离体蟾蜍心脏灌流

【摘要】将蟾蜍的心脏完整离体，插入挖心套管，分别用氯化钠，氯化钾，氯化钙，肾上腺素和乙酰胆碱处理，可观察到不同药物对心脏的影响。氯化钠，氯化钾与乙酰胆碱均使心搏减弱，氯化钙与肾上腺素能加强心脏收缩力和心率。

【实验材料】

动物：中华蟾蜍

试剂：5%氯化钠溶液；1%氯化钾溶液，2%氯化钙，任氏液（Ringer’s solution），1：100000肾上腺素溶液，1：100000乙酰胆碱溶液，任氏液

器材：蛙类手术器械，BL420E+生物机能分析系统，张力换能器，蛙心套管，试管夹，滑轮（杠杆）

【实验内容】

1.离体蟾蜍心脏的制备
(1)取一蟾蜍毁其脑和脊髓，仰位固定于蛙板上，暴露心脏。
(2)心脏插管 分支前的主动脉下穿一线并打一松结备用 ，左侧主动脉穿一根线并结扎之，用左手提起结扎线，右手用眼科剪在左侧主动脉距分叉部3mm处剪一“V”型口。将盛有少量任氏液的蛙心套管(用拇指将套管堵住，以防套管中的任氏液流出)从“V”型口插入动脉球底部，然后稍后撤套管，再转向心室中央方向插入，可见液面随心搏升降即可。将分支前主动脉下的松结扎紧，并固定在套管的小突上。小心提起套管和心脏，剪断主动脉左右分支；结扎与静脉窦相连的后腔静脉，并在结扎线以下剪断，将心脏摘出。
2.观察项目
(1)开启系统，描计一段正常心搏曲线。注意观察心跳频率和强度以及心脏的收缩、舒张程度。
(2)向蛙心套管内滴加5%NaCl溶液，观察心跳变化。
(3任氏液洗脱，待心跳恢复，加入2%氯化钙溶液1～2滴，观察心跳变化。
(4)任氏液洗脱，待心跳恢复，加入1%氯化钾溶液1～2滴，观察心跳变化。
(5)任氏液洗脱，待心跳恢复，加入1:100000肾上腺素溶液2～3滴，观察心跳变化。
(6)任氏液洗脱，待心跳恢复，加入1:100000乙酰胆碱溶液1～2滴，观察心跳变化。

【实验结果】

加入各种药品后心脏心搏曲线变化如图所示

图一：NaCl对心脏的影响

图二：Kcl对心脏的影响

图三：CaCl2对心脏的影响

图四：肾上腺素对心脏的影响

图五：乙酰胆碱对心脏的影响

【实验讨论】

1、滴加氯化钠溶液，心跳显著减弱。

心肌细胞的收缩对细胞外的浓度有很高的依赖性，因其是触发心肌质网释放的关键。当在任氏液中滴加氯化钠时，Na+与内流的竞争性抑制导致内流减少，心肌的收缩活动也随之减弱。

若细胞外离子浓度低至接近零时，虽然心肌细胞仍能产生动作电位，但没有 的内流，不能引起收缩。即“兴奋-收缩脱耦联”。

2、滴加氯化钾溶液后，心跳减弱至停止

本实验所用的氯化钾浓度对于蟾蜍体液来讲属于较高浓度，而细胞外K+浓度较高时K+与   有竞争性拮抗作用，K+可抑制细胞膜对的转运，使进人细胞内减少，心肌的兴奋一收缩耦联过程减弱心肌收缩力降低。且当细胞外K+浓度较高时，膜内外的K+浓度梯度减小，静息电位的绝对值过度减少，Na+通道失活，心肌的兴奋性完全丧失，心肌不能兴奋和收缩，停止于舒张状态。此时，仅由 来构成动作电位，钙通道激活慢，因此去极化上升幅度小而缓慢，使兴奋传导性降低。
而当K+浓度增高值不大时，由于膜对K+的通透性较大，静息电位主要由细胞内外K+浓度差决定，当K+浓度稍升高时，静息电位升高，与阈电位差值减小，使细胞兴奋性增加。当细胞外K+浓度升高时,细胞膜对钾的通透性升高,心室肌细胞复极过程加速,平台期缩短,不应期也缩短。均能增加工作细胞的收缩舒张速率。

