实验三 邻二氮菲分光光度法测定铁的含量
一、实验目的
1.学会吸收曲线及标准曲线的绘制，了解分光光度法的基本原理。
2.掌握用邻二氮菲分光光度法测定微量铁的方法原理。
3.学会722S型分光光度计的正确使用，了解其工作原理。
4.学会数据处理的基本方法。
5.掌握比色皿的正确使用。
二、实验原理
根据朗伯—比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。同时，还可应用相关的回归分析软件，将数据输入计算机，得到相应的分析结果。
用分光光度法测定试样中的微量铁，可选用的显色剂有邻二氮菲(又称邻菲罗啉)及其衍生物、磺基水杨酸、硫氰酸盐等。而目前一般采用邻二氮菲法，该法具有高灵敏度、高选择性，且稳定性好，干扰易消除等优点。
在pH=2～9的溶液中，Fe2+与邻二氮菲(phen)生成稳定的桔红色配合物Fe(phen)32+，
此配合物的lgK稳=21.3，摩尔吸光系数ε510 = 1.1×104 L·mol-1·cm-1，而Fe3+能与邻二氮菲生成3∶1配合物，呈淡蓝色，lgK稳=14.1。所以在加入显色剂之前，应用盐酸羟胺(NH2OH·HCl)将Fe3+还原为Fe2+，其反应式如下：
2Fe3+ + 2NH2OH·HCl → 2Fe2+ + N2 + H2O + 4H+ + 2Cl-
测定时控制溶液的酸度为pH≈5较为适宜。
三、仪器与试剂
722S型或721型分光光度计、容量瓶(100mL,50mL)、吸量管
１、铁标准溶液：含铁0.1mg/ml。
准确称取0.8634g的NH4Fe(SO4)2·12H2O，置于烧杯中，加入20ml1:1HCl和少量水,溶解后,定量地转移至１升容量瓶中，以水稀释之刻度，摇匀。
２、邻二氮菲：0.15％(10-3mol/L)新配制的水溶液。
３、盐酸羟胺： 10％水溶液（临用时配制）
４、醋酸钠溶液 1mol/L
四、实验步骤
1.标准溶液配制
1) 10μg·mL-1铁标准溶液配制 准确称取0.8634g硫酸铁铵NH4Fe(SO4)2·12H2O于100mL烧杯中，加60mL 3mol·L-1 H2SO4溶液，溶解后定容至1L，摇匀，得100μg·mL-1储备液(可由实验室提供)。用时吸取10.00mL稀释至100mL，得10μg·mL-1工作液。
2) 系列标准溶液配制 取6个50mL容量瓶，分别加入铁标准溶液0.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00mL，然后加入1mL盐酸羟胺，2.00mL邻二氮菲，5mLNaAc溶液(为什么?)，每加入一种试剂都应初步混匀。用去离子水定容至刻度，充分摇匀，放置10min。
2.吸收曲线的绘制
选用1cm比色皿，以试剂空白为参比溶液(为什么?)，取4号容量瓶试液，选择440～560nm波长，每隔10nm测一次吸光度，其中500～520nm之间，每隔5nm测定一次吸光度。以所得吸光度A为纵坐标，以相应波长λ为横坐标，在坐标纸上绘制A与λ的吸收曲线。从吸收曲线上选择测定Fe的适宜波长，一般选用最大吸收波长λmax为测定波长。
3.标准曲线(工作曲线)的绘制
用1cm比色皿，以试剂空白为参比溶液，在选定波长下，测定各溶液的吸光度。在坐标纸上，以铁含量为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
4.试样中铁含量的测定
从实验教师处领取含铁未知液一份，放入50mL容量瓶中，按以上方法显色，并测其吸光度。此步操作应与系列标准溶液显色、测定同时进行。
依据试液的A值，从标准曲线上即可查得其浓度，最后计算出原试液中含铁量(以μg·mL-1表示)。并选择相应的回归分析软件，将所得的各次测定结果输入计算机，得出相应的分析结果。
五.数据处理
1.数据
分光光度计型号 ，比色皿厚 ，光源电压
（1）吸收曲线的绘制
（2）标准曲线的绘制与铁含量的测定
2.绘制以下曲线
（1）吸收曲线 （2）标准曲线
3.计算未知液中铁的含量
C铁=Cx/5×10-3（g/L）
式中：Cx—未知液吸光度在标准曲线上对应的含铁总量μg/25mL
六.思考题
1.本实验中哪些试剂应准确加入，哪些不必严格准确加入?为什么?
