实验 不同频率的刺激对肌肉收缩的影响
摘 要
利用蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本，研究不同频率的电刺激对肌肉收缩的影响，并学会使用微机生物信号采集处理系统和换能器。刺激神经会引起肌肉收缩，而肌肉收缩的形式，不仅与刺激本身有关，而且还与刺激频率有关。当刺激频率较小，刺激的间隔大于一次收缩舒张的持续时间时，肌肉表现为一连串的单收缩；增大刺激频率，是刺激的间隔大于一次肌肉收缩舒张的持续时间、小于一次肌肉收缩舒张的持续时间，则肌肉产生不完全强直收缩；继续增加刺激频率，是刺激的间隔小于一次肌肉收缩的收缩时间，则肌肉产生完全强直收缩。
关键词：不完全强直收缩；完全强直收缩；坐骨神经腓肠肌标本
引言：此实验所用的蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本在实验教学中应用广泛，而且目前关于神经肌肉刺激的研究正在不断深入，双通道神经肌肉电刺激仪的发明也给广大的瘫痪病人带来了福音。这种以低频脉冲电流刺激神经肌肉以治疗疾病的方法称为神经肌肉电刺激疗法(NMES)。对病变神经及其支配的肌肉进行电刺激可以引起肌肉节律性收缩，改善血液循环，促进静脉与淋巴回流，延缓病肌的萎缩，有助于肌纤维的代偿性增生，促进神经兴奋和传导功能的恢复。
材料和方法
实验材料
1． 实验对象：蟾蜍
2． 实验工具：蛙板、锌铜弓、探针、粗剪刀、细剪刀、瓷碗、培养皿，尖镊子、玻璃分针
3． 实验试剂：任氏液
4． 实验仪器：铁支架、微调固定器、刺激输出线、肌动槽、张力换能器、RM6240微机生物信号处理系统。
实验方法
1． 离体蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本制备
2． 实验系统连接和参数设置：
(1) 实验菜单中选择“刺激频率对谷歌肌收缩的影响”
(2) 选择菜单中选择“强度/频率”显示刺激参数
3． 肌动槽—坐骨神经腓肠肌，张力换能器—RM6240前负荷调至4g。波宽0.1ms,频率递增刺激，组间隔4s,强度2V,记录，打标，开始刺激。
4． 实验观察：刺激频率按1Hz、2Hz、3Hz…逐渐增加，连续记录不同频率是的肌肉收缩曲线，观察肌肉收缩形态和张力的改变
5． 统计方法:结果以X±S表示，统计采用Student test方法
实验结果
图1：刺激频率对骨骼肌收缩的影响
(横坐标：频率 纵坐标:张力大小)
由图可知：在刺激强度变化率恒定的条件下，在1Hz的刺激下表现为单收缩，在11Hz的刺激下表现为不完全强直收缩；在21Hz刺激下表现为强直收缩；在大于21Hz刺激下，肌肉已经出现疲劳从而表现为收缩减少。当刺激频率较小，刺激的间隔大于一次肌肉收缩舒张的持续时间，则肌肉收缩表现为一连串的单收缩；增大频率刺激，使刺激的频率大于一次肌肉收缩的时间、小于一次肌肉收缩舒张的持续时间，则肌肉产生不完全强直收缩；继续增加刺激频率，使刺激的时间小于一次肌肉收缩时间，则肌肉出产生完全强直收缩。
实验讨论
1．为什么刺激频率增高肌肉收缩的幅度也增高？
一个脊髓神经前角运动神经元及其轴突分支所支配的全部肌纤维，称为一个运动单位。弱收缩时，仅有少量的和较少的运动单位发生收缩；随着收缩的加强，可有越来越多和越来越大的运动单位参加收缩，产生的张力也随之增加。
2．连续刺激神经，坐骨神经腓肠肌标本会出现疲劳现象吗？为什么？
会出现疲劳。因为短时间剧烈运动时出现的疲劳，往往与细能源物质的消耗以及乳酸等代谢产物的堆积这些外周的因素有关。H+ 与Ca2+竞争肌钙蛋自上的结合位点，减少了肌钙蛋白的激活率，影响了横桥的形成此外，此外H+ 浓度升高也会抑制钠泵的活力，使横桥摆动所需能量不足。
3．对实验结果和现象进行机制分析讨论。
单收缩时胞质内Ca2+浓度升高的持续时间太短，以致被活化地收缩蛋白尚未产生最大张力时，胞质Ca2+浓度就已经开始下降。强直收缩时，则细胞连续兴奋，是细胞内Ca2+浓度持续升高，因此收缩张力可达到一个稳定的最大值。
4．通过对“不同频率的刺激对肌肉收缩的影响”的研究，在医学治疗上有什么应用？
a.神经肌肉电刺激疗法(NMES)用于治疗废用性肌肉萎缩，增加和维持关节活动度，减轻肌肉痉挛以及促进失神经支配肌肉的回复的等。并且早在1982年，美国FDA已正式宣布此方法是安全的。
b.盆底肌锻炼与电刺激联合生物反馈,是治疗产后女性性功能障碍的一种良好方法,是临床未来需普及推广的治疗方法之一。
c.电刺激修复动眼神经损伤。
d.脊髓电刺激遥控止痛。
5. 在实验过程中由于采用的是离体实验标本，所以成功率不是很高，所以可否采取在体的标本呢？
参考文献
1． 李世亭;王旭辉;朱宁喜;李心远;张文川;仲骏;;动眼神经功能修复实验研究[J];中华神经外科疾病研究杂志;20##年02期
2． 朱宁喜；动眼神经损伤后神经再生和电刺激对其作用的研究；山东大学20##年
3． 赵晴晴；健康时报, 20##-03-25
4． 陈月菲，郑恒，卢广兴，肖行贞；肇庆卫生学校，广东肇庆.
