实验一、AP4气孔计测定植物蒸腾速率
一、实验原理
蒸腾速率与气孔导度、土壤含水量和叶片相对含水量关系密切。气孔导度可以用来评价城市大气污染状况，表征植物的生理状态，甚至可以用作抗旱植物、抗污染植物的筛选指标。AP4气孔计根据循环扩散的原理，由植物叶片表明湿度的变化进行测量计算，得到气孔导度、气孔阻力等数据，并计算出植物蒸腾速率。
二、植物材料与方法
1.植物材料：白鹤芋
2. 使用仪器：AP4气孔计；
3. 实验步骤：
（1）将装满打开仪器，进入校准界面，对仪器进行开机校准。 首先进入校准菜单，将叶室夹张开，轻轻晃动，测定环境中湿度值，然后使用铺好潮湿滤纸的校准板，按照屏幕上的提示逐一校准6个点。仪器根据测定情况自动提示曲线的拟合状况，一般拟合标准在5%以内对测量影响不大，可以接受。若校准后，匹配率大于5%，需要重新校准。
（2）校准后进入测量菜单，开始正式测量。每测量一个值，需要待取值稳定两次再记录，而且叶室夹带黑色胶圈一侧为测量端，与待测叶表面接触。
（3）进入预览选项查看所需数据，用数据线将仪器和电脑相连，导出数据。
三、实验结果
见附表1
四、结果分析与体会
1、首先要保证仪器匹配的错误率在5%以内的数据才算是对研究分析有效地数据。但是本次试验，我们组的匹配的错误率是14.5%，因此用作严格的实验分析并不准确，但本次试验的目的是学会使用和理解AP4气孔计测定方法。
2、植物叶片气孔的蒸腾速率受很多因素的影响。例如：温度、湿度、C02含量、光照等。在实验测定过程中，一直处于室内状态，因当天天气较阴冷，植物的气孔蒸腾速率很小，且测定起来很慢。
实验二、叶绿素荧光仪测荧光参数
实验1.1 叶绿素荧光产量
一、 实验材料和器材
绿叶、PAM荧光仪
二、 实验原理
叶绿素是光合作用色素系统的主要组分，起吸收光能和将光能传递给反应中心的作用。光合作用的能量转换主要是指光系统Ⅰ和光系统Ⅱ的反应中心的电荷分离过程，也就是特殊的叶绿素分子将电子传递给电子受体的过程。目前已经证明活体叶绿素荧光主要与光系统Ⅱ有关（与Ⅰ）无关。荧光发射、光化学能量转化和热耗散均来源于叶绿素分子吸收光能的单线激发态。这三种去激发途径之间存在的关系是：F+P+D=1
三、 实验步骤
1、叶片与荧光标准的比较
2、光化光强度对叶绿素荧光的影响
3、远红光的作用
4、饱和脉冲的作用
四、 实验结果
结果如图：
五、 实验结论和分析
1、活体叶绿素荧光主要来源于光系统Ⅱ。照射红光可以引起Ft上升，这是因为电子在两个光系统之间的积累。当照射远红光时，可以促进光合系统Ⅰ，光系统Ⅱ受体则被氧化，Ft降低。
2、PAM荧光仪测量的是荧光产量，在死样品中荧光产量相当稳定，而在活样品中，荧光产量的变化范围可以达5倍。
3、随着光化光强度的增加，Ft总是先上升后下降，这反映了光和器官对光环境改变后的适应能力。
4、远红光会使荧光产量降低。这说明远红光可以通过启动光系统Ⅰ的活性来氧化光系统Ⅱ的受体侧，从而增加了光系统Ⅱ的量子产量。
实验1.2 叶绿素荧光参数FO、Fm等的测定
一、 实验原理
叶绿素荧光是活体植物光合作用的探针。当叶绿素分子受到外加激发光激发后，能量主要以3种方式散失，即荧光、光化学反应和热耗散。这3种能量的总和相等，但彼此制约。光合作用具有两个光系统，光系统Ⅰ（PSI）和光系统（PSⅡ）,它们之间具有蛋白或蛋白复合体组成的复杂的电子传递链，电子由最初的原初电子受体特殊对叶绿素a分子通过电子传递到达电子受体，生成NADPH和ATP的还原力，并最终将二氧化碳还原为有机物，同时生成氧气，将电能最终转化为稳定的化学能。调制叶绿素荧光仪考虑到光合作用生理过程以及植物自然状态下生长的昼夜节律，用光化光、远红光近似模拟出植物自然状态下的光照条件，用可调制频率的脉冲光唯一地指示叶绿素荧光信号，通过进行饱和脉冲分析和进行荧光诱导曲线的绘制等方法研究植物对光信号变化的应答及植物的光合特性等。
