微生物的培养与鉴定实验报告

刘琳 1131428 环境科学      同组：陈氏秋张

一、      实验目的

1． 学习微生物（细菌）鉴定的原理和方法。

2． 掌握微生物（细菌）的快速鉴定操作步骤与自动化分析技术。

3． 利用所学知识，分析并掌握微生物（细菌）的鉴定思路。

4． 强化生物学知识，提高学生动手操作能力。

二、      实验原理

细菌鉴定是细菌分类学中最实用的部分，与工、农业生产及人类生活有着密切的联系。在动、植物检疫，食品卫生检验，人类及动、植物病原诊断，环境微生物学研究等领域均需要细菌鉴定方面的工作。

细菌的鉴定是确定一个新的分离物是否属于一个已被命名的分类单元的过程。主要包括分离培养、显微镜观察、生理生化试验、血清学检验和动、植物接种等环节或技术。此外，还有噬菌体敏感性及抗生素敏感性试验等。

细菌鉴定首先要有一个分类系统做基础。根据这个分类系统，找出各分类单元间相互区分的一系列特征，构成一个鉴定系统，即细菌鉴定的检索表。换言之，检索表由一系列有关细菌特征的问题构成，这些问题引导人们通过一个分类系统来确定一个菌株的分类地位。检索表有双歧式和表格式两种形式。本实验采用表格式检索表。

表格式检索表(鉴定特征表)  只对分类群的特征进行总结。而不给分类特征以等级化的排列。表格式检索表往往包含较多的性状特征，因而看起来比双歧式复杂。但比双歧式优越。表格中记为“﹢”的结果是该分类单元中90％以上的成员为阳性的特征。因此，允许被鉴定对象的个别特征不确定。

三、      实验材料

器材：ID32E接种条、6cm培养皿、接种环、火焰灯、接种台、恒温培养箱、ATB Expression仪、移液管、移液枪

药剂：生理盐水、培养18~24h的接种菌、石蜡油、James 指示剂

四、      实验步骤

1． 准备好ID32E接种条、6cm培养皿、接种环、火焰灯、移液管、移液枪、接种菌、石蜡油、生理盐水等用品，放到接种台上，并打开火焰灯。

2． 用移液管移取5ml的生理盐水加入到6cm培养皿中。

3． 把接种环放到火焰灯上烧红（保证细菌全部烧死），之后在旁边冷却，等温度降至100°左右时放入接种菌试管中的琼脂部分再冷却至常温，之后挑取接种菌，并放到培养皿中涂布均匀。

4． 用移液枪移取培养皿中稀释的细菌液，然后滴在ID32E接种条上的32个孔中（每个孔55微升）。

5． 在接种条上的0—6号滴一滴石蜡油，保证其孔成厌氧状态。

6． 盖好接种条的盖子，放入37°恒温培养相中培养24小时。注意：要保持湿润。

7． 24小时后，取出ID32E接种条，在IND孔上加入James 指示剂，并在API鉴定系统鉴定，打印出鉴定结果。

五、      实验结果记录并整理

API鉴定系统鉴定ID32E接种条鉴定结果如下：

好的鉴定结果：

大肠埃希菌--------------------------------------可信度=98.3置信区间=0.26

克氏耶尔森菌------------------------------------可信度=0.7 置信区间=0.04

大肠埃希菌：不符实验数=3

克氏耶尔森菌：不符合实验数=4

六、      实验结果讨论

由鉴定结果可以看出：所鉴定的细菌是大肠埃希菌的可信度为98.3%，是克氏耶尔森菌的可信度为0.7%。若是大肠埃希菌，则有3个实验不符合；若是克氏耶尔森菌则有4个实验不符合。从这里我们可以明显给出结论：我们所鉴定的细菌为大肠埃希菌。

由结果可以看出，虽然在IND 和SAC两个指标上因颜色不明显而无法判断，但并未对最终的结果判定产生很大影响。根据与伯杰细菌手册对比发现，SAC指标对于一个种的不同菌株会有不同反应，因此对于其准确度要求并不高。对于IND，手册中显示为阳性，但在本次试验中并未测定。可见该指标在鉴定系统中的重要性较低，并未必要性指标。在不符合试验的结果中发现， LDC、aGAL和BGLU不符合概率分别达到了81%、99%和5%。LDC在结果中呈现阴性，在手册中表明应呈现阳性，所以，LDC的结果属于严重不符合的结果。aGAL在结果中显示为阴性，而在手册中表明应呈现阳性或者反应迟缓及不规则阳性（突变型），鉴定系统认为即使出现突变，其几率很低，不可能出现如此大概率的阴性显性，所以也作为不符合的实验罗列出来。通过LDC和aGAL的判断对比可以发现，虽然两者在结果中同为阴性，而在手册中显示应为阳性，但是其不符合的概率并不相同。aGAL达到99%，远高于LDC的81%。这可以说明，虽然同为鉴定指标，但是aGAL的重要性高于LDC。并未在手册中找到BGLU的阴性阳性判断，因此无法作进一步判断。但是根据其在结果中的阳性结果以及其不可信概率来看，有可能是因为颜色不是很明显造成的判断依据不太充分。总体来说，虽然此次实验结果中有2个试验指标并未检测出来，同时还有三个不符合实验，但是最最终结果鉴定并未产生很大影响。因此可以看出以上五个指标并非鉴定要求中的决定性指标，本次试验的结果可信度仍然很高。

