机能学实验课教案
离 体 蛙 心 灌 流
生理教研室：卢 娜
20##-9-20
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课程名称：机能实验学 授课教师姓名及职称：卢娜
新乡医学院 生理学 教研室 20##年 9月 20日
离 体 蛙 心 灌 流
[实验目的]
1．学习离体蛙心灌流的实验方法。
2．观察Na、K、Ca三种离子及肾上腺素、乙酰胆碱等因素对心脏活动的影响。
[实验原理]
1．心脏的正常节律性活动需要一个适宜的内环境，内环境的变化直接影响着心脏的正常活动。本实验在蛙心的灌流液内人为地加入一些物质而改变心脏活动的内环境，观察心脏活动有何变化。
2．心肌细胞分类
快反应细胞：心房肌，心室肌，浦肯野细胞：主要由快钠通道被激活，Na快速内流引发动作电位，去极速度快
慢反应细胞：窦房结细胞，房室交界区细胞：主要由慢钙通道被激活，Ca内流引发动作电位，去极速度慢
3．心肌细胞的生理特征： 电生理特征：自律性，兴奋性，传导性
机械生理特征：收缩性
影响心肌细胞电生理因素
心肌细胞兴奋－收缩耦联过程所需的Ca要从细胞外液转运，细胞兴奋时，膜上Ca通道开放，因此：
细胞外液Ca浓度↑――细胞兴奋时内流Ca↑――心肌收缩力↑
反之亦然
４．1％KCl： 即１３４ｍｍｏｌ/ L（正常：４ｍｍｏｌ／Ｌ）
轻，中度高钾：
细胞外K↑――Ｋ与Ｃａ在细胞膜上有竞争性抑制――Ｋ抑制细胞膜对Ｃa转运――进入细胞内Ca↓ ――心肌的兴奋收缩联过程减弱――心肌收缩力↓
[K]↑――膜内外ｋ浓度梯度减小――静息电位绝对值减小――兴奋性↑
[K]↑――细胞膜对k通透性增加――K通道失活V↓――自动去极化V↓――自律性↓
[K]↑――细胞膜对k通透性增加――K外流增加――最大复极电位↑――自律性↓
[K]↑――Ca内流受抑制――0期去极速度和幅度降低――传导性降低
重度高钾：
[K]↑↑――RP↓――Ｎａ通道失活――兴奋性丧失
５．2％CaCl2： 即１８０ｍｍｏｌ/L（正常：２ｍｍｏｌ／Ｌ）
细胞膜外Ｎａ与Ｃａ有竞争性抑制
细胞外液Ca浓度↑――细胞兴奋时内流Ca↑――心肌收缩力↑
快反应细胞：
高Ｃａ――Ｎａ内流抑制――０期去极化速度及幅度下降――传导性↓
慢反应细胞：
高Ｃａ――Ca易进入细胞，Ｃａ内流增加――０期去极化速度增加――传导性↑
６． O. 65％NaCl ： １１１ｍｍｏｌ／Ｌ
细胞外Ca↓――2期内流Ca↓――胞浆Ca 浓度↓――心肌收缩↓
[Ｃａ]↓――Ｃａ内流减少――０期去极化速度减慢――传导性↓
[Ca]↓――Ca不易进入细胞――4期自动除极的速度减慢――自律性↓
7：肾上腺素 正性变化
肾上腺素与心肌细胞膜上的β1受体结合――心肌细胞和肌浆网膜Ca通透性↑――肌浆中Ca浓度增加――心肌收缩↑
使K通道，Ｎａ通道，Ca通道都开放，------
慢Ca通道-----
8：乙酰胆碱 负性变化
乙酰胆碱与心肌细胞膜上的M受体结合――心肌细胞膜K通道的通透性↑――促k外流――
1：窦房结细胞复极时K外流↑――最大复极电位水平↑――自律性↓
2：复极时K外流↑――AP 2,3期缩短――Ca进入细胞内↓――心肌收缩↓
乙酰胆碱可直接抑制Ca通道――Ca内流↓――心肌收缩↓
[实验对象] 青蛙或蟾蜍
[实验器材和药品]