3、滴加氯化钙溶液中，离体蛙心收缩力显著增强

首先浓度上升，内流增加，导致心肌质网释放量增加，使心肌收缩力增强。

内流是慢反应细胞（如窦房结P细胞）0期去极化和快反应细胞（工作细胞）2期的主要离子活动.当细胞外浓度升高时，内流加快,慢反应细胞0期去极化加快加强，传导性升高。

当肌浆中的浓度不断升高，与肌钙蛋白结合数量不断增加，甚至达到只结合不解离的程度，于是，心肌将会处于持续收缩状态，称为“钙僵”。

但同时，浓度上升，与Na+内流竞争性抑制作用使得Na+内流降低，从而触发Na+快速内流产生0期去极化就比较困难,使阈电位上升，与静息电位的差距增大，兴奋性降低。发生兴奋后，Na+内流的抑制则导致0期去极化速度和幅度降低,传导性下降。

4、滴加肾上腺素后，蛙心收缩增强

在心肌细胞起作用的主要是去甲肾上腺素。去甲肾上腺素与心肌细胞膜上的β肾上腺素受体结合,激活腺苷酸环化酶(AC),使细胞内cAMP浓度升高,激活PKA和细胞内的蛋白质磷酸化过程,使心肌细胞膜上的钙通道激活，动作电位平台期Ca2+内流增加，心肌收缩力增强。另外去甲肾上腺素能加强4期的内向电流If,对浦肯野细胞影响较大，使心率加快。

另外，肾上腺素还能降低肌钙蛋白与亲和力，促使肌钙蛋白对的释放速率增加，导致了心肌细胞收缩能力的增强。肾上腺素也能提高肌浆网膜摄取的速度，刺激Na+— 交换使复极期向细胞外排出的作用加速。提高了工作细胞的收缩舒张速率，因此不会出现钙僵，收缩是完全的。

5、滴加乙酰胆碱后，蛙心活动减弱

滴加乙酰胆碱后，强见蛙心收缩减弱，心率减慢。最后，心跳停止于舒张阶段。

乙酰胆碱可与心肌细胞M受体结合，能提高心肌细胞膜钾离子通道的通透性，促使钾离子外流，对窦房结细胞来讲，复极时钾离子外流增多，最大复极电位绝对值增加，Ik衰减过程减弱，自动去极化速度减慢。导致窦房结自律性降低，心率减慢。（2）复极过程中K+外流增加，动作电位2、3期缩短，钙离子进入细胞内减少，使心肌收缩力减弱

乙酰胆碱还能直接抑制钙离子通道，减少钙离子内流，使心肌细胞收缩减弱。

       6.心脏收缩主要与前负荷，后负荷以及心肌细胞收缩能力有关，因此凡是影响以上活动的因素均能影响心脏收缩力。

（1）前负荷：

前负荷主要取决于心室舒张末期容积，而其与心室舒张末期压力在一定范围内有良好的相关性，因此可用心室舒张末期压力来反映。对于离体的蟾蜍心脏，其心室舒张末期压力主要取决与灌流液柱产生的压力，因此灌流时每次液面的高度要保持一致，以保证其前负荷的相对稳定。本次试验中会出现换液前后正常的心搏曲线其收缩力不一致，可能就是受液面高度不一致的影响。

心肌细胞通过异长调节对搏出量进行精细、小幅度的调整，使心室射血量与静脉回心血量保持平衡，以适应静脉回流的变化。在实验过程中，可能会涉及离体蟾蜍心脏的异长调节，但是由于灌流液体量的影响可能已经超出异长调节所及范围，因而其效果并不明显。

（2）后负荷：对于心脏来讲，大动脉血压是心室收缩时的后负荷。对于离体的蟾蜍心脏，后负荷实际也取决于灌流液面压强，因为心室要将液体泵出，克服的就是灌流液产生的压力。这也说明保持灌流液面一定高度的重要性。

（3）心肌收缩能力：对心肌来讲，凡是能影响兴奋-收缩耦联过程中各个环节的因素都可以影响收缩能力。其中霍华德横桥数目和肌球蛋白头部ATP酶的活性是影响心肌收缩能力的主要环节。活化横桥数目的多少取决于兴奋时胞质内浓度和肌钙蛋白对的亲和力。因此，当增加细胞外浓度时，内流增加，触发肌质网钙释放增加，可以增加心肌活化横桥数目，使心肌收缩能力加强。肾上腺素或去甲肾上腺素在激动心肌细胞的β肾上腺素能受体后，可通过cAMP转到途径，激活细胞膜上的L型钙通道，是   内流增加，从而达到与增加   浓度相同的效应。