2.加入盐酸羟胺的目的是什么?
3.配制NH4Fe(SO4)2·12H2O溶液时，能否直接用水溶解?为什么?
4.如何正确使用比色皿?
5.何谓“吸收曲线”、“工作曲线”? 绘制及目的各有什么不同?
七.分光光度计(722S型)的使用方法
分光光度计是根据物质对光的选择性吸收来测量微量物质浓度的。722S型光栅分光光度计是数字显示的单光束、可见分光光度计。它具有灵敏度和准确度高、操作简便、快速等优点，允许测量的波长范围为330～800nm，吸光度的显示范围为0～1.999，是在可见光区进行吸光光度分析的常用仪器。
1.测量原理
一束单色光通过有色溶液时，一部分光线通过，一部分被吸收，一部分被器皿的表面反射。设I0为入射光的强度，I为透过光的强度，则I/I0称为透光度，用T表示。透光度越大，光被吸收越少。把lgI0/I定义为吸光度，用A表示。吸光度越大，溶液对光的吸收越多。吸光度A与透光度T之间的关系为A=lg[SX()1[]T[SX]]。吸光度A与待测溶液的浓度c(mol· L-1)和液层的厚度b(cm)成正比，即：A=εbc。这是光的吸收定律，亦称朗伯-比耳(Lambert-Beer)定律。式中ε为比例常数，叫摩尔吸收系数，它与入射光的波长、溶液的性质、温度等因素有关。当入射光波长一定，溶液的温度和比色皿(溶液的厚度)均一定时，则吸光度A只与溶液浓度c成正比。将单色光通过待测溶液，并使通过光射在光电管上变为电讯号，在数字显示器上可直接读出吸光度A或浓度c。
2.仪器构造
722S型分光光度计由光源室、单色器、试样室、光电管暗盒、电子系统及数字显示器等部件组成。其结构如图3-3所示，外形如教材P104页图3-3所示。
3.使用方法
(1)取下防尘罩，将灵敏度调节旋钮13置于“1”档(信号放大倍率最小)。
(2)接通电源，按下仪器上的电源开关7，指示灯即亮。将选择开关3置于“T”
档(即透光度)。调节波长手轮8使波长刻度盘9中标线对准的波长为所需波长。仪器预热20min。
(3)打开试样室盖(光门自动关闭)，调节0%T旋钮12，使显示“00.0”。
(4)把盛参比溶液的比色皿放入试样架的第一格内，盛试样的比色皿放入第二、
三、四格内，然后盖上试样室盖(光门打开，光电管受光)。推动试样架拉手10把参比溶液推入光路，调节100%T旋钮11，使之显示为“100.0”，若显示不到“100.0”，应增大灵敏度档，但尽可能倍率置低档使用，这样仪器将有更高的稳定性。改变灵敏度后，应按(3)重新调“0”后再调节100%T旋钮，直至显示为“100.0”。
(5)重复(3)和(4)操作，显示稳定后即可进行测定工作。
(6)吸光度A的测量：稳定地显示“100.0”透光度后，将选择开关置于“A”
档(即吸光度)，此时吸光度显示应为“00.0”，若不是，则调节吸光度调零旋钮2，使显示为“00.0”，然后将试样推入光路，这时的显示值即为试样的吸光度。
(7)浓度C的测量：选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，
调节浓度旋钮5，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，即可读出被测样品的浓度值。
(8)测定完毕，关闭仪器电源开关(短时间不用，不必关闭电源，可打开试样室