如图1所示，植物在黑暗或低光照条件下经过一定时间的暗适应，打开测量光后，植物显示一定的荧光信号F0，这是初始荧光值，该值大小与叶绿素浓度有关。然后给植物一个瞬间很强的饱和脉冲光，叶绿素分子激发出暗适应条件下的最大荧光值Fm，之后，荧光值缓慢下降。打开光化光之后，荧光值先上升，然后缓慢下降到近平衡，此时再给予饱和脉冲光，植物由激发出一个荧光高峰，这是光下的最大荧光Fm’，植物状态趋于平稳后关闭光化光同时打开远红光，荧光值瞬间降到低于F0处，然后逐渐恢复到新的平衡状态。因此，调制叶绿素荧光仪将调制叶绿素荧光技术以及饱和脉冲分析方法结合，通过不同光源的控制模拟改变自然光照条件，是研究植物光合特性及光适应的强大工具。
图1植物叶绿素荧光特征曲线
二、实验材料和方法
1. 植物材料： 白鹤芋
2.使用仪器：基础调制叶绿素荧光仪（Junior PAM）。
3.实验步骤：
①Meas light,观察F0、Fm
②Act light，（待曲线走平后），选SAT
③取消Act light，选Far light
④取消Far light，选Act light
三、实验结果
经3次测定后，将导出的数据整理如下：
四、结果分析与讨论
不同光源对荧光量子产量的实验和荧光诱导曲线的绘制实验中，充分体现了植物对环境光照因子改变的相对快速的应答以及相对缓慢的适应。植物对以上刺激均表现出迅速的应答和反应，当刺激一发出，可以观察到荧光曲线信号相对快速发生变化，应答表现在：暗适应后给予饱和脉冲光、光下适应一段时间的植物给予饱和脉冲光、光化光关闭后立即给予远红光处理，当植物受到一段较强的光化光照射后，再关闭光化光，等待植物恢复到接近初始暗适应的状态所用的时间较长，表现相对缓慢的适应过程。例如，植物在光化光下照射约6min，但使其状态重新恢复到未给予强光照射之前的状态需要30min，甚至更长时间，这说明了，环境对植物的短期影响植物能够产生应激的反应并有效的适应环境条件的骤然变化，但是环境刺激施加的强度越大，时间越久，植物需要越长的时间恢复或达到新的生理平衡状态，这对于植物保护和生态保护具有重要意义。
实验三、压力室法测定植物PV曲线
一、实验原理
水势 （water potential）水的化学势，是推动水在生物体内移动的势能，水势等于溶质势（渗透势）、衬质势和压力势之和。植物内水势由根系向地上部分的茎、叶逐渐递减，叶肉细胞中水势高于大气水势，由于水势的梯度，植物不断从根向地上部分输送水分，使根内水势下降，根从土壤中吸收水分。由于导管中水溶质势与张力比很低，水分在导管中的运输渗透势接近零，因此导管中水势近似等于水的压力势。植物蒸腾作用不断失水，产生蒸腾拉力，蒸腾拉力与根压共同作为植物吸水的动力。当枝条被剪断，导管中连续的水柱被截断，剪口上部水柱在蒸腾拉力作用下上移，剪口下的水柱受重力以及大气压的力液面下降。
压力室法就是将植物剪口上部枝条倒着竖直固定在密闭压力室中，通过外加高压气体将水柱压出枝条，当压力不断增大，压出的水的总体积也不断增加，直到难以压出水来，称量得到排空导管水的枝条鲜重以及烘干的干重，通过测定压出水的重量测定水势的方法。绘制枝条中水分体积对外加压力的曲线，及植物枝叶样品吸水饱和后，随压力室中连续加压渗透水量的体积与相应平衡压倒数之间的变化曲线，称为植物PV曲线。应用PV曲线可测定植物细胞在膨压为0（质壁分离）时的渗透势、相对水含量和相对渗透水含量，以及饱和含水时的渗透势、束缚水含量、膨压随叶水势下降而降低的速率b值和组织细胞总体弹性模量等水分参数。这些PV曲线的水分参数能够指示植物对干旱逆境的响应，为植物抗旱生理机制研究提供依据。
