实验一 载网的认识和样品支持膜的制备
一、载网的认识
识别铜网的正反面：正面光滑较亮；反面较粗糙，边框较亮，中间较暗。
二、福尔莫瓦支持膜的制备
1．在水槽内盛满蒸馏水将已配好的福尔其瓦溶液倒入立式载玻缸或小烧杯中，另将若干新载玻片浸入装有0.02％中性皂液的载玻缸中。
2．取一载玻片，用白绸布擦净，使之光洁，然后手持载玻片一端，插入福尔莫瓦溶液中，再垂直匀速取出，在空气中稍晾片刻，使其形成一层膜。用刀片在膜的四周各划一条刻痕，对膜哈气后，将载玻片有膜一端成45度角或垂直慢慢压入水中，使膜缓缓地被剥离并漂浮在水面上，取出裁玻片。
3.根据Formvar膜在水面上呈现的干涉色检查膜的厚度，选取厚度均匀的银灰色的膜。淡黄色的较厚，浅红色的更厚都不能用。颜色不均匀、有皱纹和尘埃或破损的不能用，弃去。
4. 将清洁的铜网排列在膜上，然后剪取一块比膜的面积稍大的滤纸片与有铜网的膜贴附，随着滤纸的吸湿逐步与膜、铜网阽附好后，边提边向上翻转离开水面，放置在有滤纸的平皿中，干燥后放于干燥器中保存备用。
实验二 透射电镜生物样品的制备
一、取材：
（1）动物样品：用乙醚麻醉小白鼠进行活体解剖，取出所需组织器官放在预冷的载玻片上，立即滴加预冷的3%戊二醛固定液。用锋利的刀片将组织先切成宽1mm，长3~4mm的小条，再切成1mm3的标准小块（肌肉组织应该保持截面积为1mm2的长条状），用牙签拨入盛有冷的3%戊二醛固定液的小瓶中。
（2）植物样品：从植株上取下试样立即放在预冷的载玻片上，并滴上数滴预冷的3%戊二醛固定液，用锋利刀片切取1mm宽，3~4mm长的小条，然后用牙签轻轻地拨入盛有冷的3%戊二醛固定液的小瓶中（小瓶置于冰盘中以保持0~4℃）, 叶片需盖紧瓶塞后用注射器或置于真空干燥器中抽气，直至样品沉落瓶底。
二、前固定：更换新鲜的3%戊二醛固定液，固定2～5小时或过夜，在0~4℃进行。
三、漂洗：用吸管吸出戊二醛固定液，加入0.1M的磷酸缓冲液漂洗三次，每次15~20分钟。
四、后固定：吸出漂洗液，在通风橱中加入1%的四氧化锇固定液，固定2小时后，吸出固定液，加入0.1M的磷酸缓冲液漂洗三次，每次15~20分钟。
五、脱水：吸去缓冲液，注入乙醇逐级梯度脱水：50%、70%乙醇0~4℃下各15分钟； 80%、90%、95%乙醇室温下各15分钟；100%乙醇两次，每次15分钟。再转入环氧丙烷，室温下置换两次，每次15分钟。
六、浸透：按照Epon812环氧树脂包埋剂配方配制包埋剂，必须充分搅拌，混匀后分步进行浸透。（1）环氧丙烷：包埋剂=3：1，浸透1小时；（2）环氧丙烷：包埋剂=1：1，浸透1小时；
（3）环氧丙烷：包埋剂=1：3，浸透2小时；纯包埋剂浸透2~5小时。每一级浸透都将样品瓶置于往复式振荡器上，以加速浸透而缩短浸透时间。
七、包埋：将胶囊立插入胶囊架上，把样品用牙签挑入胶囊底部正中间，注入包埋剂并插入标签。纤维类等有方向要求的样品，应该用浅槽模板作定向包埋。
八、聚合：将包埋板放入37℃烘箱中12小时，45℃烘箱中12小时，60℃烘箱中24小时，取出即为样品包埋块。
九、包埋块的修整：
1、剥去胶囊，将包埋块安装在样品夹头上，顶端露出3~5mm。先用单面刀片水平横切包埋块顶端的包埋介质，直至样品将被暴露出来。再将包埋块顶部四周的侧面切四刀，将包埋块上部切成金字塔形，塔顶面积约1mm2。
2、在实体显微镜下用新的单面刀片进一步修整顶面，使其光滑平整，最好呈梯形或长方形，上下两边要求平行，顶面积约0.5×0.5 mm2，四个斜面坡度以45°为宜。
十、玻璃刀的制作：
1、制方形玻璃块：玻璃条洗净擦干，利用制刀机切断成方块。将玻璃条一端插入夹头底部，转动固定杆使夹头下落，夹紧玻璃条；拉动划割器，使下部碳化钨砂轮划割玻璃条；向右转动断裂旋钮对玻璃条加压，使玻璃条沿划痕断裂，再转动固定杆抬起夹头，取出剩余的玻璃条。