5． 张志琴，刘政政，赵磊，李丽，马秀敏；石河子大学医学院医疗系, 新疆石河子832002 ; 新疆医科大学, 新疆乌鲁木齐830008
6． 刘紫荆,陈筱春. 骨骼肌收缩实验的改进尝试[J].陕西: 太原师范学院学报(自然科学版),2008
7． 吕荣上，姜文凯.神经一肌肉疲劳的生理学研究进展[J].体育与科学.2001,(22):34-36.
8． 张志雄.生理学：上海科学技术出版社，2006.8
第二篇：不同强度和频率的刺激对肌肉收缩的影响 (2)
不同强度和频率的刺激对肌肉收缩的影响
【摘要】目的：分析探讨刺激强度和刺激频率与骨骼肌收缩张力的关系。方法：制备蟾蜍腓肠肌坐骨神经标本，保持刺激时间恒定的条件下，逐步增加或减小对蟾蜍坐骨神经的刺激强度和改变电脉冲刺激频率，观察记录腓肠肌收缩张力。结果：刺激波宽0.1ms的单刺激，阈刺激强度为0.25±0.09V最大刺激强度为0.39±0.24V阈强度刺激时的肌肉收缩力1.56±1.50g显著低于最大刺激强度刺激时的肌肉收缩力19.09±14.50g，两者有显性差异（p<0.01)；刺激波宽0.1ms，最大刺激强度时，单收缩的刺激频率为4.22±1.09Hz，不完全强直收缩的刺激频率为4.22±1.09至24.89±6.25Hz 、完全强直收缩的刺激频率为35.44±10.86Hz，不完全强直最大收缩力88.55±38.18g和完全强直最大收缩力111.41±36.24g显著高于单收缩的最大收缩力为20.45±16.24g（p<0.01）。结论:刺激波宽一定时，骨骼肌收缩张力在一定范围内随刺激强度的增加而增加；刺激波宽一定，刺激强度为最大刺激时，骨骼肌收缩张力在一定范围内随刺激频率的增加而增加；刺激波宽一定，刺激强度为最大刺激时，骨骼肌在一次兴奋之后，在一定时间内处于不应期，对刺激无反应；当过了不应期后，肌肉组织才能对刺激做出反应而产生动作电位。
【关键词】 强度 频率 收缩张力 坐骨神经
肌肉、神经和腺体组织称为可兴奋组织，它们有较大的兴奋性。不同组织、细胞的兴奋表现各不相同，神经组织的兴奋表现为动作电位，肌肉组织的兴奋主要表现为收缩活动。因此，观察肌肉是否收缩可以判断它是否产生了兴奋。一个刺激是否能使组织发生兴奋，不仅与刺激形式有关，还与刺激时间、刺激强度、强度-时间变化率三要素有关，用方形电脉冲刺激组织，则组织兴奋只与刺激强度、刺激时间有关[1]。
1、材料与器材
1.1实验动物：蟾蜍
1.2实验药品：任氏液
1.3实验仪器设备：PcLab信号采集处理器，计算机，肌肉张力换能器，蛙板，玻璃分针，探针，剪刀，镊子，大头针，铁支架。
2、方法
2.1 制备蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本
2.1.1 毁蟾蜍脑、脊髓，剥去一侧下肢皮肤，固定标本；
2.1.2 分离坐骨神经，穿线备用