二、材料与方法
1. 植物材料：大叶黄杨（Buxus megistophylla），黄杨科。
2. 使用仪器：Model 600型植物压力室。
3. 实验步骤：
（1）取样：鲜样采集后立即放在盛有水的桶中吸足水分。
（2）数据获得：确认压力室开关和仪器进气口关闭，然后打开高压气瓶，待气压升到2000pa时关闭气瓶。
（3）将植物枝条倒着直立固定在压力室中，旋紧压力室盖子。将仪器的高压气开关打开，观察枝条断面发生的变化，直到枝条中的水被高压挤压出来，读取压力表盘上数值，此时的压力值为初始平衡压。
（4）接着测定不同压力下的累积水体积。测量时压力在1.0Mpa以下，每次增加0.2Mpa，1.0Mpa以上，每次增加0.5Mpa。每次加压后停留5min，并用事先称量干重的棉花棒吸收挤压出的水，然后放掉压力室中的气体，重新将压力打到之前的数值，再停止5min。每个压力下测量结束，称量吸收了从植物中挤压出的水的棉花棒，并记录。这样逐一测量，直到压力增加到4Mpa。
（5）由于除了自由水，植物枝叶中还有束缚水，因此测量结束后必须称取枝条不含自由水的鲜重，并将其放入烘箱，80℃烘干24h。
（6）绘制P-V曲线，用图解法求出渗透水原初含量、初始质壁分离渗透势、充分紧张组织中的原始渗透势、平均膨压、非渗透水量和体积弹性模量。
4. 数据分析：
以平衡压的倒数为纵坐标，不同平衡压下的渗透水量为横坐标，渗透水量数据输入x轴列，将所有平衡压的倒数值输入y1列，将进行直线回归的平衡压的倒数值（变幅相近的最后几个连续观测数据和紧邻的一个明显发生拐离的数据组成，这样既满足了幂函数和回归直线拐点的数学性质，又能得到比较满意的结果）输入y2列渗透水量相应的位置，作散点图，然后分别拟合幂函数和线性函数并得出拟合方程和决定系数。
三、实验结果
四、实验注意事项和体会
1、一定要保证压力室不漏气，在实验过程中，我们的第4次测定的数据可能误差较大，是因为压力室已漏气，我们是通过人工手动调节其压力大小以保证压力室内的压力不变。
2、棉花棒里面的棉花一定要塞足量，不然会因被压出的水多，而超过了棉花的最大吸收量，导致实验数据不准确。
实验四、生物氧测定仪测定生物呼吸速率
一、实验原理
氧电极是为测定水中溶解氧含量而设计的一种极谱电极。目前通用的是薄膜氧电极，又称Clark电极，由镶嵌在绝缘材料上的银极（阳极）和铂极（阴极）构成，电极表面覆盖一层厚约20～25μm的聚四氟乙烯或聚已烯薄膜，电极和薄膜之间充以KCl溶液作为支持电解质。由于水中溶解氧能透过薄膜而电解质不能透过，因而排除了被测溶液中各种离子电极反应的干扰，两极间外加的极化电压超过氧分子的分解电压时，透过薄膜进入KCl溶液的溶解氧便在铂极上还原：O2+2H2O+4e-=4OH-；银极上则发生银的氧化反应：4Ag+4Cl-=4AgCl+4e-。此时电极间产生电解电流。由于电极反应的速度极快，阴极表面的氧浓度很快降低，溶液主体中的氧便向阳极扩散补充，使还原过程继续进行，但氧在水中的扩散速度则相对较慢，所以电极电流的大小受氧的扩散速度的限制，这种电极电流又称扩散电流。在溶液静止、温度恒定的情况下，扩散电流受溶液主体与电极表面氧的浓度差控制。随着外加电压的加大，电极表面氧的浓度必然减小，溶液主体与电极表面氧的浓度差加大，扩散电流也随之加大。但当外加的极化电压达到一定值时，阴极表面氧的浓度趋近于零，于是扩散电流的大小完全取决于溶液主体中的氧的浓度。此时再增加极化电压，扩散电流基本不再增加，使极谱波（即电流-电压曲线）产生一个平顶。将极化电压选定在平顶的中部，可以使扩散电流的大小基本不受电压微小波动的影响。因此，在极化电压及温度恒定的条件下，扩散电流的大小即可作为溶解氧定量测定的基础。电极间产生的扩散电流信号可通过电极控制器的电路转换成电压输出，用自动记录仪进行记录。