盖，即可停止照射光电管)，将比色皿取出，洗干净，擦干，放回原处。拔下电源插头，待仪器冷却10min后盖上防尘罩。
4.注意事项
(1) 测定过程中，不要将参比溶液拿出试样室，应将其随时推入光路以检查吸
光度零点是否变化。如不为“00.0”，则不要先调节旋钮2，而应将选择开关3置于“T”档，用100%旋钮调至“100.0”，再将选择开关置于“A”，这时如不为“00.0”，才可调节旋钮2。
(2) 为了避免光电管长时间受光照射引起的疲劳现象，应尽可能减少光电管受
光照射的时间，不测定时应打开暗室盖，特别应避免光电管受强光照射。
(3)使用前若发现仪器上所附硅胶管已变红应及时更换硅胶。
(3) 比色皿盛取溶液时只需装至比色皿的3/4即可，不要过满，避免在测定的
拉动过程中溅出，使仪器受湿、被腐蚀。
(5)若大幅度调整波长，应稍等一段时间再测定，让光电管有一定的适应时间。(6)每台仪器所配套的比色皿，不能与其它仪器上的比色皿单个调换。
(7)仪器上各旋钮应细心操作，不要用劲拧动，以免损坏机件。若发现仪器工
作异常，应及时报告指导教师，不得自行处理。
第二篇：08实验8 邻二氮菲吸光光度法测定铁的条件试验
实验八邻二氮菲吸光光度法测定铁的条件试验
一、目的与要求
1、 掌握分光光度法的条件试验及测定方案的拟定方法c
2、了解分光光度计的构造、性能及使用方法。
二、方法原理
邻二氮菲(又称邻菲罗啉)是测定微量铁的较好试剂，在pH=2-9的条件下，二价铁离子与试剂生成极稳定的橙红色配合物。配合物的lgk稳＝21.3，摩尔吸光系数ε510＝11000。
在显色前，用盐酸羟胺把三价铁离子还原为二价铁离子：
4Fe3+ 十2NH2OH———4Fe3+ 十N2O十4H+十H 2O
测定时，控制溶液pH=3较为适宜，酸度高时，反应进行较慢，酸度太低，则二价铁离子水解，影响显色。
用邻二氮菲测定时，有很多元素干扰测定，须预先进行掩蔽或分离，如钴、镍、铜、铬与试剂形成有色配合物；钨、相、铜、汞与试剂生成沉淀，还有些金属离子如锡、铅、铋则在邻二氮菲铁配合物形成的pH范围内发生水解；因此当这些离子共存时，应注意消除它们的干扰作用。
三、仪器与试剂
1．醋酸钠：1mol·L-1；
2．氢氧化钠：0.4 mol·L-1；
3．盐酸：2 mol·L-1；
4．盐酸经胺；10％(临时配制)；
5．邻二氮菲(0.02％)：称取0.1g邻二氮菲溶解在100mL1+1乙醇溶液中，取0.1％溶液稀释5倍。
6．铁标准溶液
(1)10-4 mol·L-1 铁标准溶液：准确称取0.1961g(NH4)2Fe(SO4)2·6H20于烧杯中，用2 mol·L-1 的盐酸15mL溶解，移至500 mL容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀；再准确稀释10倍成为10-4mol·L-1标准溶液。
(2)10μg·mL-1铁标准溶液：准确称取 0.3511g(NH4)2Fe(SO4)2·6H20于烧杯中，用2 mol·L-1的盐酸15mL溶解，移入500mL容量瓶中．以水稀释至刻度，摇匀。再准确稀释10倍成
为含铁10μg·mL-1标推溶液。
如以硫酸铁铵NH4Fe(SO4)2·12H20配制铁标准溶液，则需标定。
