实验二、黑曲霉发酵生产纤维素酶大实验
一、实验目的
1、了解纤维素酶的生产工艺和原理
2、掌握液体发酵和固体发酵工艺
3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理
二、实验原理
纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。
以羧甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力高低。还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。
三、材料与试剂配制
1、生产菌种：黑曲霉
2、斜面（活化）培养基：酵母膏0.4%，蛋白胨0.6%，可溶性淀粉1%，葡萄糖0.9%，马玲薯浸出液7%，琼脂2%，陈海水（或人工海水）配制，pH7.0-7.4。
3、人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO4·7H2 O = 7.0 g/L ;NH4NO3 = 1 g/L ;KCl = 0.7 g/ L ; NaH2PO4 = 2.0 g/ L ;Na2HPO4 =3.0 g/ L ,pH7.4。
4、微量元素液：FeSO4·7H2O 5.0mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L，ZnSO4· 7H2O 1.4mg/L，CoCl2 2.0mg/L，加蒸馏水200ml使之溶解。
5、液体发酵产酶培养基：麸皮作碳源3 g，氯化铵或硫酸铵作无机氮源1 g，蛋白胨0.05g作有机氮源，人工海水100 ml（含1%微量元素液），自然pH值。
6、固体发酵产酶培养基：麸皮：稻草粉=2：1作碳源5 g，人工海水12 ml（含1%微量元素液，1%氯化铵或硫酸铵，0.05%蛋白胨），自然pH值。
7、6% DNS试剂：称取酒石酸钾钠182g溶于500ml水中，加热溶解，于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6g，20.8gNaOH,5g苯酚，5g无水亚硫酸钠，加热搅拌溶解，冷却后定容至1000ml。储存在棕色瓶中放置一周后使用。（提前配制）
8、0.1 mol/L 柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液（pH 4.8）
0.1mol/L柠檬酸钠溶液100mL:称2.941克柠檬酸钠(柠檬酸钠的分子量为294.12)，约20L蒸馏水溶解后，转入100mL溶量瓶，定容至刻度。
0.1mol/L柠檬酸溶液100mL:称2.101克柠檬酸(柠檬酸的分子量为210.14)，约20L蒸馏水溶解后，转入100mL溶量瓶，定容至刻度。
pH4.8的柠檬酸钠—柠檬酸缓冲液100mL:量取0.1mol/L柠檬酸钠溶液54mL和0.1mol/L柠檬酸溶液46mL混合摇匀。
9 1%CMC-Na溶液
称取1.0克羧甲基纤维素纳，用pH 4.8的柠檬酸钠—柠檬酸缓冲液加热溶解。
10 1mg.mL-1标准葡萄糖溶液
1mg/mL葡萄糖溶液250mL: 准确称取无水葡萄糖250mg，溶解定容到250ml。
11、主要仪器：恒温培养箱，摇床培养箱，可见光分光光度计、冷冻离心机、电子天平等。
四、实验步骤
1、培养基配制
分别按上述方法配制液体发酵培养基和固体发酵培养基，121℃灭菌20分钟。
2、孢子悬液的制备：将斜面培养基上的曲霉孢子用少量无菌人工海水洗下，利用玻璃珠在磁力搅拌下搅拌15~20分钟，充分打散孢子，稀释成5x107个/ml左右的孢子悬液。
2、液体发酵产酶试验
按6%（v/v ）接种量将浓度约为5×10 7 个/ml的菌株孢子悬液接入已灭菌的液体发酵培养基（100 ml 锥瓶装液30 ml），于35℃、180r/min条件下摇床培养6天。发酵液4℃、5000 r/min离心15 min，上清液稀释10倍，测定发酵液中的酶活力。
3、固体发酵产酶试验
100 ml三角烧瓶装5g已灭菌的固体发酵培养基，按1:3(v/w)接种量将浓度约为5×10 7 个/ml的菌株孢子悬液，于35℃恒温培养箱中培养，接种48小时后隔天翻曲一次，第四或第五天补充无菌水保持基质水分。培养6天后，取发酵成熟曲1g，加蒸馏水10ml，搅拌均匀，30℃，浸提lh，双层纱布过滤，滤液经4℃，5000rmp离心15min，上清为粗酶液。测定时适当分级稀释，使OD540在0.2~1.0范围。
4、酶活力测定及酶活力定义
（！）葡萄糖标准曲线绘制
准确称取无水葡萄糖250mg,溶解定容到250ml。分别吸取此液1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 ml至5个25ml的比色管中，用蒸馏水定容到25ml(即加水24, 23, 22, 21, 20ml)
再分别吸取上溶液各2.5ml于比色管中（糖液分别含糖量为0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mg），各加2.5mlDNS试剂，煮沸5min。（对照管2.5ml水代替糖液，冷却，测定OD540。
表1 葡萄糖标准曲线绘制加样表
以糖含量为横坐标，A540为纵坐标，（或反过来）绘制标准曲线。
（1）内切葡聚糖酶 (CMCase) 酶活：取适当稀释的酶液0.5 ml，加入2.0 ml 1％ (W/V) 的CMC-Na溶液(溶于0.1 mol/L 柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液，pH 4.8)，60℃ 反应30 min，加入2.5 ml DNS 终止反应，沸水浴显色5 min，测定 OD540。以灭活酶液作对照。
（2）滤纸酶 (FPA) 酶活：取50 mg (1Χ 6 cm) 新华滤纸，加入酶液0.5 ml，再加入pH 4.8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液2.5 ml，50℃反应l h，其它同前。
酶活力定义：在上述反应条件下，每分钟催化底物水解生成1 µmol葡萄糖所需的酶量为 1个酶活力单位 (U)。
酶活力=
式中A为由标准曲线查得或回归方程算得的还原糖含量，mg。
五、实验记录
1.固体培养基：
6月20日接种 6月21日15点00分无现象 6月22日16点05分出现白色菌丝体 6月24日10点出现大量白色菌丝体和少量黑色孢子 6月25日8点出现大量黑色孢子，白色菌丝体比前天少些
2.液体培养基：
6月20日接种 6月21日15点00分无现象 6月22日16点05分液体颜色变深了 6月24日10点液体变稠、变黑、出现少量黑色孢子 6月25日8点出现大量黑色孢子
六、实验数据
1.葡萄糖标准曲线OD数据
2.酶活力测定OD数据
七、数据处理
实验数据：CMCase: OD540液体培养基=1.091 OD540固体培养基=0.497
FPA: OD540液体培养基=0.623 OD540固体培养基=0.695
又由y=2.5689x-0.0997 得x=(y+0.0997)/2.5689 解得：CMCase：x液体=0.463mg x固体=0.232mg
FPA： x液体=0.281mg x固体=0.309mg
因为酶活力= 则：
CMCase：液体酶活力=
固体酶活力=
FPA：液体酶活力=
固体酶活力=
八、结果分析
从实验整体看，实验还是成功的，不过还有不少方面存在问题：
1.由标准曲线中，R2=0.9715小于0.99，相关性较弱，可能在各种试剂配制不够准确以及实验操作不够规范。分析原因有：葡萄糖标准溶液定容操作出现失误，DNS的加入各个管存在误差，缓冲液配制不精确，测OD值实验操作不严谨。
2.为使固体发酵培养得菌种充分利用培养基需及时翻曲，能使其能在培养基的其他部位也长出菌落，提高酶产量。由于翻曲不充分，菌种只在培养基上部生长。
3.液体发酵培养时需在摇床上摇荡培养，菌体生长时能更有效率的利用营养物质，从培养结果看，菌种生长状况良好。
第二篇：发酵法生产中性纤维素酶