2、制玻璃刀：用托架取出方形玻璃块，旋转45°角之后，置于夹头下；转动固定杆使夹头落下压紧方形玻璃块，拉动划割器，然后转动断裂旋钮，使有刻痕的方形玻璃沿着对角线断裂形成两块三角形的玻璃刀；用托架取出玻璃刀。
3、制作水槽：检查刀口合格的玻璃刀，沿着刀口齐用专用胶带做一水槽，并用石蜡封好以防漏水。
十一、超薄切片：
1、安装玻璃刀和包埋块：
（1）按照超薄切片机的操作程序，打开电源接通照明。
（2）将玻璃刀安装在刀座上，使刀口高度与刀座上的标杆高度相等，刀的前倾角为4°左右，夹紧。
（3）将夹有样品包埋块的夹头装在样品臂上，夹紧。通过超薄切片机上的双筒显微镜边观察，边调整样品块与刀的相对位置，旋转样品头夹具，调整刀座的位置，使样品包埋块端面与刀刃在三维方向上都平行。
（4）用注射器向玻璃刀水槽中注入双蒸馏水，并调节液面高度使之与刀刃一致。
2、切片：切片厚度选择0.5～2?m左右，以手动推进或半薄推进方式切出若干半薄切片。用细玻璃棒将切片捞在载玻片上的水滴中，再将载玻片移在酒精灯上方烘烤，待水滴干后切片就贴在载玻片上。用滴管吸一滴2%的亚甲蓝染色1~2分钟，洗去多余的染色液，烤干后用光镜检查。根据观察情况再对包埋块作适当的定位修整。重新选择最佳刀刃，将切片速度调至2~3mm/秒，切片厚度选择50nm左右，进行超薄切片并微调切片厚度，直到水槽表面观察到切出灰色、银白色、浅黄色的片子为宜。
3、展片和捞片：用滤纸沾少许氯仿溶液，在切片上方停留片刻，利用有机溶剂的挥发气体使切片展平（注意：不能触及水面和切片）。用睫毛针将符合要求的切片拨在一起，然后用镊子夹持载网膜面朝下，使载网与切片所在的水面平行，对准切片并迅速与切片接触，沾取切
片。用滤纸沿着边缘吸去水分。
十二、染色：
1、铀染：用滴管将醋酸双氧铀染色液滴于蜡盘中，将有切片的载网膜面朝下漂浮在染色液滴的表面上。20~30分钟后用镊子持载网，依次在三个盛有双蒸馏水的小烧杯中清洗，然后将载网放在干净的滤纸上。
2、铅染：在另一个蜡盘中的四周放一些固体NaOH，吸取柠檬酸铅染色液滴于蜡盘中，然后将经过铀染后尚处于半干半湿的载网膜面朝下漂浮在染色液表面，盖好盖子以减少染色液与空气接触，染色10~15分钟。然后用镊子夹持载网立即浸入盛有0.1N的NaOH溶液中清洗，再依次于另外三个盛蒸馏水的小烧杯中清洗，摆放在干净的滤纸上，自然干燥后即可观察。
实验三 常规扫描电镜样品制备技术
1、准备样品托：用抛光膏擦净样品托正面后，再用棉签蘸丙酮擦净台面上的抛光膏，凉干备用。
2、取样与清洗：（1）植物样品先用水冲洗掉表面泥土和灰尘，叶片切取10mm2小片，根或茎可切取10mm长的小段，立即投入2％的戊二醛固定液中；（2）小鼠内脏及肌肉组织切成厚度为1mm、大小为10mm的片状，立即投入2％的戊二醛固定液中。
3、固定与清洗：扫描电镜样品的固定处理包括预固定、前固定、漂洗、后固定、漂洗五步组成，所用固定剂的种类、操作和条件与透射电镜超薄切片实验基本相同（参见实验二）。由于扫描电镜仅观察样品的表面形态，样品可适当增大，并可以根据样品块的大小适当缩短固定时间。
4、脱水：用50％～100％系列乙醇脱水。
5、置换：第一步：置换乙醇。用滴管吸去脱水剂并迅速注入醋酸异戊脂与脱水剂1：1的混合液，浸渍10～20分钟吸弃上述混合液，注入纯醋酸异戊脂，摇动并浸渍10～20分钟。第二步：置换醋酸异戊脂。先将样品由小瓶中取出，保持湿润状态下装入临界点干燥仪的样品笼中，再把样品笼摆放到预冷过的临界点干燥仪的样品室中。盖紧样品室上盖，充入液态二氧化碳（液面须高于样品笼面）。缓慢排出二氧化碳，直到室内尚存少量二氧化碳，能保持样品湿润为止。重复充液排气操作三次。