（4）凡是能影响细胞内浓度的因素，均能影响心肌的收缩性。如细胞外浓度增加，肾上腺素导致的内流增加，Na+或K+导致的细胞外内流减少，乙酰胆碱增加K+外流缩短2,3期，抑制钙通道开放导致内流减少，其实质都是影响了心肌细胞内肌质网的释放而影响心肌的收缩性。

7.心脏功能另一个重要的衡量参数是心率。心率主要决定于心脏起搏点的自律性。主要取决于自律细胞4期走动区计划的速率，也受最大复极电位与阈电位之间的差距的影响。因此从各种药物对心肌细胞的作用来看，凡是影响4期自动去极化速率和最大复极电位与阈电位之差的药物均能对心率产生一定影响。如乙酰胆碱等。

8.另外，工作细胞（心房肌心室肌）的去极化复极化过程若加快，也能加强心率。而心肌细胞传导性强，也同样能起到加快心率的作用。

第二篇：在离体蟾蜍心脏恒压灌流装置的研制与应用

辽宁省高等教育教学成果奖

成果总结报告

成果名称   在/离体蟾蜍心脏恒压灌流装置  

的研制与应用

          成果完成人     赵润英李大满陈魁敏郝伟    

          成果完成单位    沈阳医学院机能中心实验室     

          申请等级           二等奖               

          申报时间         2008.12.10               

          成果科类             10                  

          代       码           1001221               

             学校网址     http://www.symc.edu.cn/         

辽 宁 省 教 育 厅 制

成果总结报告

赵润英

（沈阳医学院机能中心实验室）

“在/离体蟾蜍心脏恒压灌流装置”是根据我院机能实验学综合性实验项目－“蟾蜍心脏功能实验”的实际需要，由机能中心实验室主任赵润英教授带领李大满、陈魁敏、郝伟等同志一道，历时一年半的时间，于20##年5月共同研制成功的，具有功能齐全、使用方便、节省空间、安全环保、美观大方等特点的机能学实验装置。该装置以其“四位一体”结构的创新性设计和完整的功能体现填补了国内空白，于20##年10月获得国家实用新型专利证书。我们在两年的时间里，对2个年级共40个本科班学生综合性实验项目－“在体蟾蜍心脏功能实验”进行了新旧实验装置使用情况的对比研究。结果显示：使用新装置的实验成功率从62%提高到95%，蟾蜍用量平均每年减少120只，营养液用量平均每年节省8，000ml。同时英文班学生在自行设计并付诸实施的16个探索性实验项目中，有4个项目应用了该装置，为学生进行探索性实验提供了良好装置和手段，对“机能实验学探索性实验的研究与实践”（学院教改课题）的研究起到了积极地推动作用。

一、“在/离体蟾蜍心脏恒压灌流装置”研制的目的和背景

“在/离体蟾蜍心脏恒压灌流装置”研制的目的是为机能实验学综合性实验项目－“蟾蜍心脏功能实验”提供一种良好的实验装置或实验手段，提高实验成功率和准确率，提高实验教学水平，节约实验成本（实验动物和实验材料）。

我院于20##年本着优化组合、资源共享、高效运转的原则，将原机能学科教研室所属的生理、病理生理、药理三个实验室合并重组建立了机能中心实验室，并于20##年开展了辽宁省“十五”规划项目－“基础医学生理、药理与病理生理（三理）实验课整合的探索与实践” 这一实验教学改革的研究。该项研究将生理、病生和药理学实验教学内容进行了有机融合，构建了以基础性（验证性）、综合性、探索性（设计性）实验为主要内容的、新的课程体系，建立了“机能实验学”这门基础医学领域全新、独立、系统、跨学科、多层次的综合性实验学科（20##年被评为我院唯一实验教学系列“院级精品课程”）。综合性实验是学生运用“三理”理论知识，对动物给药前的生理指标、给药后的药理作用和对病理模型的治疗作用进行观察和分析，这是最能反映机能学科“三理”实验整合特点的实验项目。探索性实验是指学生经过基础性、综合性实验的学习，在掌握了机能实验学基本知识和基本操作技能的基础上，实施的一种模拟科研过程的实验教学项目，旨在加强对学生进行综合运用知识能力，观察、分析和解决问题能力，科研和创新思维能力等综合素质的培养。

