纸层析法分离氨基酸

一、     前言

1、分离氨基酸的主要方法：

 (1) 离子交换法，根据氨基酸是两性电解质这一特征,以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值的差异,利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化。离子交换法的分离步骤主要包括树脂的处理、装柱、平衡、加样、洗脱等步骤. 离子交换法也有自身的局限性，由于离子交换法是利用氨基酸等电点的不同，所以当两个或者多个氨基酸的等电点相近时，便无法分离，另外，氨基酸在树脂当中扩散速度较快，就要求料液的流速也相对较慢，这样自然造成了分离的缓慢，离子交换本身的生产原理也决定了反应难以连续还进行，这给工厂自动化生产带来影响，难以大规模地推广。

(2) 沉淀法，沉淀法是历史最悠久的分离纯化方法，目前仍在工业上发挥着重大的作用。氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。沉淀法原理是根据某些氨基酸可以与某些有机或者无机化合物结合而形成沉淀，可以利用这种性质向溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸沉淀，与其他氨基酸分离，在分离后再将氨基酸与沉淀剂分离即可。

现在较为成熟的分离方法有精氨酸与苯甲醛在低温条件下，缩合成溶解度小的苯亚甲基精氨酸，从而析出沉淀，析出的沉淀用盐酸处理即可分离得到目标氨基酸精氨酸的盐酸盐；亮氨酸与邻-二甲苯-4-磺酸反应，可生成亮氨酸的磺酸盐。沉淀法的优点是方法简单，选择性强，但是缺点同样明显，沉淀剂回收困难，造成废液排放污染加剧。

 (3) 萃取法，萃取法主要包括反应萃取法、溶剂萃取法、反向微胶团萃取、液膜萃取法等。其中，反应萃取法是选择适当的萃取剂，使萃取剂解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应，生成可以溶于有机相的物质，从而使氨基酸从水相进入有机相，进而分离氨基酸。溶剂萃取法，由于氨基酸是离子型化合物，氨基酸在物理萃取时难以高效提取的，因此常用化学发来萃取氨基酸。

(5) 电透析，由于氨基酸拥有不同的等电点，故可以通过控制溶液的PH值，使氨基酸带有正负电荷，即当PH大于等电点时，带有负电荷，将氨基酸放置在电场中，会带上负电，并且移向正极，相反，PH值小于等电点时，则带上正电荷，氨基酸向负极移动。电透析主要有毛细电透析等方法，通过这种方法可以高效而精确地分离氨基酸。

2、纸层析法的优缺点：

（1）优点：操作简单，便于掌握； 显色均匀，便于定量和半定量分析。

(2)缺点：显色剂印三酮要现配，且易被空气氧化，显色后很快就会褪色。Rf值得大小与物质的结构性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度有关。

二、实验目的

1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸上层析的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色、鉴定）

2、学习未知样品的氨基酸成分（水解、层析及鉴定）分析的方法

三、实验原理

1、纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两想间不断分配而得到分离。

2、溶质在滤纸上的移动速度用比移Rf值表示

3、Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

4、在一定条件下的某种物质的Rf值是常数。Rf值得大小与物质的结构性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸上层析法分离氨基酸。

四、实验材料与试剂

1、实验试剂:

a.氨基酸标准溶液（1mg/ml）亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准溶液

b.80%甲酸

c.0.1%印三酮丙酮溶液

d.氨基酸混合液（每种氨基酸500mg/ml）

e.正丁醇

2、实验器材：

a.新华滤纸

b.培养皿

c.电热鼓风干燥箱

d.吹风机

e.毛细管

f.针线尺

g.钟罩

五、实验操作

A、滤纸：选用国产新华1号滤纸，6cm×7cm.在距滤纸2cm处划线，用铅笔在标四个点作为点样位置（留出缝线空间）。

B、点样：点样要合适，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这样样品就会自动流出。点样的扩散直径应控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再滴第二滴。

将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状，注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。

C、展层：将揉成筒状的滤纸放入培养皿中（注意滤纸不要皿壁），当溶剂层展至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置

酸溶剂系统：正丁醇:80%甲酸：水=15:3:2（体积比），印三酮2ml，温度25℃，时间1h.