6、临界点干燥：打开进液阀门，向样品室内充入液态二氧化碳（高度不超过样品室高度的80%）。将加热温度旋钮设置到32℃，对样品进行加热，并监测压力表，当温度达到32℃、压力超过73大气压时，可通过观察窗观察室内二氧化碳状态，若二氧化碳呈现混浊态，即达到临界状态。在保持32?/73大气压状态下，以低于2L/min，速度排气，直到压力表气压降到零为止。
7、粘贴样品：等待样品室温度回升到室温时，打开样品室，取出样品笼，用牙签将少量导电胶涂在样品台上，胶面应该稍微小于样品底面积。用镊子轻夹样品侧面，待观察面朝上，将样品置于已涂胶的样品台上。
8、离子溅射镀膜：开启电源和真空泵。打开真空罩，装入样品托，盖严真空罩（可适当涂抹甘油以保证密封良好）。溅射仪手柄转向“真空”位置，开始抽真空，注意观察真空表，待真 2
空度优于0.1乇后，可以加高压进行溅射。镀膜开始缓慢调节高压旋钮加大高压，可观察到产生紫色辉光放电现象，增大电压时，辉光增强。同时注意观察真空表的指示，使真空度保持在指定区域内，溅射直到符合样品要求为止。等待片刻，放气、开罩，取出样品托放入干燥皿中。 作者：陶忠芬，江海东，李飞，路菊，可金星
作者：朱惠安,李传课,罗耀红 【摘要】 目的 观察滋阴明目丸对视网膜光损伤大鼠的保护作用及机理。方法 将70只Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为7组,除空白对照组外均采用自制光损伤装置造成视网膜光损伤模型,光照后3 d开始灌服滋阴明目丸及对照药物,连续15 d,取视网膜做病理形态学检查,观察视网膜超微结构变化。结果 受损的视细胞逐步得到修复,视网膜形态结构渐趋正常。结论 滋阴明目丸可改善视网膜超微结构。
【关键词】 滋阴明目丸；光损伤；视网膜；超微结构；大鼠
Abstract：Objective To investigate the protective effect and mechanism of Ziyinmingmuwan on retina against photic injury. Methods Seventy Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 7 groups, with 6 groups prepared as the models of phototrauma at first and another group taken as blank control. After three days, the animals in the treatment and control groups were treated with Ziyinmingmuwan and control agent respectively for 15 days during the period of experiment. Following this, the retinal tissues were examined by light and electron microscopy. Results The retinal lesions were repaired and the morphological structure of the retina was brought to normal gradually. Conclusion Ziyinmingmuwan could improve ultrastructure of the retina.