通过克氏耶尔森菌与大肠埃希菌的对比发现，克氏耶尔森菌除了在LDC(赖氨酸脱羟酶)呈现与大肠埃希菌完全相反的结果，在其他指标上基本一致或者结果模糊（即在一个属中不同种得到不同反应），因此鉴定细菌有可能是克氏耶尔森菌，但概率很低。

实验过程中总是会出现一些误差，导致所得出的结果不是很理想，比如说操作误差，仪器误差，方法误差等。本实验可能存在以下误差：

1．        操作台内空气中有细菌污染：操作台空间较大，火焰等灭菌范围有限，仅能保障火焰等附近区域呈现无菌状态。而在整个操作过程中，难免有远离酒精灯的操作环节，可能会在这个过程中被其他细菌污染。

2．        接种过程中的失误：接种时，可能会因为菌种选取的地方不同而导致菌种数量或者生长状态的不同。同时，由于接种环在接种前需在火焰等上灼烧，有可能接种环的温度并未完全冷却的导致接种过程中出现问题。

3．        细菌液提取不均匀：接种时使用接种环在培养皿中进行混合，难免会导致提取细菌液时浓度不一致或者过低，这样会导致各项指标反应结果有所偏差。

4．        试剂盒内添加试剂的量不够或者添加试剂本身存在缺陷等。

5．        API鉴定系统出现误差：自动化鉴定系统只能按照特定程序来进行编码和鉴定，可能会因为程序设置或者其他故障而导致鉴定结果出现一定的偏差。

总体而言，对本次实验结果比较满意。如果需要进行进一步的试验计划，则应进行人工鉴定试验来确定不符合试验鉴定要求的指标是否是因人为或者仪器原因导致鉴定结果的偏差。

第二篇：微生物实验报告

《脓汁和粪便标本中病原菌的检测》

实验目的：本次脓汁粪便标本中病原微生物的检测实验，旨在通过培养基制备，病原菌的分离与培养，以及细菌鉴别实验如革兰氏染色法，血浆凝固酶试验，药敏试验，半固体接种法实验，从而对医学微生物学主要的研究方法和手段有一定程度的了解，初步掌握微生物试验的基本技能和原理，也有助于无菌观念的树立。

1.实验器材：

 接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、 生物显微镜、电炉、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁而灭、天平、砝码、细菌干粉培养基、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵管、灭菌平皿、试管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋、尺子

2.实验方法与步骤：

2.1培养基的制备、消毒和灭菌

培养基制备的一般程序：

①    调配→溶化→ 矫正pH →分装→灭菌→检定→保存。 

②                  干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→灭菌→检定→保存。

③                  如下图表格内容要求所示制备培养基。

表一

2．2细菌的分离与培养

    2.2.1采用平板划线分离法，取脓汁标本在普通平板表面划线，取粪便标本在伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个细菌，在37℃培养18～24h ，从而分离出单个菌落。

    2.2.2观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、颜色。

    2.2.3细菌的纯培养：取脓汁标本在普通平板上的黄色、白色单菌落，粪便标本在伊红美蓝平板上的紫黑色、淡粉红色单菌落接种在四个斜面培养基，标记，在37℃培养18h。

2.3细菌个体形态特征的观察

2.3.1革兰染色法观察细菌形态。涂片  →  干燥   →  固定→染色。涂片：取一玻片在玻片的左右两侧上加生理盐水3～4ul，2滴，分别取黄色和紫黑菌菌苔少许（1mm小菌落的半量）与左右两侧盐水混匀，涂成1cm2。干燥：在空气中放置至干燥。固定：在酒精灯上来回横穿2到3次对其进行固定。染色：结晶紫 → 初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗稀释→复红→复染1分钟→水洗→吸干,镜检。

2.3.2取另一玻片，取白色和粉红色菌苔，操作与上述同。

2.4细菌生化反应鉴定

2.4.1糖发酵试验   用接种针分别挑少许紫黑和粉红色的细菌接种到葡萄糖发酵管和乳糖发酵管中，在37℃下，培养24小时，观察其产酸产气情况。

2.4.2细菌药物敏感性试验  接种环分别取黄、白、紫黑、粉红色四种菌液3～6ul×2环，各自在四个平板上，作平板密集划线接种细菌（纱窗样）。设计三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。37℃18～24小时培养，观察结果。