7．仪器 分光光度计及1cm比色皿
四、内容与步骤
1．实验方法 用吸量管准确吸取10-4 mol·L-1铁标准溶液10 mL，置于50mL容量瓶中。加入10％盐酸羟胺溶液1mL，摇匀后加入1mol·L-1醋酸钠溶液5mL和0．1％邻二氮菲溶液3mL，以水稀释至刻度，摇匀。在分光光度计上，用1cm比色皿，以水为参比溶液，在510 nm处测定吸光度。
2．测定条件的选择
(1)邻二氮菲与铁的配合物的稳定性 用上面溶液继续进行测定，在最大吸收波长510 nm处，从加入显色剂后立即测定一次吸光度，经15min，30 min，45min，60min后，各测一次吸光度。以时间(t)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制A—t曲线，从曲线上判断配合物稳定的情况。
(2)显色别浓度的影响 取25mL比色管7个，用吸量管准确吸取10-4 mol·L-1铁标准溶液5mL于各比色管中，加入10％盐酸经胺溶液3mL援匀，再加入1 mol·L-1醋酸钠5mL，然后分别加入0.1％邻二氯菲溶液0.3，0.6，1.0，1.5，2.0，3.0和4.0mL，以水稀释至刻度，摇匀。在分光光度汁上，用适宜波长(510nm)，1cm比色皿，以水为参比测定不同用量显色剂溶液的吸光度。然后以邻二氮菲试剂加人毫升数为横坐标，吸光度为纵坐标、绘制A—v曲线，由曲线上确定显色剂最佳加入量。
(3)溶液酸度对配合物的影响 准确吸取10-4 mol·L-1铁标准溶液10 mL，置于100mL容量瓶中，加入2mol·L-1盐酸5mL和10％盐酸羟胺溶液10 mL，摇匀，经2min后，再加入0．1％邻二氮菲溶液30 mL，以水稀释至刻度，摇匀后备用。
取25mL比色管7个，用吸量管分别准确吸取上述溶液10mL于各比色管中，然后在各个比色管中，依次用吸量管准确吸取加入0.4 mol·L-1的氢氧化钠溶液1.0，2.0，3.0．4.0，6.0．8.0及10.0mL，以水稀释至刻度，摇匀，使各溶液的pH从小于等于2开始逐步增加至12以上，测定各溶液的PH值。先用pH l--14广泛试纸确定其粗赂pH值，然后进一步用精密pH试纸确定其较准确的pH值(最好采用pH计测量溶液的pH值，误差较小)。同时在分光光度计上，用适当的波长(510 nm)，1cm比色皿，以水为参比测定各溶液的吸光度。最后以pH值为横坐标．吸光度为纵坐标，绘制A—pH曲线，由曲线上确定最适宜的pH范围。
五、数据记录与处理
1．数据
分光光度计型号 比色皿厚 光源电压
(1)邻二氮菲与铁的配合物的稳定性
表8-1 邻二氮菲与铁的配合物的稳定性
(2)显色剂浓度的影响
表8-2 显色剂浓度的影响
(3)酸度的影响
表8-3 酸度的影响
2．绘制以下曲线
(1) A-t曲线 (2)吸光度与显色剂用量曲线 (3) A-pH曲线
3．根据上面条件实验的结果,拟出邻二氮菲分光光度法测定铁的测定条件井讨论之。
六、问题与讨论
1．三价铁离子溶液在显色前加盐酸羟胺的目的是什么?为测定一般铁盐的总铁量，是否需要加盐酸羟胺?
2．在本实验的各项测定中，哪些试剂的加入量的体积要比较准确，而哪些试剂则可不必，为什么?
3．根据自己的实验结果数据，计算在最适宜波长下邻二氯菲与铁配合物的摩尔吸光系数。