Key words：Ziyinmingmuwan；photic injury；retinal；ultrastructure
光化学损伤是视网膜光损伤中最普遍的一种损伤,是一个退行性变性过程,其病理过程与年龄相关性黄斑变性等视网膜变性疾病有许多相似之处[1]。滋阴明目丸以滋补肝肾、活血明目立法,对以肝肾不足为基本病机的视网膜变性疾病有一定疗效[2-3]。20xx年10月－20xx年1月,笔者采用大鼠视网膜光化学损伤模型作为对象,研究滋阴明目丸对光化学损伤大鼠视网膜超微结构的影响,探讨其对视网膜光感受器细胞的保护作用。
1 材料与方法
1.1 药物
滋阴明目丸：选用熟地黄、黄精、枸杞子、菟丝子、山茱萸、淮山药、茯苓、楮实子、黄精、牡丹皮、三七、丹参、牛膝、当归、石决明、川芎、羌活、石菖蒲等药,按现代工艺制成浓缩丸,湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。杞菊地黄丸,长沙九芝堂集团有限公司生产,批号：ZZ-0193-湘卫药准字(1992)第002078号。威氏克胶囊,北京第二制药厂生产,京卫药准字(1996)第102088号,批号021007。
1.2 动物
选用SD大鼠70只,体重180～220 g,雌雄各半,湖南中医学院医学实验动物室提供。饲养条件：室温保持在18～25 ℃,空气流通,相对湿度55%～70%,12 h光照维持,昼夜循环,动物自由摄食饮水,饲养10 d。
1.3 造模
参照Hansson[4]方法自制光损伤装置。光照箱的6个面分别安装4条15 w的白色荧光灯管(Philips),上方安装有排风孔,下方为密集的排气孔,箱内安放2个有机玻璃透明箱,体积为(48×24×25)cm3。光照箱中心向各方向平均照度为(1 900±106.9)lux,相当于大鼠正常活动时眼球水平的各箱壁的照度为2 000 lux,光照箱内的平均温度控制在22～24 ℃,所有实验用大鼠均在12 h明(20～50 lux)以及12 h暗(0～12 lux) 的循环光环境下适应10 d,乙醚麻醉缸中约5 min吸入麻醉,缝线开睑,接受3 h持续光照射。光照后立即拆除开睑缝线,送回暗环境中。
1.4 分组及处理
70只大鼠随机分为滋阴明目丸大、中、小剂量组及杞菊地黄丸组、威氏克组、模型对照组、空白对照组。于光照后3 d开始给药,连续给药15 d。滋阴明目丸大剂量组：每天灌服23.4 g/kg混悬液(相当于成人剂量的3倍)；滋阴明目丸中剂量组：每天灌服7.8 g/kg混悬液(相当于成人用量)；滋阴明目丸小剂量组：每天灌服2.6 g/kg混悬液(相当于成人剂量的1/3倍)；杞菊地黄丸组：每天灌服1.62 g/kg混悬液(相当于成人剂量)；威氏克组：每天灌服0.054 g/kg溶液(相当于成人剂量)；模型对照组与空白对照组灌胃生理盐水(与滋阴明目丸中剂量组等容)。每天上、下午各灌服1次,每次给全日量的1/2。第16天将所有大鼠用25%乌拉坦腹腔注射麻醉(0.3 mL/100 g),断颈处死,冰浴下摘取眼球,沿赤道部剖开,去除眼前节,剥离视网膜组织。
1.5 电镜观察 取大鼠视网膜标本,2.5%戊二醛固定24 h以上,2%锇酸固定1 h,行50%、70%、90%、100%丙酮梯度脱水,每次10 min,Epon812环氧树脂∶纯丙酮=1∶1浸泡24 h,Epon812混合液包埋24 h (60 ℃),修块定位,超薄切片,醋酸双氧铀和枸缘酸铅双重染色,透射电镜下观察大鼠视网膜超微结构改变。
1.6 光镜观察
取大鼠视网膜标本,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,间断连续切片,切片厚4 μm,HE染色,光镜下观察视网膜形态。
1.7 统计学方法
等级资料用秩和检验,组间比较用q检验。
2 结果 2.1 对大鼠视网膜超微结构的影响
