目录
摘要.................................................. 2
1 引言................................................ 4
2材料与方法.......................................... 5
3 结果与讨论......................................... 10
4 总结............................................... 15
5 心得体会........................................... 15
参考文献............................................. 15
蛋白酶的发酵工艺研究
摘要 中性蛋白酶是最早被发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂，可用于皮革脱毛、软化、畜禽血液蛋白质水解、果酒、啤酒和饮料的澄清以及医学治疗等应用领域中。本文对一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌（AS1.398）的发酵条件进行了研究，考察不同因素条件下对产酶的影响。通过摇瓶培养研究碳源浓度，不同接种量对蛋白酶产量的影响。利用酪蛋白培养基的平板实验观察蛋白酶的性质。利用发酵罐培养观察时间对产酶的影响.结果表明:豆饼粉3.0g/100ml，玉米粉4.0g/100ml，麸皮粉2.5g/100ml，磷酸氢二钠0.4g/100ml，磷酸二氢钾0.03g/100ml，pH 7.2-7.4为最适宜培养基组分。并且发酵罐培养的产酶活性高于摇瓶培养。
关键词：中性蛋白酶； 枯草芽孢杆菌； 摇瓶培养； 发酵罐
The Fermentation Process Research of Protease
Abstract Neutral protease is the first to be discovered and widely used in industrial production of the protease preparation ,which can be used for leather hair removal, softening, animal blood protein hydrolysis, wine, beer and beverage clarification, and in applications such as medical treatment.The fermentation conditions of a Bacillus Subtilis（AS1.398） which can produce neutral protease were studied in this paper. Under the condition of different factors to examine the influence of enzyme production.This study discussed concentration of carbon source, different inoculum on protease yield by shake flask. Casein petri dishes has been used in the observation of the nature of the protease. Fermentation tanks culture was used for observing time's effection on the production of enzymes. the results showed that soybean meal 3.0g/100ml, corn flour 4.0g/100ml,wheat bran powder 2.5g/100ml,disodium hydrogen phosphate 0.4g/100ml,potassium dihydrogen phosphate 0.03g/100ml, pH 7.2-7.4 was the most appropriate medium composition. Enzyme production activity of Fermentation tanks culture was higher than shaking culture.
Keywords: Neutral protease；Bacillus subtilis；Shaking culture；Fermentation
1 引言
1.1 自然界中有大量产泌外蛋白酶微生物，其中以微生物的产酶活性最优。微生物来源蛋白酶一般按蛋白酶的最适pH值分为酸性、中性、碱性蛋白酶三类。中性蛋白酶最早被发现并广泛应用于工业化生产中。本实验采用枯草芽孢杆菌AS1.398做为研究菌株，其产酶量大，酶的耐热性好，因而被广泛应用于工业化生产中。此菌株在C/N为1:4左右时的产蛋白酶活性最高，并且有机N源优于无机N源，因而其发酵成本较高。探索新的发酵途径，寻找更加经济的组合方式显出了重大的意义。
1.2 此次实验主要做蛋白酶摇瓶发酵工艺的优化，改变发酵的C源浓度和接种量，测定蛋白酶酶活，以确定最优的发酵工艺条件。提取发酵液中的蛋白酶，测定酶活算出前后总活力，计算得率。并且进行发酵罐培养实验，比较发酵罐培养与摇瓶培养的产酶活性差异。通过此次实验学习蛋白酶的测定方法和发酵液酶蛋白的初步提取方法，考察不同发酵条件对微生物产酶的影响，以及熟悉小型发酵罐的使用方法，包括灭菌，清洗，加料，接种，取样等环节。
