牛血清白蛋白的分离纯化及鉴定实验报告
作者：吴素平 魏利莎 孙锦 刘倩茹 胡健康 胡昭
（江南大学制药工程1003班）
摘 要：清蛋白，又称白蛋白（albumin,Alb）。由肝实质细胞合成，在血浆中的半寿期约为15-19天，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40%-60%。溶于水且遇热凝固的一种球形单纯蛋白。是一类不被50％饱和度的硫酸铵溶液沉淀的球状蛋白质。存在于动物组织、体液和某些植物的种子中。其分子量较低，溶于水，易结晶。在中性溶液中加热即沉淀或凝固。其重要代表是血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白、麦清蛋白、豆清蛋白及有毒的蓖麻蛋白。人血清（或血浆）清蛋白占血清蛋白质的55～63％，是血清中少数不含糖的蛋白质之一；分子量67500道尔顿，有584个氨基酸残基和高净电荷（等电点4.9）；与水、Ca2+、Na+、K+、脂肪酸及胆红素都有较好的结合能力。 最熟知的球蛋白是人血清球蛋白，可经电泳法分成α1-、α2-、β1-、β2-和γ-球蛋白，有免疫性。此外还有乳球蛋白、肌球蛋白等。人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白（γ-球蛋白）中。可分为五类，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）。其中IgG是最主要的免疫球蛋白。在体液pH7.4的环境中，白蛋白为负离子，每分子可以带有200个以上负电荷。本实验利用白蛋白带负电的性质对其采用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离提纯牛血清白蛋白。
关键字：白蛋白； 人血清白蛋白； SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、牛血清白蛋白的分离纯化
【实验目的】
掌握牛血清白蛋白分离纯化各步骤（分段盐析、离子交换层析）原理及操作方法。
【实验原理】
盐析法是一种利用蛋白质在不同浓度盐溶液中溶解度不同而分离的方法。通过将盐类加入到蛋白质溶液中，使蛋白质表面电荷被中和，水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。分段改变盐类浓度达到分离目的的方法叫分段盐析法。
DEAE-纤维素是一种应用广泛的阴离子交换剂，它本身带有正电荷，能不同程度地吸附溶液中的阴离子。层析时使用不同强度或不同PH值的缓冲溶液进行分段洗脱，含负电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，含负电荷多的蛋白质后被洗脱下来，于是不同蛋白质被分开。
【实验器材】
1.主要仪器 离心机、透析袋、磁力搅拌器、自动核酸蛋白质分离层析系统、分光光度计、水浴锅。
2.主要试剂
（1）小牛血清。
（2）饱和硫酸铵溶液：称取767g固体硫酸铵，加入1000ml水中，加热使之溶解。室温冷却后4℃静置过夜，然后用氨水将PH调至中性。
（3）固体硫酸铵。
（4）聚乙二醇20000.
（5）DEAE-纤维素。
（6）双缩尿试剂：用适量蒸馏水分别溶解1.6克硫酸铜及6克酒石酸钾钠，移入1L容量瓶中。加10％NaOH300ml后，再加蒸馏水定容至1L及得。此溶液久藏不坏，但如果出现暗红色沉淀，则不能使用。
（7）0.05mol/L pH6.4PBS。
(8)0.12mol/L pH6.4PBS。
【实验方法】
1.硫酸铵分段盐析
（1）量取20ml血清，倒入一干净烧杯中，缓慢加入饱和硫酸胺溶液20ml，边加边搅拌。放入4℃冰箱30分钟。
（2）从冰箱中取出烧杯，将血清倒入一离心管，3000rpm离心20分钟。
（3）将上清液倒入一干净量筒中，记录体积，倾入另一干净烧杯中，按17.6g/100ml的量称取固体硫酸铵，缓慢加入上清液中，边加边搅拌，4℃冰箱30分钟。
（4）3000rpm离心20分钟，沉淀用4ml 0.05mol/L pH6.4PB溶解。
（5）将上述液体对0.05mol/L pH6.4PB透析，过夜。
（6）用聚乙二醇20000浓缩至2-3ml。此蛋白粗提液留待层析。
2.DEAE-纤维素离子交换层析
（1）凝胶柱准备：连接自动核酸蛋白分离层析系统。夹住层析柱出口，加入1/3体积的0.05mol/L pH6.4PB，灌入层析剂，待层析剂自然沉降约2cm时，打开出口。层析柱填装完成后，盖好盖，调节适当流速，平衡过夜，等待加样。
（2）加样用吸管吸去胶面以上的缓冲液，立即加入蛋白粗提液（沿管壁缓慢加入）。