空白对照组：视网膜视细胞形态正常,内、外节线粒体排列整齐；双极细胞正常,仅少数线粒体水肿；节细胞层结构正常。模型对照组：视细胞胞浆水肿,空泡状,其视盘外节部的膜盘线粒体紊乱,基质淡化,形成空泡区,视细胞内的线粒体也有类似变化,部分区域视杆、视锥细胞严重水肿,胞浆崩解；内核层(系双极细胞)间质水肿,核浓缩,胞浆线粒体空泡变,内核层与内网层之间间质水肿,双核细胞内局部水肿,线粒体空泡变；节细胞层内线粒体广泛空泡变,间质水肿,部分节细胞固缩,染色质浓染。滋阴明目丸中剂量组：视盘仅有小的裂隙,视细胞趋于正常；内核层正常,仅个别线粒体空泡变；节细胞内线粒体不同程度的水肿,余正
常。威氏克组：视盘正常,其内裂隙更少,视细胞正常；内核正常；节细胞内线粒体水肿,空泡变较模型组稍强。杞菊地黄丸组：视盘外节部线粒体有轻微水肿,少量裂隙；视细胞内线粒体水肿,余正常；双极细胞内线粒体水肿,余正常；节细胞内线粒体水肿,核浓缩。 2.2 对大鼠视网膜组织病理形态的影响 2.2.1 分级标准
“-”级：视网膜形态正常,视杆细胞排列整齐,结构层次清楚。“+”级：视网膜结构层次清楚,视杆细胞排列基本整齐,外核层出现灶性脱落。“++”级：视网膜结构基本清楚,有灶性核浓缩,部分出现淡染,不规则碎核。“+++”级：各层结构不清,出现坏死脱落,外核层稀疏散在,有淡染,不规则破碎细胞核。
2.2.2 各组大鼠视网膜组织病理形态改变情况
观察结果经多个样本的秩和检验,H值为37.813,P<0.005,有统计学意义,可认为7组标本之病理形态改变有不同。各组与模型对照组两两比较,滋阴明目丸大、中剂量组、空白对照组为P<0.01；滋阴明目丸小剂量组、杞菊地黄丸组、威氏克组为P>0.05。见表1。 表1 光镜下各组大鼠视网膜组织病理形态的改变（略） 3 讨论
光性视网膜损伤是一渐进性病理过程。视网膜光损伤后可出现视网膜外核层变薄、内外节排列紊乱；光感受器细胞核肿胀,内节线粒体肿胀,外节水肿,RPE顶端出现微绒毛消失,溶酶体增多等病理改变[1]。 本实验观察发现,模型对照组光镜下可见各层结构不清,出现坏死脱落,外核层稀疏散在,有淡染,并可见不规则破碎细胞核。电镜下观察光感受器细胞胞浆水肿,形成空泡,线粒体基质淡化,部分区域细胞严重水肿,胞浆崩解；双极细胞间质水肿,核浓缩,胞浆线粒体空泡变；内核层与内网层之间间质水肿,双核细胞内局部水肿,线粒体空泡变；节细胞层可见节细胞内线粒体广泛空泡变,间质水肿,部分节细胞固缩,染色质浓染。说明本实验条件下可明显破坏视网膜的组织结构。
治疗后观察发现,光镜下滋阴明目丸大、中剂量组视网膜病理形态明显改善,视网膜结构层次渐趋清楚,视杆细胞排列基本整齐,仅部分标本出现外核层灶性脱落、不规则碎核,与模型对照组比较,有统计学意义；滋阴明目丸小剂量组、杞菊地黄丸组及威氏克组病理形态改变尚不明显。而透射电镜显示,滋阴明目丸组、杞菊地黄丸组及威氏克组视网膜超微结构均有明显改善,视盘仅有小的裂隙,视细胞趋于正常；内核层正常；仅个别线粒体空泡变；节细胞内线粒体不同程度的水肿,余正常。说明三类药物对视网膜超微结构的损伤均有修复作用,而以适量的滋阴明目丸作用效果最佳。 【参考文献】
[1] 谢伯林,王正国,朱佩芳,等.大鼠视网膜光化学损伤的病理特征[J].第三军医大学学
报,2000,22(5)：442－445.
[2] 李传课,李 波.滋阴明目丸治疗肝肾阴虚视网膜色素变性与老年黄斑变性的临床观察[J].湖南中医学院学报,2001,21(3)：38－40.
[3] 李 波,邝国平.滋阴明目丸治疗肝肾阴虚萎缩型老年性黄斑变性的临床和实验研究[J].中国中医眼科杂志,2001,11(4)：206－211.
[4] Hansson HA. A histochemical study of oxidative in rat retina damages by visible light[J].Exp Eye Res,1970,9：285－296.