“在/离体蟾蜍心脏功能实验”是各医学院校机能实验课综合性实验项目之一，但却没有统一成熟的实验装置可供利用，绝大多数都是东拼西凑的，其根本的问题在于①散在的装置与其他多种物品（心脏恒压灌流装置、生物机能实验系统、计算机、打印机、手术器械、手术板、动物、药品等）摆放一起极易刮碰，而且多条管线纵横交错、杂乱无章；②装置的恒压状态难以准确控制；③改变后负荷及调整换能器方位的操作十分麻烦；④实验成功率低。而我们的旧装置①没有前负荷固定装置，只能把输液瓶挂在置于地面的医用滴流架上；②没有后负荷固定装置，只能把绑在铁块上的输出管放在堆砌的积木上；③张力换能器则固定在独立的三角支架上（见佐证材料之照片）。当时实验成功率低使学生产生了极大的不满情绪，同时也成了困扰任课教师的一大难题。解决这一问题迫在眉睫。

二、“在/离体蟾蜍心脏恒压灌流装置”的研制过程

面对“三理”整合后的综合性实验项目－“蟾蜍心脏功能实验”成功率低，学生满腹怨言、教师满腹牢骚的困难局面，加之市场上没有成熟的现成装置可供购买的现实，赵润英主任提出了走自主研发的道路，自行研制一种能够满足实验功能需要，操作简单灵活，能够节省摆放空间、安全环保的“蟾蜍心脏功能实验”装置的想法，该想法得到了上级主管部门－基础医学院张忠、王杰、吴敏范等领导的大力支持，同时还得到了广大授课教师的广泛赞同。

在进行了深入调研（查阅了大量文献资料，考察了中国医科大学、南方医科大学、广州医学院等多所医学院校的机能学实验室实验装置的使用情况）以后，根据“蟾蜍心脏功能实验”的原理，在保证使用功能的前提下，首先提出了 “保证功能、操作简单灵活准确、节省空间、安全环保”的理念，确定了“新装置”“四位一体”结构的原则，即把固定构件、灌流系统、描记系统和手术板等四种结构有机地融合为一体。这种构想，得到了我院药理教研室王俊平教授、南方医科大学机能中心金春华教授等专家的认可。其次经反复筛选最终选择有机玻璃作为装置的主材，并将制造业中螺接”与“胶结”的工艺技术运用其中，最终研制出“在/离体蟾蜍心脏恒压灌流装置”，并使其创新性、实用性、示范性得到了充分体现，为开展机能实验教学综合性和探索性实验提供了先进的、科学的、有效的手段和方法，从根本上解决了“蟾蜍心脏功能实验”实验成功率过低的难题。在此期间，李大满、陈魁敏和郝伟同志全程参与了“在/离体蟾蜍心脏恒压灌流装置”的研制工作，从选材到尺寸设置、从技术到工艺、从制作到组装，期间经历了了太多的思考、试验、成功与失败，付出了大量的汗水和辛劳。

三、各界对成果的评价及成果的与推广

“在/离体蟾蜍心脏恒压灌流装置”研制成功并投入使用后，任课教师再也不用为“蟾蜍心脏功能实验”成功率过低、学生怨声载道而烦恼了，认为我们 “真是干了一件大好事”。学院院长肖纯凌教授在看了我们的这项研究成果后，说：“这种做法值得提倡，搞自主研发，既实用又省钱”。

在20##年9月国家教育部对我院教学水平评估、20##年12月辽宁省教育厅对机能中心实验室复评、20##年5月辽宁省实验教学示范中心评审期间，部分专家专门考察了这套装置及装置的应用情况，给予了高度的评价，并充分肯定了它的示范性和推广价值，一再鼓励我们要将成果市场化，以取得一定的经济效益和社会效益。另人欣慰的是长春医学专科学校基础部主任和鞍山师范大学附属卫生学校药理教研室主任在参观我院机能中心实验室时，对该套装置产生了浓厚的兴趣，目前两所学校正与我院国有资产处就购买“在/离体蟾蜍心脏恒压灌流实验装置”这一专利产品的事宜进行洽谈。