2 材料与方法
2.1 菌种
枯草芽孢杆菌（B.subtilis）AS1.398
2.2试剂
（1） 生理盐水：称取0.85g NaCl ,用蒸馏水定容至100ml, 即为0.85%生理盐水， 121℃灭菌20min。
（2）福林试剂（Folin试剂）:使用时加2倍蒸馏水稀释，即成已稀释的福林试剂。
（3）0.4mol碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠42.4g, 用蒸馏水定容至1000ml。
（4）0.4mol三氯乙酸（TCA）溶液:称取三氯乙酸65.4g,用蒸馏水定容至1000ml。
（5）pH7.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）31.2g,用蒸馏水定容至1000ml,即成0.2mol溶液（A液）。称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）71.63g,定容至1000ml,即成0.2mol溶液（B液）。
取A液28ml和B液72ml,再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液。
（6）2%酪蛋白溶液：准确称取干酪素2g，称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10ml，在水浴中加热使溶解（必要时用小火加热煮沸），然后用pH 7.2磷酸盐缓冲液定容至100ml即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。
（7）100µg/ml酪氨酸溶液：精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6ml1N盐酸使溶解， 用0.2N盐酸定容至100ml，其浓度为1000µg/ml，再吸取此液10ml，以0.2N盐酸定容至100ml，即配成100µg/ml的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。
2.3 培养基
（1）牛肉膏蛋白胨培养基（g/100ml）：牛肉膏0.5，蛋白胨1，氯化钠0.5， pH 70-7.2,121℃灭菌20min。
（2）酪蛋白培养基A（g/100ml）:牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，氯化钠0.5，奶粉5，琼脂2，pH7.2-7.4,121℃灭菌20min。
（3）种子培养基1：牛肉膏蛋白胨培养基。
（4）基本发酵培养基1（g/100ml）:豆饼粉3.0，玉米粉4.0，麸皮粉2.5，磷酸氢二钠0.4，磷酸二氢钾0.03，pH 7.2-7.4,121℃灭菌20min。
2.4 蛋白酶活力的测定（福林-酚法，ZBX66030-87）:
原理：福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质分子中含有酚基的氨基酸（如酪氨酸，色氨酸等），可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比；酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
酪氨酸标准曲线的绘制：取6支干燥试管编号，分别吸取不同浓度酪氨酸1ml,各加入0.4mol碳酸钠5ml,再加入已稀释的福林试剂1ml。摇匀置于水浴锅中。40℃保温发色20min,再用721型分光光度计进行测定（波长660nm）。
表一 标准曲线绘制加样
蛋白酶活力测定：试管中加入0.1 M pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液稀释后的酶液1 ml， 40℃预热5 min，加入预热过的pH 7.2的2.0%酪蛋白1ml，摇匀，在40℃水浴中准确反应10 min。用2 ml TCA 终止酶反应，静置10 min。过滤后取1ml滤液，加入0.4 mol 碳酸钠5ml，再加入已稀释的福林试剂1ml。空白试验测定方法同上，唯有加酪蛋白之前先加0.4 mol三氯乙酸2ml,使酶失活，再加入酪蛋白。
蛋白酶酶活力单位的定义：在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1µg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。
蛋白酶活力（µ/ml）=A*4*N/10
式中：
A——由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；
N——酶液稀释的倍数；
10——反应10min.
2.5 实验步骤
2.5.1 摇瓶培养
（1）种子培养：在无菌条件下自斜面菌种挑取一环菌体，接入装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，在30±1℃振荡培养12-16h。
（2）涂平板：取种子培养液1ml，用无菌生理盐水稀释，取10-5，10-6稀释度，涂布在酪蛋白培养基平板上。每个稀释度涂2套平板，每套平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃凃棒均匀地涂满整个平板表面。
（3）发酵培养：按1%的接种量，将种子液接种到发酵培养基中，振荡培养72h。