（3）洗脱：打开出口，待蛋白粗提液完全进入胶内后，用少量0.05mol/L pH6.4PB清洗管壁。用吸管补足层析柱胶面以上的缓冲液，用0.05mol/L pH6.4PB洗去2个层析柱体积，再换用0.12mol/L pH6.4PB洗脱并分部收集洗脱液。
（4）检测：用双缩尿试剂检测洗脱液。有蛋白质的收集管出现紫红色，分别为第一蛋白峰和第二蛋白峰。收集第二蛋白峰处的各管，4℃冰箱保存，标记为DEAE样品。
（5）回收层析剂。
【注意事项】
1.盐析所用器皿一定要干燥。
2.盐析时，应将饱和硫酸铵或固体硫酸铵加入到血清中，且缓慢地边加边搅拌。
3.层析柱上方要留有少量液体，避免使层析剂暴露于空气中。
4.上样前，层析柱要达到平衡。
5.上样时，使样品沿管壁缓缓流下，勿冲破胶面。
6.整个层析过程要控制好流速。
【实验结果】
从图上可以看出，本组实验的白蛋白含量还是很高的。但由于时间调节等原因，使得第二组峰比较平缓，没有集中于一点，若第二组峰也如第一组峰一样陡峭，实验会更加完美。
【思考与讨论】
1.本次实验最大的败笔就是在最后透析时，由于装液之前没有检查透析袋有没有固定好，最后样品全漏了。最后老师帮我们又做了一份，在这里要特别感谢程老师。通过此次实验，我深刻的意识到，在做实验过程中一定要细心，用心，耐心，不能再犯这种由于仪器没处理好而引发的低级错误了。
2.第二个做的不好的地方是，上课不认真听老师讲课，听了也不上心。在电脑作图时，中间应该关掉重启软件一次，将前面的杂质峰和后面的白蛋白峰分开。通过此次年实验，我们深刻的意识到，上课一定要认真听老师讲课，因为老师不会讲废话，既然讲了，就一定是实验要注意的重点和细节。所以，以此为鉴，下次认真听讲吧。
二、蛋白含量测定（双缩尿法）
【实验目的】
熟悉常用蛋白质含量测定方法（双缩尿法）及应用。
【实验原理】
凡具有两个以上肽键（—CO—NH—）的物质，在碱性溶液中与铜离子反应，形成紫红色络合物，称双缩尿反应。由于蛋白质含有肽键，故也能发生双缩尿反应。颜色深浅与蛋白质浓度成正比。
【实验器材】
1.主要仪器 分光光度计、水浴锅。
2.主要试剂
（1）蛋白样品。
（2）标准牛血清白蛋白溶液（4%）。
（3）0.9% NaCl。
（4）双缩尿试剂。
【实验方法】
1.取3支干净的试管按下表操作：
2.混匀，37℃水浴30分钟后以第三管调零，520nm波长比色，读取吸光度。
3.计算：
蛋白质含量g%=(测定管A520/标准管A520）×标准蛋白浓度
【注意事项】
1.若反应液的吸光度超出分光光度计的测量范围，则应将蛋白样品稀释一定倍数后再测定。
【实验数据记录】
【实验结果】
取9、10、22、23号试管进行计算，得结果如下：
【实验思考与讨论】
本次试验犯的错误真是让人无语，吸光度测出来竟然有负值。原因是什么呢？竟然是做对照实验的比色杯没有擦干净，甚至能看到指纹，导致后来测出的一系列数据的不准。通过此次实验，我明白，做实验一定不能慌，不能急，哪怕别人都走了，我也要坚持做好自己要做的。做实验年一定要细心，注意细节。
三、牛血清白蛋白的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
【实验目的】
熟悉用SDS—聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳对蛋白质纯度的鉴定。
【实验原理】
蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向阳级或阴极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术，称为电泳。在蛋白质样品和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入带负电荷的十二烷基硫酸钠（SDS)，可使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失，加之聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，据此，蛋白质在电场中的泳动速率仅与蛋白质颗粒的大小有关。
【实验器材】
1.主要仪器 电泳仪、电泳槽、电炉、脱色用摇床。
2.主要试剂
（1）5×SDS—PAGE电极缓冲液：电泳时稀释5倍。0.125nol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)，1.25mol/L甘氨酸，0.5%（W/V)十二烷基硫酸钠（SDS)。称15.1g Tris,94g甘氨酸，5gSDS，用蒸馏水定容至1000ml。