注意：使用的溶剂系统需新鲜配置，并要摇匀。

D、显色：待展层基本结束后，置于65℃烘箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色或黄色斑点。

E、Rf值的计算：用尺测量显色斑点的中心与原点的之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，记得氨基酸的Rf值。

六、注意事项

使用印三酮显色时，必须在整个过程中避免用手直接接触层析纸，因为手上常常含有少量的含氮物质。显色时它也显现出紫色斑点。污染了层析结果，因此在操作过程中应戴橡胶手套或指套。同时也要防止空气中的氮。

七、数据处理

混合氨基酸中有三个显色斑点，颜色分别是紫红、黄色、紫红。斑点中心距原点分别为2.0cm,3.7cm,6.5cm.

而亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸与印三酮反应后显色正是紫红、黄色、紫红，再根据他们斑点中心到原点的距离，因此可以判断出混合氨基酸中含有亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸。

八、思考与讨论

1、结果分析:滤纸斑点显色明显、清晰，无污点，实验结果理想，能准确、快速地计算出各种氨基酸的Rf值和判别出混合氨基酸的成分。2、思考题:

a.为什么展层有时用两种溶剂系统，有时用一种溶剂系统?

答：有些化学成分在不同的极性下的溶解度不同，在层析中一样，只有不停变换极性，才能使不同的化学成分从混合物中分离出来。

b.酸性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离有何影响？

答：有利于氨基酸的碱式电离，不利于氨基酸的酸式电离。

c. 酸性溶剂系统对Rf值的影响？

答：极性方面，溶剂极性增加，物质的Rf变大。增加酸碱，也就是增大了溶剂的极性。从而提高物质的Rf。PH值影响，氨基酸的解离度与PH 有关，解离度越大极性越强，极性强的物质在两相分配时，偏向极性的一项。氨基酸解离度越大，Rf越小。你往溶剂系统中对于加入碱，对于酸性氨基酸来说，羧基会更多的解离，自然Rf降低（这个效果会很明显）。而对于碱性氨基酸的盐溶液来说，解离度降低，Rf增大。你往溶剂加酸，对于酸性氨基酸来说，羧基变化不大，氨基接受质子更多解离，Rf降低。对于碱性氨基酸，解离度增大，Rf也减小。

d.什么是分配系数？

答: 在平衡状态下，组分在固定液与流动相中的浓度之比。

九、参考与致谢

1、参考文献:生化实验教材、学长准备的ppt，百度文库，《氨基酸分离和提纯方法及运用》、《几种分离氨基酸方法的比较》

2、感谢:本次实验的成功除了本人课前认真的预习和做实验时准确无误的操作，还离不开老师的细致讲解和不断提醒，学长准备好的实验材料和仪器，还有郭月山同学在划线时的帮助，尚情情同学的缝线帮助。再次，一并致谢！

 

实验名称：纸上层析分离氨基酸

班级：生物工程131                       指导老师：吴兰

实验者：张文波                           学号:5602211016

实验日期：2014.10.28

南昌大学

第二篇：纸层析法

纸层析法

植物叶绿体中色素的提取与分离

用具：剪刀一把、干燥的定性滤纸、50ml的烧杯及100ml的烧杯各3个、白纸3张、试管架一个、研钵一个、玻璃漏斗一个、尼龙布或纱布、毛细血管一只、药勺一个、10ml量筒一只，天平一只，试管3支、纸板一块、棉塞3个、培养皿3个、刻度尺、注射器一只、盖玻片

试剂：无水乙醇（或丙酮）、层析液（20份石油醚、2份丙酮、1份苯配置而成）、二氧化硅、碳酸钙（或碳酸钠）

材料：新鲜的菠菜叶、青菜叶、大叶黄杨叶片

背景资料：

1、 叶绿素等是脂溶性的有机分子，根据相似相溶的原理，叶绿素等色素分子溶于有机溶剂而不溶于有极性的水。故在研磨和收集叶绿色素时要用丙酮或乙醇等有机溶剂而不用水。

2、 叶绿素分布于基粒的片层薄膜上，加入少许二氧化硅是为了磨碎细胞壁、质膜、叶绿体被膜和光合片层，使色素溶解于无水乙醇等溶剂中。即，加入少许二氧化硅（石英砂）是为了使磨碎充分，释放出色素。