，将连接腓肠肌腱的线与张力换能器相连，注意铭牌向上，连线与桌面垂直，调节前负荷至2～5g。然后将坐骨神经放在刺激电极上，保证接触良好。
2.2 连接PcLab信号采集处理系统
参数设置：通道模式为张力，采样频率400Hz～1kHz，主周期1s，波宽0.3ms，延时1ms。
2.3 刺激强度对肌肉收缩张力的影响：单个方波，波宽0.1ms，初始刺激电压0.15V，步长0.01V，刺激坐骨神经，记录肌肉收缩张力，刺激电压增至肌肉收缩张力不再增加时止。
2.4 刺激频率对骨骼肌收缩张力的影响：最大刺激电压，波宽0.1ms，初始刺激刺激频率1Hz，步长1Hz ，刺激坐骨神经，记录肌肉收缩张力，刺激频率增至肌肉收缩波在收缩相融合时止。
2.5 不同刺激波间隔刺激对肌肉收缩的影响：采样频率40KHz，扫描速度20ms/div，最大刺激强度，刺激波宽0.1ms，延迟1ms，双脉冲波间隔分别为0.5、2、20ms，刺激坐骨神经，同步记录神经干动作电位(action potential ，AP)和肌肉收缩张力（ tension，T ）。
2.6 记录原始数据，用Excel进行统计处理
3.实验结果
3.1 刺激强度对骨骼肌的影响
3.1.1 选用刺激波宽0.1ms的单刺激，阈刺激强度为0.25±0.09V最大刺激强度为0.39±0.24V阈强度刺激时的肌肉收缩力1.56±1.50g显著低于最大刺激强度刺激时的肌肉收缩力19.09±14.50g，两者有显性差异（p<0.01)。实验数据及统计结果如表1所示。
表1.刺激强度对骨骼肌的影响
注：*P<0.01 VS 阈刺激收缩强度
3.1.2 选用强度递增模式，记录在不同强度下肌肉的收缩张力，如图1；可见刺激波宽一定时，骨骼肌收缩张力在一定范围内随刺激强度的增加而增加。原始数据见附表1。
3.2 刺激频率对骨骼肌的影响
3.2.1 刺激波宽0.1ms，最大刺激强度时，单收缩的刺激频率为4.22±1.09Hz，不完全强直收缩的刺激频率为4.22±1.09至24.89±6.25Hz，完全强直收缩的刺激频率为35.44±10.86Hz，不完全强直最大收缩力88.55±38.18g和完全强直最大收缩力111.41±36.24g显著高于单收缩的最大收缩力为20.45±16.24g（p<0.01）。实验原始数据和统计结果如表2所示。
表2.刺激频率对骨骼肌的影响
注：*P<0.01 VS 单收缩张力；＃P<0.01 VS 单收缩张力
3.2.2 选用频率递增模式，记录在不同强度下肌肉的收缩张力，如图2，刺激波宽一定时，骨骼肌收缩张力在一定范围内随刺激频率的增加而增加。原始数据见附表2。
3.3 不同刺激波间隔的刺激对肌肉收缩张力影响
选用双刺激模式，时间间隔分别为0.5，2，20ms，统计结果见表3。可见在20ms时间间隔骨骼肌的张力明显高于0.5，2ms（*P<0.05）.