由于新装置的应用性研究刚刚结束不久，现正忙于对数据进行统计分析处理及撰写论文等，专利产品的推广工作已提到议事日程，20##年3月后将全面展开。

四、“在/离体蟾蜍心脏恒压灌流装置”的创新点

1. 装置“四位一体”结构的独特设计

在满足使用功能的前提下，将固定构件、灌流系统、描记系统和手术板等集“在/离体蟾蜍心脏恒压灌流实验装置”于一身，形成“四位一体”的独特结构，不仅美观大方，更主要的是它在较大程度上节省了使用空间，避免了散在装置多条管线纵横交错、杂乱无章的局面，避免了无意刮碰造成插管脱落的现象，提高了实验成功率。

2. 装置“恒压”控制系统的独特设计

过去在“蟾蜍心脏功能实验”实验中，使装置保持恒压状态是比较困难的。研制者巧妙地运用带有茂非氏管的医用输液器代替输入管，这样只要流速不变，便可保持恒压状态，简便易控。

3. 装置中“螺接”与“胶结”技术的应用

首度将制造业中“螺接”与“胶结”的技术运用于装置的制作过程，并通过二者的有机结合，使各种固定构件的操作更加简单、灵活、准确，例如只要轻轻扭转后负荷固定构件的旋钮便可通过输出管在立柱上的滑动来改变后负荷，或轻轻扭转换能器固定构件的旋钮便可随意改变换能器的方向。

五、成果的创新性、先进性、科学性、整合性、示范性

 “在/离体蟾蜍心脏恒压灌流装置”合理地将固定构件、灌流系统、描记系统和手术板等进行规模整合，形成“四位一体”的结构是国内外前所未有的，体现了它的创新性；巧妙地将制造业中“螺接”和“胶结”的工艺技术融入固定构件的制作环节，大大增加了其操作的灵活性、准确性，并体现了它的先进性。而有机玻璃、玻璃、木板等材料的选择更使这两种独具匠心的设计锦上添花，不仅经济实用、安全环保，还具有造型独特、美观大方的特点。

该装置用带有读数的有机玻璃立柱代替堆砌的木块来反应后负荷的变化，误差小；用旋钮代替三角支架来调整换能器的方位，十分灵活；用带有茂非氏管的医用输液器来代替原来的输入管，只要滴速不变，便可保持装置的恒压状态，简单易行。该装置的各项性能指标在完全满足实验要求的同时，体现了它的科学性。

通过“在/离体蟾蜍心脏恒压灌流装置”在“蟾蜍心脏功能实验”的应用，体现了观察分析给药前的生理表现、给药后的药理作用、对病理模型的治疗效果这一“三理”实验教学内容整合性的特点，实现了整合的目标。

目前，全国各医学院校尚没有成熟用于“蟾蜍心脏功能实验”的实验装置。“在/离体蟾蜍心脏恒压灌流装置”的研制成功，及其应用于我院机能实验教学的成功经验，无疑对其他医学院校开展机能实验学“蟾蜍心脏功能实验”具有一定的示范性。

六、应用情况

从20##年8月至20##年7月的两年间，我们将“在/离体蟾蜍心脏恒压灌流实验装置”广泛应用于20##、20##级六年制英文本科4个班，20##、20##级各专业五年制普通本科36个班学生综合性实验项目－“蟾蜍心脏功能实验”和20##、20##级六年制英文本科4个班探索性（设计性）实验项目中，并进行了新旧装置使用情况的对比观察，统计结果显示：使用新旧装置的实验成功率分别为95%和62%（见表１），蟾蜍平均用量分别为20只/班和26只/班，任氏液平均用量分别为100ml/组和150ml/组。仅“在体蟾蜍心脏功能实验”一项每年可为学院节省动物经费360元、节约营养液8，000ml（见附表），成为我院“共产党员工程”中“建立节约型实验室” 活动的重要组成部分。

附表：

表1  新旧装置在“蟾蜍心脏功能实验”中应用情况统计

＊P﹤0.01 同年级、同时间、不同班级应用新旧装置实验成功率比较。

表2  “蟾蜍心脏功能实验”材料使用情况统计