3、 破碎的细胞中含有草酸等有机酸，叶绿素分子中含有的Mg元素处于不稳定化合态，镁离子与有机酸结合将导致叶绿素分子破坏。加入少许碳酸钙使得钙离子与有机酸结合，减少镁离子的转移，防止研磨时叶绿体色素的破坏。所以在研磨时加入适量的碳酸钙保护色素（叶绿素），同时加入碳酸钠的道理亦如此。

4、 在过滤时选用脱脂棉或纱布，而不用滤纸。原因主要有下：（1）色素分子比较大，不容易透过滤纸； （2）滤纸有较强的吸附性而使色素吸附在滤纸上，从而降低色素浓度，影响实验效果；（3）叶绿素是脂溶性，根据相似相容的原理，脱脂棉可以减少实验过程中色素的流失，增强实验效果。

5、 根据物理学中的毛细现象，画滤液细线前，滤纸必须经过干燥处理，是为了阻止水分子堵塞滤纸中的毛细管而影响层析液的扩散。但如果用火烤的话，会使滤纸纤维变形同时破坏啦毛细管，而影响层析液的扩散。要自然阴干。为了使滤液细线处的色素足够，画滤液细线要重复多次，以积累足够的色素。否则，色素带颜色浅。
6、 由于液面的不同位置表面张力不同，纸条接近液面时，纸条边缘的表面的张力较大，层析液沿滤纸边缘扩散过快，而导致色素带分离不整齐的现象。故而，插入层析液的滤纸条一端要剪去两个角。

7、 为了防止滤纸条倒入层析液中而使层析实验失败，层析液要低于滤液细线。同时，防止因液体表面张力引起层析液沿滤纸条向上的“壁流”而导致色素溶解。

8、 色素分离的原理：纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次就有一次的分配。结果分配比（溶解度）比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，这样，试样中各组分就分别聚集在滤纸的不同位置，从而达到分离的目的。

纸层析法 相关链接：

概念

纸层析法又称纸色谱法。以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。

 

 用途

通常可用于叶绿素的色素成分检验，氨基酸的鉴定及测定，橘皮精油成分检验及一些特定细胞筛查等实验。

原理

纸层析法依据极性相似相溶原理，是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各物质分配系数不同，因而扩散速度不同，从而达到分离的目的。

试样经层析后可用比移值（Rf）表示各组成成分的位置（比移值=原点中心至色谱斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离之比），由于影响比移值的因素较多，因此一般采用在相同实验条件下对照物质对比以确定其异同。作为单体鉴别时，试样所显主色谱斑点的颜色（或荧光）与供置，应与对照（标准）样所显主色的谱斑点或供试品-对照品（1∶1）混合所显的主色谱斑点相同。作为质量指标（纯度）检查时，可取一定量的试样，经展开后，按各单体的规定，检视其所显杂质色谱斑点的个数或呈色（或荧光）的强度。作为含量测定时，可将色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测定，也可用色谱扫描仪测定。

 应用

应用及实例介绍

在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。在做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液（石油醚）混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。

纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢；含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。

注意事项

纸层析法中所用的有机溶剂如丙酮等，一般有挥发性、并有一定毒性，使用时要注意密封层析，避免吸入过多有害挥发物。

 实验

仪器药品

大试管 台天平研钵(配带孔纸板,防止丙酮挥发) 量筒 烧杯 漏斗  软木塞 滤纸 丙酮（可用无水乙醇替代） 四氯化碳 无水硫酸钠 碳酸钙 石英砂

操作步骤

1．称取新鲜叶子2g，放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙(防止叶绿素被破坏）和石英砂（帮助研磨），研磨成匀浆，再加丙酮5ml，然后以漏斗过滤之，即为色素提取液。

2．取准备好的滤纸条（2×20cm），将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm，宽约0.5cm的窄条，并在滤纸剪口上方折叠出一条直线，作为画滤液细线的基准线。

3．用毛细吸管沾少许滤液在折线上描绘4~5次，注意要画得匀、直、细，每次画完细线要等其自然变干后再画第二根线。 4．在大试管中加入四氯化碳3梍5ml及少许无水硫酸钠（即层析液）。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中（色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析。

经过0.5—1小时后，观察分离后色素带的分布。最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿素b。