实验二 微生物的大小测定与显微计数

一、实验目的

1.         学习并掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法。

2.         了解血细胞计数板的构造及计数原理。

3.         掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

二  实验原理

1.       酵母菌大小测定

在显微镜下，测微尺可完成对微生物大小的测定。测微尺包括目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是一块放入目镜中的圆形玻片，在玻片中央把10mm的长度刻成100等分，用于测量经显微镜放大后的细胞图像。测量前，需先用镜台测微尺校正。镜台测微尺是专门用来校正目镜测微尺的。

2.       微生物数量的测定

血细胞计数板（图一）是一块特制的载玻片，薄片上有4条槽构成3个平台，中间较宽的平台又被一短槽隔成两半，每一边平台各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。

计数室（图二）的刻度有两种：一种大方格分为16个中方格，每个中方格分成25个小方格；一种大方格分成25个中方格，中方格分成16个小方格。每个大方格都是400个小方格，边长为1mm，面积1mm ²，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm ³。

三实验仪器、材料和用具

1.  实验用具：载玻片、盖片、200µ l移液器及tip、擦镜纸、 装有蒸馏水的洗瓶。

2.  实验仪器：普通生物显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、手动计数器;

3.  菌种 ：酿酒酵母（200rpm，28℃，24h，稀释20倍）

四  实验步骤

1．  酵母菌大小测定

（1） 目镜测微尺的校正

在100倍镜下，使目镜测微尺的目镜和镜台测微尺某一个区域内两线完全重合。计数两重合刻度之间目镜测微尺和镜台测微尺的格数（格数必须是整数）。

（2） 细胞大小的测定

1）    将稀释40倍的少量的酵母培养液涂在载玻片上，用盖玻片推开，放在载物台上。

2）    用100倍镜观察，用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长、宽各占几格。测定20个菌体，统计计算。

（3）测定完毕后，将目镜测微尺和物镜测微尺擦拭干净包好归还 。

2.       微生物数量的测定

1）  菌液准备：将啤酒酵母在28℃，100r/min培养8h。40倍稀释（由助教完成）。

2）  镜检计数室：加样前，对计数板的计数室镜检，若有污物需要清洗，干燥后使用。

3）  加样品：将血细胞计数器中间平台盖上盖玻片，用无菌水吸管将摇匀的啤酒酵母菌悬液由盖玻片的边缘滴一小滴，让菌液靠毛细渗透作用自动进入到计数室。

4）  显微镜计数：加样后将血细胞计数板置于显微镜的载物台上，静置1min后，用4倍镜找到计数室，再换10倍镜进行计数。对两个计数室各计数一次。

5）  酵母菌计数完毕后，马上将其用洗瓶冲洗，自然晾干，或者用擦镜纸轻轻擦干。

6）  重新加样：按照前面的步骤再计数5次。利用公式计算出血细胞的数量。

五、实验结果

1. 酵母菌大小测定

已知镜台测微尺每格10μm，所以根据下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的实际长度：

表一  目镜测微尺标定结果.

表二 酵母菌大小的测定结果(100×)

经计算得：

酵母菌长轴平均值 7.995×0.99μm＝7.92 μm ；酵母菌短轴平均值 6.500×0.99μm＝6.44 μm

酵母菌体积平均值 =4πabc/3=172.04μm³

随机误差使测量值具有一定的分散性，实验标准偏差可用s表征，s可以用贝塞尔公式算出：

  其中n在这次实验中为20

计算得μm   μm

不确定度  置信度为0.95时，查表，t = 2.093，则= 0.468

所以μm；μm

综上，酵母菌长轴7.92 ±0.47μm   酵母菌短轴6.44±0.52 μm

2.       酵母菌悬液显微计数

表三  用血细胞计数板对酵母菌悬液计数结果

酵母菌体积含量=酵母菌细胞数/ml单个细胞体积=/ml172.04μm³=2.3%

六实验总结和分析

1.         数据分析：

（1）查资料得，酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10 μm，实验结果符合。

（2）从显微计数测量结果（表三）分析：

1)        通过计算，发现其他组的标准偏差都在1到5个之间，但第9组标准偏差达到了6.1个，说明菌液分布不均匀，中间一格数目很多，也许是因为没有摇匀，或者通过毛细现象吸入装片下时不够均匀。

2)        比较可得，第7、8组数据都偏小，这两组数据是一起测量的，而且测量前可能是摇匀了菌液的，所以怀疑是上一次洗了计数板后没有晾干，在两个计数室区域之间的小沟里有水残留，后来加入菌液时被稀释。

2.         关于结果：我的结果和旁边组的人差异很大，除了拿到的菌液可能有差异外，我觉得个人主观因素应该也有一定影响。比如测量长度时候选择细胞，虽然说要选取各种大小的细胞测量，但个人可能选择到的细胞大小不同，而且读数时也会因人而异；计数时也是，对于出芽酵母，老师给的标准是大于母细胞一半就算一个细胞，但是每个人的判断是不一样的，有的和母细胞大小一半差不多的细胞，有人会计数，有人就不会计。

3.         关于操作：

1） 测量大小时，要把目的细胞中心放在视野正中，这样调节目镜测微尺测量长短轴会很方便，并使细胞的一边与一条刻度尺相切，以减少读数误差。

2） 调节观察显微计数时，要把聚光器调低，光线调暗，这样比较容易在一个焦平面上看到计数室和酵母细胞。计数过程中，可以调节细准焦螺旋，防止遗漏不同空间位置的细胞。吸取溶液前摇匀，可以用吸管吹吸几次再取。滴加菌液时不要太多，恰好渗入即可。

七思考题

1．根据你的实验体会，说明计数板的误差主要来自哪些方面？

计数板上残留着上一次计数的酵母

清洗计数板后没有晾干就再次使用

酵母菌液在稀释、分装过程中可能产生误差

溶液不均匀造成的误差

过多溶液渗入计数器，并且细胞沉积

统计组数有限造成的随机误差

计数的误差，如忽略体积较小的酵母菌、计算了很小的出芽、边缘细胞计数重复或漏记

滴加太多使得盖玻片飘起来，体积不准确，错误判断酵母芽体大小

2．显微测微尺上的刻度大小和放大倍数会影响到测量结果吗?

刻度大小会影响，因为刻度大小和测量精度直接相关。如果一个酵母连一格都占不到，测量结果肯定不会准确。

放大倍数也有影响，虽然理论上说，测定的结果应该是基本上相同的，因为真实值是不变的。但由于人眼的精度限制，在低倍物镜下观察到的菌体可能比较小，甚至都不到目镜测微尺一小格，这时测量的偏差会比较大。所以在实验中选用放大倍数比较大的物镜，在能清晰地观测菌体的情况下进行测量。

3．假设酵母菌是标准的椭球体，根据实验结果，试推算酵母菌培养液中酵母菌的体积含量 。

酵母菌长轴平均值 7.995×0.99μm＝7.92 μm

酵母菌短轴平均值 6.50×0.99μm＝6.44 μm

V酵母=4πabc/3(a=b为半短轴，c为半长轴）

      =4π×7.92 ×6.44² /(3×8)μm³

=172.04μm³

酵母菌体积含量=酵母菌细胞数/ml单个细胞体积=/ml172.04μm³=2.3%

八参考文献

1.       陈金春  陈国强  微生物学实验指导 清华大学出版社  2005

第二篇：实验五微生物显微计数和大小测量