（4）蛋白酶摇瓶发酵工艺优化：改变发酵的某一条件，如碳源种类，氮源种类，C/N，pH，装液量，接种量等，测定蛋白酶酶活，以确定较优的发酵工艺条件。
（5）提取：将培养物合并，抽滤除菌体，取30ml滤液测定的蛋白酶酶活，算出总酶活 。向滤液加入硫酸铵使浓度达饱和，静置过夜，过滤得湿固体（初步提取物），称重后溶解于30ml磷酸缓冲液，测定酶活，算出总酶活。
2.5.2 发酵罐发酵
（1）种子培养：在无菌条件下自斜面菌种挑取一环菌体，接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，在30±1℃振荡培养16-18h。
（2）接种：将浸有酒精的脱脂棉围绕在接种口周围，点火打开接种口，将种子培养液注入。接种量为1%-5%，盖好接种口，调节搅拌转速至所需数值，培养开始。
（3）取样：为了解培养过程中的变化，需定时取样进行样品分析。由于罐内为正压，打开取样管时，样品自然流出。取样时应将上一次残留在取样管中的培养液去除后再取样。另外，取样后应通过加热蒸汽，以防取样管路污染杂菌。
（4）培养结束：将电极与培养液全部取出，发酵罐冲洗干净。
3 结果与讨论
3.1 酪氨酸标准曲线
在λ=660nm 时,酪氨酸浓度在20~100ug/ml 范围内，线性关系良好。标准曲线见图1。
图1 酪氨酸标准曲线
3.2 发酵工艺研究
3.2.1 碳源浓度对发酵的影响
采用50ml基本发酵培养基的摇瓶培养，通过改变豆粉含量来改变碳源浓度，以研究浓度对发酵产蛋白酶的影响。测定发酵液蛋白酶活力，以酶活力高低作为指标，以初始发酵培养基的酶活力作为对照。
图2 碳源浓度对产酶的影响
注：1 豆饼粉浓度为2.4g/100ml；2 豆饼粉浓度为3.0g/100ml；3 豆饼粉浓度为3.6g/100ml。
从图2可以看出，豆饼粉浓度为3.0g/100ml时，枯草芽孢杆菌的产酶活性最高。豆饼粉浓度为2.4g/100ml时，由于碳源量不足，限制了菌体生长，因而导致产酶量较低。豆饼粉浓度为3.6g/100ml时，碳源量充足，导致C/N升高而限制了产蛋白酶的活性，故而，最适豆饼粉浓度为3.0g/100ml为产蛋白酶的最适宜浓度。
3.2.2 接种量对发酵的影响
将种子液以1%，2%，3%分别接种到50ml基本发酵培养基上，摇瓶培养，测定酶活。
图3 接种量对发酵的影响
注：1 接种量1%；2 接种量2%；3 接种量3%。
由图3可以看出，接种量对发酵的影响不大，图中显示由1%~3%接种量，菌株的产蛋白酶活力逐渐增加，未达最大值。
3.2.3 发酵罐培养
按2.5.2所述方法进行发酵培养
图4 发酵罐培养时，随时间变化对产酶的影响
注：1 24小时；2 42小时；3 48小时。
由图4可以看出，前24h发酵产酶活性很低，这主要是由于接种后24h发酵罐中主要发生菌体生长的反应，蛋白酶是生长偶联型产物，此时产量很低。到48h达到高点，蛋白酶积累量很高。
3.2.4 蛋白酶的提取
按2.5.1（5）所述方法进行酶的提取，结果如下：
表二 酶蛋白提取得率
3.2.5 平板实验观察蛋白酶性质
取种子培养液不同稀释度10-1 ~10-6分别接种于平板上，30oC培养48h观察平板上的透明圈。
图5 10-5稀释度下的透明圈
图6 10-6稀释度下的透明圈
图5、6平板所用培养基为酪蛋白培养基，枯草芽孢杆菌AS1.398由于能产生泌外蛋白分解酪蛋白而出现透明圈。
4 总结
本实验对一株产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌进行性质研究，对C源浓度及接种量进行单因素实验。结果表明，最适宜豆饼粉浓度为3.0g/100ml,最适接种量为3%。通过比较发酵罐培养实验与摇瓶培养实验发现，发酵罐培养产中性蛋白酶的能力强于摇瓶培养。这是由于，发酵罐培养的传质与溶氧条件优于摇瓶培养。
5 心得体会
此次实验由于时间和条件的限制，并不能对影响发酵产酶的所有因素进行单因素试验，因而局限了实验结果的利用价值。通过此次实验我系统的认识到，做发酵条件优化实验的具体方法和步骤，以及注意事项。并且初步掌握了蛋白酶酶活测定和蛋白酶提取的方法。对小型发酵罐的使用积累了一定的知识。总的来说，此次实验收获颇丰。
参考文献
[1] 王海洪,吴汉民. 枯草芽孢杆菌AS1.398 制备中性蛋白酶的研究.浙江水产学院学,1996（9）:179-183
[2] Takii,Yukio;Urata,Yoshimi.Themmostable neutral protease
resembling thermolysin derived from bacillus brevis MTB001.
Noriko Biosci, Biotechnol. Biochem. 1998,62(5):1028-1030
[3] 朱俭等.生物化学实验. 上海:上海科学技术出版社,1981.
[5] 陈名洪, 济琛, 邱宏端, 等. 豆粕的微生物发酵降解[J]. 中国农学通报,2008, 24(1): 307- 311.
[6] 夏宁, 高媛, 迟玉杰. 蛋白酶水解低温豆粕制备大豆寡肽的研究[ J] .食品工业科技, 2008, 29(1): 171- 175.
[7] 姚小飞, 石慧. 大豆多肽的营养及开发应用进展[J] . 中国食物与营养,2009(7): 44- 46.
[8] 李泰明，徐秀兰. AS1. 398 中性蛋白酶固定化条件的初步研究. 药物生物技术，1998,5(4):214-218
[9] 唐兵，周林峰，陈向东等. 嗜热脂肪芽抱杆菌高温中性蛋白酶的产生条件及酶学性质.微生物学报, 2000，(40):188-192