

本实验用面积归一化法求出混合物中磺胺吡啶和磺胺嘧啶的体积百分数。由混合液的色谱分析得，磺胺吡啶的色谱峰面积为51.5047%，磺胺嘧啶的色谱峰面积为48.3953%，可知混合物中磺胺吡啶与磺胺嘧啶的体积分数比为51.5047%/48.3953%=1.064，而实际混合液中两者的体积分数比为1，存在一定的误差。

3、结果讨论

（1）实验出来的色谱峰不是尖锐的原因可能是：

a、.流动相不合适，引起的峰形不够尖锐或者对称性不好，需要调节流动相比例或者组成
b、.柱子柱效低了引起的峰变宽

c、配制得溶液的溶度过高导致

用比流动相强度大的大体积样品进样通常会损害色谱图的质量而出现胖峰和平

头峰应遵循下列规则选用溶剂溶解样品。

A最好用流动相溶解样品进样

B用大体积弱溶剂溶解样品

C需要时用强溶剂溶解进样

（2）实验时进样针每进一次样都要用甲醇清洗进样针15到20次，再用待测液润洗1-2次，因为六通阀里可能含有其他杂质，会附着在针上。

（3）在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。

采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

七、问题思考

1、 高效液相色谱的定性和定量分析的方法

（1）定性分析的方法有：

A、利用纯物质定性的方法

利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。

B、利用文献保留值定性

相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。

（2）定量分析的方法有：归一法、内标法、外标法

在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等，但高效液相色谱在分离复杂组分式样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而内标法定量则被广泛使用。

2．影响分离的因素与提高柱效的途径

（1）．液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径，降低固定相粒度可提高柱效。

（2）．液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质；（恒温）

（3）．改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。

第二篇：高效液相色谱法在农药残留分析中的应用