2.4.3血浆凝固酶试验  取二滴兔血浆置于洁净的玻片上，分别用接种环取白色和黄色菌苔(2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合，涂匀呈云雾状，立即观察结果。

2.4.4半固体接种法   接种针斜面取四种不同颜色的细菌，各自接种进四个半固体培养基，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种针。 在37℃下,培养24小时，观察结果。

2.4.5 痢疾血清玻片凝集反应  取载玻片1张，滴加痢疾血清和生理盐水各15ul，2滴。用接种环挑取少许紫黑色菌落和粉红色菌落，各自与上述混合液液滴混匀，观察结果。

3.实验结果与讨论

3.1脓汁和粪便病原微生物检测结果。

3.1.1细菌的分离与培养的结果。脓汁中的细菌在普通平板上形成黄色和白色菌落。粪便中的细菌在伊红美蓝固体培养基上形成紫黑色和粉红色菌落。

伊红美蓝为指示剂，具有抑制革兰氏阳性菌生长的作用。大肠杆菌分解乳糖产酸，使伊红美蓝呈色，形成紫黑色菌落，且有金属光泽；肠道致病菌不发酵乳糖，菌落成粉红色，有时可因碱性物质较多，细菌带负电荷染上美蓝而成蓝色菌落。

3.1.2观察细菌形态的实验结果。脓汁的黄色和白色菌落中的细菌革兰染色紫色，阳性，萄萄串珠样排列球菌，疑似葡萄球菌。紫黑色和粉红色的细菌呈杆状，粉红色，说明为革兰氏阴性菌。

用革兰染色法观察细菌的形态时脱色时间不要太久免得影响实验结果，油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。使用后记得擦洗干净。

3.1.3糖发酵试验结果。不同细菌具有不同的糖分解酶，分解各种糖的代谢产物也各不相同，有的产酸，有的产酸又产气，据此，可以鉴别各种细菌。紫黑色细菌在葡萄糖和乳糖发酵罐中皆变色和产生气泡，说明紫黑色细菌均能分解葡萄糖和乳糖，产酸产气。粉红色细菌在葡萄糖发酵管中变色但不产生气泡，说明其能分解葡萄糖，产酸不产气；在乳糖发酵罐中既不变色又不产生气泡，说明其不能分解乳糖，不产酸不产气。

在进行糖发酵试验时，试验完成后，管口不能朝上，这是因为管口朝上时，反应过程中产生的气体会溢出，观察不到正确的实验结果，最终会影响到细菌的最终鉴定。

3.1.4药敏实验结果。

表二常用药敏试验纸片判断标准

表四 药敏实验结果分析

注：耐药－，中度敏感±，敏感＋

G+金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌对青霉素敏感，对链霉素中度敏感。感染后用青霉素治疗效果较好。G-粉红色和紫黑色细菌对青霉素耐药，对链霉素敏感。感染后用链霉素治疗效果较好。G+球菌和G-杆菌对广谱抗菌素庆大霉素都敏感。

3.1.5血浆凝固酶试验的结果分析。观察到黄色菌落的细菌能使血浆产生颗粒性物质，说明其为凝固酶阳性，是致病菌；白色菌落细菌不出现凝集反应，说明其为凝固酶阴性，不是致病菌

3.1.6紫黑色和粉红色细菌在半固体培养基中的结果。紫黑色细菌在半固体培养基内呈扩散生长,培基混浊，说明该细菌有鞭毛；粉红色细菌在半固体培养基内沿接种线生长,培基清澈透明，说明该细菌无鞭毛。     

表五 紫黑色和粉红色细菌生化反应结果分析

3.1.7痢疾血清玻片凝集反应的结果分析。紫黑色菌落的细菌不能使痢疾血清产生颗粒性物质，说明其不是引起痢疾的致病菌；粉红色菌落的细菌使痢疾血清产生颗粒性物质，说明其是引起痢疾的致病菌。

在适量电解质存在的情况下，颗粒性抗原(细菌)与特异性抗体混合，如果比例合适，则出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。凝集反应的机制是由于抗原与其相应抗体间存在着相对应的极性基。极性基的相互吸附，使抗原外周的水化膜除去，由亲水溶胶变成憎水溶胶。电解质具有降低电位的作用，使抗原颗粒间的排斥力消除，从而产生了凝集现象。

附肠道各菌属生化反应鉴别表。

表六

+产酸或阳性， ?产酸产气，-阴性， +/-多数阳性， -/+多数阴性， √不确定。

由上述实验结果可得脓汁和粪便标本细菌检测结果如下表所示

表七

（+ 产酸或阳性， ? 产酸产气，- 阴性， +/- 多数阳性， -/+ 多数阴性， √ 不确定）