免疫电镜技术运用过程中电子染色方法的选用
作者：赵承军，张东梅，邓其跃，陈鹏慧，蔡文琴，陶忠芬，张吉强 【摘要】 目的 探究免疫电镜不同染色方法对免疫组化阳性实验结果影响的关系。方法 组织切片经常规免疫组化（雌激素受体GPR30）并行DAB-硫酸镍铵显色后进行电镜切片，然后分为双氧铀-柠檬酸铅双染、双氧铀单染与未染色3组，以便对不同电子染色结果进行比较。结果 GPR30免疫阳性产物位于细胞核外的膜性结构上，在铀-铅双染组显示很高的电子密度，但是背景染色也很深，在铀单染组的反差比较好，而未染色组的反差更好。结论 免疫电镜技术中针对不同的免疫阳性反应选用不同的电子染色方法，有利于阳性结果的判断与鉴别。
【关键词】 免疫电镜技术；雌激素受体；海马；电子染色 Abstract: Objective To explore different immunoelectronic staining methods on the ultralocalization of immunohistochemistry. Methods The novel membrane receptor GPR30 immunohistochemistry with DAB-nickel intensification was applied, then ultrathin sections were prepared and different eletronic staining (citric lead plus dioxydate uranium, dioxydate uranium-only or no electrostaining) was carried out. Results Under light microscope, GPR30 showed very strong immunoreactivity in the hippocampal pyramidal neurons. Under electronic microscope, the blank staining (no electrostaining) sections showed the highest contrast, while the double staining sections showed the lowest contrast. Conclusion For different
immunoreactive intensity, different electronic staining was suggested.
Keywords: immunoelectronic microscope; estrogen receptor; hippocampus; electronic staining 免疫电镜标记技术已广泛应用于生物学的各个方面［1-2］，它能在超微结构水平上精确、细致地定位，特异性高，方法简便，优越性十分显著。而如何能成功确定免疫反应阳性区域并选取合适的区域是免疫电镜成败的关键。为此我们应用免疫电镜技术但选用不同的电子染色方式，以比较几种电子染色的优缺点，从而为免疫电镜技术的开展提供一些参考。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
成年雌性SD大鼠共12只，体重（210±10）g，由第三军医大学实验动物中心提供。随机分为实验组（加抗体组）和空白对照组（不加抗体的阴性对照），实验组又分双氧铀-柠檬酸铅双染色、双氧铀单染与未染色三组进行对比观察。
1.2 主要试剂和药品
羊抗兔GPR30（ab12563）多克隆抗体购自英国Abcam公司，抗体稀释液（antibody diluent with background-reducing, S302281）与羊抗兔EnVisionTM试剂盒（GK400305）购自Dakocytomation公司，封闭血清、DAB显色试剂盒等购自北京中杉公司，其余试剂均为市售分析纯。
1.3 仪器设备
TECNAI-10型透射电子显微镜（PHILIPS公司），超薄切片机（LKB公司）。
1.4 免疫组织化学染色 1.4.1 动物固定、取材 动物用5%水合氯醛麻醉，开胸，经左心室插管到主动脉，剪开右心耳，先后灌注生理盐水200 mL和4%多聚甲醛溶液300 mL。灌注后取出大脑组织，分离海马放入2.5%戊二醛溶液。然后用振荡切片机制备海马切片（片厚100 μm），切片入2.5%戊二醛溶液后固定2 h，用0.01 mol/ L PBS pH为7.2～7.4洗涤3次，每次1 h，最后保存于4 ℃备用。