二、实验材料与方法
1. 植物材料：绿豆，小麦。
2. 使用仪器：生物氧测定仪。
3.实验步骤：
将仪器电源线、氧电极线接好，清洗反应室。打开仪器，进行仪器参数设定，然后用一定浓度的NaSO3和蒸馏水进行O2浓度的调零和调满。进入测量菜单，建立新的文件名，按下enter键，开始每隔相同的时间（5s）采集100个数据，测量完毕后保存到相应的文件名下。待数据全部采集，将仪器关闭，接到电脑上，打开仪器进入数据管理菜单下，浏览数据，确认需要导出数据名称，操作计算机上预装的程序，仪器将自动导出需要的数据。
三、实验结果
见附表2
四、实验分析和体会
1、实验开始时的电极探头比较难处理。它需要将透明玻璃纸薄膜准确的套在探头上，特别要避免气泡的进入以免干扰试验的准确性。
2、将被测物要尽量的研磨的越细越好，且研磨好后就要马上进行测定，以免其在空气中暴露太久，其中的一些酶活力下降，导致最后测定的光和呼吸值较低。
实验五、红外线CO2气体分析仪测定光合速率
一、实验原理
在密闭的系统中，由于同化室中的叶片进行光合后，系统中的CO2浓度不断下降，但用单位时间内同化室中CO2浓度的减少量或CO2浓度减少量所需的时间，根据叶片面积、同化室体积，计算光合速率。CO2分子对红外线有特异的吸收带，其吸收峰分别在2.69μm、2.77μm、4.26μm和14.99μm四处，其中只有4.26μm的吸收带不与H2O的吸收带重叠，红外仪设置仅让4.26μm红外光通过的滤光片，当该波长的红外光经过含有CO2的气体时，能量因CO2的吸收而降低，降低的多少与CO2的浓度有关，并符合朗伯—比尔定律，分别供给红外仪含与不含CO2的气体，经检测器输出反映CO2浓度变化的电讯号。
二、材料与方法
2.1、植物材料：百合竹
2.2、使用仪器：微量红外气体分析仪
2.3、实验步骤：
2.3.1、按要求将参比管和工作管气路系统交叉连接起来，一端接到气泵，一端连接到脱脂棉中充满NaOH颗粒的透明玻璃长管，使气路闭合；
2.3.2、将作用开关打到A（预热档），接通电源，打开红外仪电源预热一段时间，打开气泵电源，仪表盘指示的CO2浓度缓慢下降，直到零点附近，如果偏离零点，需要将作用开关达到C（工作档/调零档）调零。仪表盘上由上向下分别标有4套刻度值，其最大数值依次为600ppm,300ppm,150ppm和75ppm，它们在步进开关分别对准1，2，3和4时使用，误差从5ppm，2.5ppm，1.25ppm到0.75ppm。注意：调零校准仪器时需要由粗到细，再由细到粗；
2.3.3、调零后，将参比管进气口和出气口相连以封闭参比管，将工作管进气口接高浓度CO2气（接外界大气），另一端接气泵，再通入密闭透明同化室，使气流流过同化室中的植物，最后回到仪器中检测，未照射强光，稳定一段时间测定CO2浓度C1。
2.3.4、照射光强约6000lx的强光，观察CO2浓度变化，并测定CO2稳定时的浓度。
三、实验测量的数据
1.室外CO2浓度=155ppm；
2.室内CO2浓度=243ppm；
3.对着进气口吹了一口气之后，表盘上显示的CO2浓度=400ppm；
4.整株植物进行了3min的光合作用以后，CO2浓度=190ppm。
四、分析与讨论
1、百合竹强光照射后CO2浓度下降，说明植物光合作用吸收了CO2。吸收的CO2量能够反应植物光合作用的状况。