表3.不同刺激波间隔的刺激对肌肉收缩张力的影响
注：*P<0.01 VS 0.5ms 组； *P<0.05 VS 2ms 组
3.4潜伏期，收缩期以及舒张期时间的测定
测得潜伏期时间：35.00ms；收缩期时间105.00ms；舒张期时间：265.00ms。
4． 讨论
4.1 不同刺激强度对肌肉收缩张力的影响
腓肠肌大多数是快颤搐型肌纤维[2]，支配腓肠肌收缩的神经是Aa纤维，Aa纤维的直径有很大差异，其阈值也有较大差异[2,3]。单个恒定时间的方波电压刺激坐骨神经干，电压低于阈值的强度刺激，坐骨神经干支配腓肠肌的神经纤维不发生兴奋，其所支配的肌细胞也不会发生兴奋和收缩。刺激电压达到阈强度时，坐骨神经干中阈值最低的神经开始兴奋，其所支配的运动单位的肌纤维兴奋并发生收缩，刺激强度逐渐增大，坐骨神经干中兴奋的神经纤维增加，兴奋和收缩的运动单位增加，其所募集的收缩张力也增加。刺激电压达到使支配腓肠肌的Aa纤维全部兴奋，腓肠肌全部的运动单位增加都兴奋并收缩，收缩张力达单收缩最大值。所以实验中出现了，在一定范围内骨骼肌收缩张力随着电压的增加而增大，最后趋于恒定（图1）。
4.2 不同刺激频率对肌肉收缩张力的影响
以最大刺激电压的连续脉冲刺激坐骨神经干，剌激波的间隔时间大于单收缩的持续时间，肌肉收缩波呈现与刺激频率相同的单收缩波；刺激波间隔小于单收缩的持续时间，肌肉收缩波发生融合，融合发生于舒张期，出现不完全强直收缩；融合发生于收缩期，出现完全强直收缩波，但神经干动作电位不发生融合。随着刺激波间隔的减小，腓肠肌收缩张力也逐渐增大，强直收缩产生的张力显著大于单收缩。肌肉单收缩时，胞浆内Ca2+浓度升高的持续时间太短，被激活的收缩蛋白尚未产生最大张力时，胞浆Ca2+浓度即已开始下降，单收缩产生的张力不能达到胞浆内Ca2+浓度相应的最大张力。强直收缩时，肌细胞连续兴奋，引起终池中的钙连续释放，胞浆内的Ca2+浓度持续升高，使肌肉未完全舒张或未舒张时进一步收缩，使收缩张力逐渐增大，完全强直收缩时收缩张力达到了一个稳定的最大值[4]。
4.3 不同刺激波间隔对肌肉收缩张力影响
刺激波间隔小于0.5ms时，神经干的第2个动作电位消失，肌肉的收缩力显著降低。刺激波间隔小于神经干不应期，第二个刺激落在神经干的绝对不应期内，神经纤维不发生兴奋；刺激波间隔小于2ms时，神经干的第2个动作电位消失，刺激波间隔小于神经干不应期，第二个刺激落在神经干的绝对不应期内，神经纤维不发生兴奋；刺激波间隔小于20ms时，神经干的第2个动作电位出现，神经纤维发生兴奋。
4.4影响实验结果的因素
本实验中观察到的阈刺激是神经刺激而非肌肉刺激，因为电极直接接触的是分离出的坐骨神经，电刺激使神经细胞产生兴奋，沿神经纤维传导，通过神经肌肉接头的化学传递，使肌肉终板膜上产生终板电位，引起肌肉兴奋，通过兴奋-耦联机制使腓肠肌肌肉收缩。
如此测得的阈刺激理论上比较可靠，但在实际操作中肯定会出现误差，主要影响因素有：
(1).分离坐骨神经时，应避免强力牵拉和手提神经或夹伤神经肌肉，否则易使神经受损而出现传导障碍或肌肉收缩障碍。
(2).毁蟾蜍脑脊髓时要彻底，使测得的数据能真实显示坐骨神经受刺激对肌肉收缩的影响，而排除中枢神经系统反射的干扰。
(3).离体坐骨神经腓肠肌标本的制备好后需不时滴加任氏液保持生物活性。实验中发现未及时滴加任氏液而致标本干燥时，测得的肌肉收缩最大张力比相同刺激条件下的湿润标本要高出很多倍。原因可能是标本不能保持正常生物稳态而发生挛缩。
(4).神经骨胳肌接头处容易由于连续刺激使接头处神经递质耗竭而发生疲劳，所以每次在肌肉收缩后，应让肌肉休息一定时间再作下一次的刺激，特别是在观察刺激频率的影响时，让肌肉有充分时间恢复到原始状态，回复静息电位水平，也让神经递质再形成。
(5).尽量保持实验装置周围理化环境的稳定，包括自然因素和人为因素对张力换能器拉线的干扰，保持拉线的垂直和张力（前负荷）不变。
参考资料：
1.陆源,夏强. 生理科学实验教程.浙江大学出版社.杭.2004:P208.
2.D . J.AIDLEY.可兴奋细胞的生理.学科学出版社. 北京.1983.9第1版. P275、 P61.
3.Mary A.B.勃雷兹尔.神经系统的电活动.科学出版社.北京.1984第1版. P45.
4.姚泰.生理学.人民卫生出版社.北京.2002.4第1版.P62.
附件：
附表1.刺激强度与骨骼肌收缩张力曲线原始数据
附表2.刺激频率与骨骼肌收缩张力曲线原始数据
附图1.刺激强度与肌肉收缩的曲线记录图
附图2.刺激频率与肌肉收缩曲线记录图