1.4.2 包埋前免疫电镜步骤 按文献［3-4］进行。简述如下：3%H2O2封闭15 min，0.01 mol/L PBS漂洗后，用正常山羊血清封闭30 min，然后加入一抗（GPR30，1∶200）于4 ℃孵育过夜。PBS漂洗后加入羊抗兔EnVisionTM试剂，室温1 h，0.01 mol/L PBS漂洗后用硫酸镍铵-DAB显色5 min。在解剖显微镜下选取免疫阳性反应区域，修成0.1 mm×0.1 mm×1 mm大小，放入0.01 mol/L的PBS，经1%锇酸后固定、丙酮梯度常规脱水、环氧树脂618包埋、半薄切片定位后，70 nm 超薄切片捞于有支持膜的200目镍网上，按实验分组进行电子染色，透射电子显微镜观察拍照。空白对照用PBS取代一抗，其它步骤相同。有DAB颗粒沉积者为阳性。
2 结果
在光镜下，GPR30免疫阳性产物清楚地位于海马椎体神经元的核外区域，但是由于神经元的细胞核体积较大，免疫阳性产物究竟在细胞膜或胞浆内难以明确。在透射电镜下观察，大鼠海马神经元细胞超微结构清晰，形态保存基本良好。实验组海马神经元中均出现电子密度高的颗粒，呈小团状或点状分布于细胞内，主要位于粗面内质网，也可定位于线粒体及胞浆中的膜性结构上。在铀-铅双染组可见很深的免疫阳性产物，颗粒成团密集、着色很深，但是其背景染色也较深（图1a），铀单染组也有较好的染色背景，其免疫阳性颗粒更清楚（图1b）。未经电子染色组免疫阳性反应颗粒着色适中，特异性强，显示更好的反差（图1c）。空白对照组即免疫组化过程中PBS组，海马神经元内未见明显免疫反应阳性的电子密度高的颗粒（图1d）。 a:铀-铅双染;b:双氧铀单染;c:未经铀铅染色;d:免疫组化未加一抗,其余处理同b; nu:细胞核 图1 不同电镜染色方法对免疫电镜结果的影响（略）
3 讨论
免疫电镜在形态学研究中具有很广泛的应用，然而其染色程度却很难控制，一般不容易得到理想的染色结果。免疫电镜的标记方法比较多，常用的标记方法有胶体金标记以及酶标法。胶体金标记的方法由于其颗粒大小一致，在电镜下显示清楚，所以有广泛的应用。但是，由于胶体金在光镜下看不见而无法准确定位，免疫组化是否成功、组织的阳性区域在什么位置无法明确，因而胶体金标记的方法在一定程度上带有一定的“盲目性”，最终使得免疫电镜的工作量非常大而很难得到理想的结果。
相比之下，酶标电镜免疫组化就直观很多，大大简化了免疫电镜的工作量。在酶标电镜免疫组化技术中，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来，最常用的显色剂为DAB（其显示结果为棕黄色）。DAB是广泛应用的电子供体之一，较敏感且终产物具有嗜锇性，经锇酸处理，电子密度增加，适于在电镜下确定抗原的存在部位［5］。尽管DAB标记法存在阳性颗粒大小不均一，导致在电镜下显示效果不如胶体金的不足，但是通过DAB呈色反应，在光镜下可以清楚地确定组织切片中阳性细胞的位置，从而为成功进行电镜下观察奠定了很好的基础。这是胶体金标记方法无法比拟的。
为了增强电子密度，一般都会在锇酸处理后用铀-铅染色。在实际工作中我们发现不同的电子染色对实验结果会产生一定程度的影响，为了选择合适的电子染色方法我们设计了本研究。本文实验结果表明，如果免疫反应阳性产物较多或较强，则在制作电镜标本时不需要进行后期的双氧铀-柠檬酸铅双染色，这样可以在镜下较好地发现阳性反应，电子反差适中，避免着色过深影响结果的现象（即未经电子染色组）。如果免疫反应阳性产物较弱，可以选用双氧铀单染色，这样的反差对发现阳性反应产物很有帮助（如单纯铀染色组）。只有当免疫反应阳性产物非常弱的情况下，才考虑使用双氧铀-柠檬酸铅双染色，因为应用此电子染色后，整个超微结构下背景的颜色都将加重，可能会影响免疫阳性反应的正确判断（铀-铅双染组）。另外标本经醛类固定剂固定后一般都残留有自由醛基，这种自由醛基较为活泼，可与各种抗体的ε-氨基结合，招致难以清除的非特异性染色。因此，标本固定后必须彻底清洗干净。我们选用常用的0.01 mol/L的PBS pH为7.2～7.4，固定后洗涤3次，每次1 h，最后4 ℃过夜，效果较为理想。
总之，免疫电镜实验过程中，即要考虑到保存较好的超微结构，又要能很好地体现免疫阳性反应。包埋前染色后的样本制作有一定的难度，但易于获得良好的免疫反应。包埋后染色方法简便，超微结构保存较好［6］，但样本制作对抗原带来的遮盖和诸多损伤，使得标记成功率低。因此，对于不同免疫反应性的标本应该根据具体情况，选用不同的电子染色方法，这样才有可能得到最佳的结果。
【参考文献】
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［5］ 蔡文琴.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术［M］.成都：四川科学技术出版社，1994.80.
［6］ 洪 涛.生物医学超微结构与电子显微镜技术［M］.北京：科学出版社，1980.125-127.