1．器材 生物信号采集系统、机械换能器、蛙类手术器械1套、蛙心插管、蛙心夹、试管夹、双凹夹、万能支架、滴管、150ml小烧杯4个、任氏液。
2．药品 O. 65％氯化钠、2％氯化钙、1％氯化钾、1：10 000肾上腺素、1，10 000乙酰胆碱等。
[实验步骤]
1 离体蛙心的制备
(1)取1只蟾蜍，破坏脑和脊髓，仰卧固定于蛙板上，用外科剪由剑突处向两锁骨肩峰端呈三角形剪开皮肤，用粗剪刀剪开胸壁，用图钉固定两前肢，用镊子提起心包膜，用眼科剪将其剪开，暴露心脏。
(2)在两个主动脉干下各穿两根细线（一根用来结扎腔静脉，另一根用来结扎蛙心插管和主动脉），并将其中一根打一活结备用。
(3)将心脏上翻，辨认心房，静脉窦，腔静脉，然后结扎腔静脉。
(4)用左手提起结扎线，右手用眼科剪在左侧主动脉距分叉部3mm处剪一“v”型口。将盛有少量任氏液的蛙心套管(用拇指将套管堵住，以防套管中的任氏液流出)从“v”型口插入动脉球底部，然后稍后撤套管，再将蛙心管尖端转向蟾蜍的背侧及左下方，于心缩期插入心室内。插管如已进入心室，可见管中液面随着心搏而升降，此时即可将预置线的活结扎紧，并固定于插管壁的小钩上。
(5) 小心提起套管和心脏，剪断主动脉左右分支；将心脏连同静脉窦一起剪下。
(6)吸去管内的血液，并用任氏液反复冲洗心室内的余血，以防血液凝固而影响实验的
进行。用连有细线的蛙心夹在心舒期夹住心尖部。（心尖大，夹组织少，不易损伤心脏）
2．实验装置
将蛙心插管用试管夹固定于支架上，蛙心夹的连线连接在机械换能器上。换能器的输出线与计算机的“输入”端相连。打开计算机，进入“蛙心灌流”界面。调节实验参数，开始记录心脏收缩曲线。
3．观察项目
(1)记录心脏在仅有任氏液时的收缩曲线，观察心率及收缩幅度，作为正常对照。
(2)吸去管内的任氏液，换以等量0.65％Nacl，观察并记录心跳的变化。
(3)等量任氏液换洗，待心跳恢复正常后，加入2％Cacl 1—2滴，记录观察心跳的变化。
(4)等量任氏液换洗，待心跳恢复正常后，加入l％Kcl 1～2滴，记录观察心跳的变化。
(5)等量任氏液换洗，待心跳恢复正常后，加入1﹕l0 000肾上腺素1～2滴，记录并观察心跳的变化。
(6)等量任氏液换洗，待心跳恢复正常后，加入l﹕10 000乙酰胆碱1～2滴，记录并观察心跳的变化。
4．实验结果的处理 对正常心脏收缩曲线和各项实验所得结果均应在实验时进行标记，然后整理并附在实验报告单上，对实验结果进行理论上的解释。
[注意事项]
1．蛙心夹应一次性夹住心尖，不宜夹多次，以免损伤心脏。
2．蛙心夹与换能器簧片的连线应呈一定的倾斜度，以防溶液滴入换能器。
3．当各项实验效果明显后，应及时将插管内的溶液吸出，至少用任氏液反复冲洗2～3次，待心跳恢复正常后，再进行下一项实验。
4．各种溶液的滴管应分开，不要混用。
5．在实验过程中，基线的位置、放大倍数、扫描速度一经调好后不要再变动。
6．在各项实验中，蛙心插管内灌流液的液面高度应始终保持一致，以保证心脏固定的负荷。
7．每一项实验，均应先记录一段正常对照曲线，然后再加入药液并记录其效应。
8．肾上腺素：加2-3滴，可多次使用 乙腺胆碱：必须最后一次滴加 NaCl：全换 其余：从一滴加起
[思考题]
1．给人体快速静脉注射钾离子，会有什么样的结果?
2．蛙心插管内灌流液是心脏的什么负荷?
3．正常体内肾上腺素、乙酰胆碱等化学物质来自何处?