2、因为同化室体积与植物株型不符，如同化室远大于植物，则测算出的光合速率可能偏高，利用这种方法测定植物光合速率时需要考虑同化室体积；
3、植物长时间处于密闭的同化室，叶片蒸腾、光呼吸等生理变化会可能对测量产生干扰，如强光照射时间长产生一定热量，使同化室温度上升。
4、由测量可知，室内CO2浓度明显高于室外，并且室内温度也高于室外温度，所以所得的CO2浓度变化值反映的光合作用可能跟实际生活在室外的植物的光合作用有偏差。
五、心得体会
实验六、旋转薄层色谱法分离叶绿素
一、实验原理
离心薄层色谱(CTLC)又叫旋转薄层色谱，属于薄层色谱的一种，是一种离心型连续洗脱的环形薄层色谱分离技术。它是在经典的薄层色谱基础上，运用离心力促使流动相加速流动，使叶绿素分离，可以减少对叶绿素的破坏，对沸点高、分子量大的化合物有利，可用于分离100mg左右的样品。
植物叶绿素a和叶绿素b在有机溶剂中溶解度不同，根据叶绿素a和b在固定相和流动相之间的吸附、分配作用的不同，再加上离心加速度的作用，使两组分之间原有的比移率差异加大，从而提高了分离效果（比移率指假设溶剂从原点渗透到距离a，位于原点的物质从原点向前移动到b，那么b/a的值）。
二、实验材料与方法
1. 植物材料：油松（Pinus tabulaeformis），松科；
2.使用仪器：圆板薄层仪、紫外——可见光分光光度计；
3. 实验步骤：
（1）叶绿素提取。称取油松10g，剪碎，放入研钵中，加入少许CaCO3和石英砂，再加入适量丙酮充分研磨静置，浸提液过滤到分液漏斗中，加入30ml石油醚，100ml 10%NaCl溶液使两相均匀混合，静置分层后弃下层，重复萃取1次，最后将色素提取液放置到细口瓶中备用；
（2）硅胶板制备。称取30g硅胶，1.2g石膏70ml水，充分混匀后制版。室温下放置12h，放80℃烘箱烘3h，取出层析板，冷却后刮板，除去中心及边缘多余硅胶，板固定在旋转薄层仪上，固定好板后盖上玻璃，卡住；
（3）先使用上样泵（调到10）吸取纯石油醚，润湿薄板。当由圆心润湿到圆板的1/3时，吸取石油醚和丙酮8：2混合液，将上样泵调到5上样。经过约30min，可见叶绿素a和b分开，并分别收集叶绿素a和b谱带的洗脱产物；
（4）在分光光度计下测量，绘制出叶绿素a和b的吸收曲线。
三、实验结果
叶绿素提取液在有机相，蛋白等杂质在水相。提取的叶绿素溶液颜色墨绿，在薄层仪上展层较好，叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素分离清晰，最外层为叶绿素a。洗脱下来的色素用小烧杯收集，叶绿素a和b颜色具有明显差别，叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色。
根据标准的叶绿素吸收光谱图，其中实线为叶绿素a曲线，虚线为叶绿素b曲线。可知，叶绿素a最大吸收峰在430nm左右，另一吸收峰在662nm；叶绿素b最大吸收峰在450nm左右，另一吸收峰在642nm。
我们本次实验结果所得数据做成的图如下。实验结果与预期基本吻合。
四、实验注意事项与体会
1、研磨提取叶绿素时，丙酮的添加量要适中，如太少，旋转层析后叶绿素的浓度太大，在用分光光度计测量时，最大吸收可能超过其最适范围（保证在0.8左右最好）；太多，不利于图形分析。本次试验，我们组的丙酮两加入太少，以至于后来多次用石油醚和丙酮8：2混合液进行稀释，才将最大吸收控制在0.8左右。
2、用试管接取分离出来的叶绿素时最好接取旋转分离的中间部分，其纯度较大，以免混有其他的色素，影响吸收值得测定。
附表1
附表2