第二篇：离体蛙心灌流及药物对心脏的影响
离体蛙心灌流及药物对心脏的影响
一、实验目的：
1、学习蛙心灌流方法。
2、了解离体心脏的自律性与环境中各因素变化的关系，观察理化因素 对蛙心活动的影响。
二、实验对象：蟾蜍
三、实验方法：
1、标本制备：
取蟾蜍→破坏CNS→固定→剪皮→打开胸腔（暴露胸骨柄，用镊子把胸骨柄 捏起来，用粗剪刀剪断，沿胸骨将锁骨剪断，去除多余的骨头，注意勿将心脏剪破）→用眼科剪小心剪开心包膜→暴露心脏→在主动脉叉下方穿一根丝线备用→用蛙心夹在心舒张期夹住心尖部→在左侧主动脉分叉处2-3mm处剪一剪口→将盛有一定量任氏液的蛙心插管插入到主动脉球→将插入到主动脉球的套管稍向后退，再向左下逆时针旋转90°，插入心室→结扎固定→剪断血管和背面静脉窦以下组织，游离标本
2、连接装置：
蛙心管内保持2ml灌流液，用木夹夹住蛙心套管，蛙心夹的线与张力换能器相连，换能器与电脑的相应通道相连。
3、运行电脑：
打开电脑→Medlab→实验/常用生理实验→离体蛙心灌流
四、实验结果：
分别观察正常心脏活动曲线及加入不同溶液后的心脏活动曲线的变化。 曲线规律：心脏节律；曲线疏密：心率
曲线基线：心室舒张最大程度
顺序 观察项目 药量 心肌(率、力)变化 正常任氏液 灌流 正常
1 0.65%NaCl 灌流
2 2% CaCl2 1~2d
3 1%KCl 1~2d
4 1:10000 NA 1~2d
5 1:100000 ACh 1~2d
6 3% LH 1~2d
2.5% NaHCO3 2~4d
7 1:100000 Isop 1ml +任氏液1ml
8 1:1000 prop 0.2ml+任氏液1.8ml
出现效应后，抽出一半液体后
立即加入Isop1ml
五、实验讨论：
心肌细胞兴奋时，通过兴奋-收缩耦联机制，触发心肌细胞收缩。心肌收缩的特点是：1.对细胞外Ca2+浓度的依赖性高；2.“全或无”式收缩
1、 0.65%NaCl灌流 与正常任氏液相比[Ca2+]↓→ Ca2+内流↓→兴奋-收缩耦联↓→收缩力↓
2、2%CaCl2（1～2滴）→[Ca2+]↑→Ca2+内流↑→兴奋-收缩耦联↑→收缩力↑
舒张期Ca2+与肌钙蛋白不完全解离，产生Ca2+强直，基线上移。
3、1%KCl（1滴）→AP平台期缩短 Ca2+内流↓；竞争性结合肌钙蛋白→兴奋-收缩耦联↓→收缩力↓
4、NA与心肌β1受体结合→激活腺苷酸环化酶→细胞内cAMP↑→激活蛋白激酶
和细胞内蛋白质的磷酸化过程→心肌细胞膜上Ca2+通道开放概率增加→Ca2+内流↑肌浆网释放Ca2+↑→兴奋-收缩耦联↑→收缩力↑
离体： NA→（+）β1-R→HR↑；整体：BP↑→反射性HR↓
5、ACh→与心肌M受体结合→抑制腺苷酸环化酶→细胞内cAMP↓→抑制蛋白激酶和细胞内蛋白质的磷酸化过程→心肌细胞膜上Ca2+通道开放概率减少→Ca2+内流↓肌浆网释放Ca2+↓→兴奋-收缩耦联↓→收缩力↓
+2+2+ACh→与心肌M受体结合→K外流↑, Ca内流↓→细胞内[Ca]↓→兴奋-收
缩耦联↓→收缩力↓
6、3%乳酸→H+与Ca2+竞争肌钙蛋白，Ca2+不能与肌钙蛋白结合→收缩力↓
2.5％NaHCO3→中和H+，Ca2+与肌钙蛋白结合增加， 收缩力恢复。
7、Isop1ml +任氏液1ml与心肌β1受体结合→激活腺苷酸环化酶→细胞内cAMP
↑→激活蛋白激酶和细胞内蛋白质的磷酸化过程→心肌细胞膜上Ca2+通道开 放概率增加→Ca2+内流↑肌浆网释放Ca2+↑→兴奋-收缩耦联↑→收缩力↑ Prop0.2ml+任氏液1.8ml抑制腺苷酸环化酶→细胞内cAMP↓→抑制蛋白激酶和细胞内蛋白质的磷酸化过程→心肌细胞膜上Ca2+通道开放概率减少→Ca2+内流↓肌浆网释放Ca2+↓→兴奋-收缩耦联↓→收缩力↓
出现效应后，抽出一半液体后立即加入Isop，与Prop竞争性拮抗→收缩力↑但较前次幅度小。
六、实验结论：
1、心肌的生理功能依靠内环境稳态；
2、各种因素对心肌收缩力的影响主要通过Ca2+实现；
3、K+、H+、ACh、prop可使心肌收缩力降低；
4、Ca2+、NA、Isop、OH-可使心收缩力增强；
5、Prop可竞争性拮抗Isop的作用。
【注意事项】
1、套管插入动脉球后，应及时进行换液，分别用两个吸管专管专用，防止蛙心 套管下端被凝血块堵塞。
2、插入到心室内后，若没有血液喷出，可将蛙心套管稍向后退，因为有时插入 太深抵在心室壁上也会看不到现象。
3、结扎固定时，一定要扎牢，尤其第一道线，扎好以后再在侧面的侧钩上结扎 固定一下，防止滑脱。
4、游离标本时注意切勿损伤静脉窦，尽量远离心脏剪。
5、连接时，换能器的连线应与插管中轴在同一直线上，即与地面垂直。
6、做的过程中，随时用面纸吸去渗出的任氏液，以防滴在换能器上，损坏换能
器。
7、每次实验观察前，应使蛙心插管内的液面保持在同一高度。
8、药物作用明显后，应立即换洗，直至心脏曲线恢复正常，再进行下一项实验。