（2）分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris—HCl，pH8.8。称取18.17g Tris,80ml蒸馏水溶解，用HCl调pH8.8，蒸馏水定容至100ml。
（3）浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris—HCl，pH6.8。称取6.05g Tris,40ml蒸馏水溶解，用HCl调pH6.8，蒸馏水定容至50ml。
（4）30%胶贮存液：丙烯酰胺（Acr):甲叉双丙烯酰胺（Bis)=29:1 Pre-mixed Powder 9g,加蒸馏水溶解至30ml。若有沉淀需过滤。
（5）10%SDS。用时要加热溶解。
（6）10%过硫酸铵。临用前配。
（7）TEMED。
（8）2×样品溶解液：2×SDS—PAGE Loading Buffer。0.1mol/L Tris—HCl(pH6.8)，4%（W/V)SDS,0.2%(W/V)溴酚蓝，20%（V/V)甘油，2%（W/V)β-巯基乙醇。1.0mol/L Tris—HCl(pH6.8)1ml,SDS0.4g,溴酚蓝0.02g,甘油2ml,加蒸馏水溶解至9.8ml。分装成10个Eppendorf管（0.98ml/EP)，室温放置。用前加β-巯基乙醇0.02ml/EP。
（9）染色液：0.1%（W/V)考马斯亮蓝R-250,25%(V/V)异丙醇，10%（V/V)醋酸。称0.3g考马斯亮蓝R-250，加75ml异丙醇，30ml冰醋酸，用蒸馏水定容至300ml。若有沉淀需过滤。
（10）脱色液：10%（V/V)醋酸，5%（V/V)乙醇。取100ml冰醋酸，50ml乙醇，用蒸馏水定容至100ml。
【实验方法】
1.配胶（分离胶，浓缩胶），如下表：
2.封板，组装电泳槽。
3.灌入分离胶，缓慢加入1-2mm高度蒸馏水，使重叠于胶面上。待分离胶凝固后，倒出胶面上层的水，剩余的水用滤纸吸干。
4.灌入浓缩胶，插入梳子。浓缩胶凝固后，拔出梳子。
5.样品处理：将分离纯化过程中留取的蛋白样品，稀释到含蛋白质2mg/ml，再按稀释液：样品溶解液=1：1的比例加入样品溶解液，煮沸5分钟，冷却后加样。
6.在梳子孔中加入处理好的样品20μl。连接好电极线，使负极上，正极下。稳压100V,电泳2-3小时。
7.电泳结束，取下胶，刮掉浓缩胶，染色液中染色30分钟。
8.用脱色液脱色24小时。
【注意事项】
1.30%Acr-Bis是神经毒化合物，操作时要小心，做好个人防护。
2.过硫酸铵需现用现配。
3.过硫酸铵和TEMED加入后应立即灌胶。
4.用微量加样器加样时，勿刺破胶面。
【实验结果】
97．4KD
66．2KD
42．7KD
31KD
14．4KD
从左到右加的样品依次是：mark试剂， ，9号样品，10号样品，22号样品，23号样品，粗蛋白样品，小牛血清白蛋白样品。由图看，本实验做的还不错，杂质不是很多。
【实验思考与讨论】
1.本次实验没出现操作问题，就是在前期配分离胶和浓缩胶的时候，操作不熟练。
2.加样时不熟练，加的很慢，加的位置不是很好，电泳时跑出的胶不是很直。
致谢：
感谢程建青老师的指导。
参考文献：
金坚、许正宏、邱丽颖等编写的《制药工程实验教程》
网络搜索：http://baike.baidu.com/view/42541.htm
第二篇：牛血清α1
牛血清α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）的分离及鉴定
作者：熊洪亮 指导老师：孟欣老师
（ 中国医科大学96期7班 沈阳 邮编 110000 ）
【摘要】α1-AT血清中主要的蛋白酶抑制剂，分子量5.6kD，pI为4.7，是一种糖蛋白。提纯：首先可通过盐析法，将其从血清中提纯，然后可通过凝胶过滤层析将其与盐分离，达到进一步提纯，DEAE-纤维素离子交换层析再进一步提纯。活力测定：通过检测对胰蛋白酶的抑制力来测定α1-AT活力。电泳：通过电泳得到α1-AT蛋白，并在条件允许下测得蛋白质分子量。
【关键词】α1-AT 层析 分离 纯化 电泳
α1－抗胰蛋白酶为一种糖蛋白，由肝细胞制造，分子量5.6kD，体内半衰期5.6d，在常规蛋白电泳上为α1－球蛋白的最主要成分，其生物学作用在于抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、透明质酸酶、纤溶酶、弹力蛋白酶等，为一种广谱蛋白酶抑制剂。在本次实验中发现：α1-AT具有抑制胰蛋白酶活性的作用，且具有明显的电泳现象。
一． 盐析法
1. 材料原理
1.1 实验原理：盐析法是一种利用蛋白质在高盐溶液中溶解度不同而分离的方法因此不同浓度的硫酸铵能将不同蛋白质分离开来。其原理是：硫酸铵加入蛋白质溶液中，使蛋白质表面电荷被中和，水化膜被破坏，使蛋白质从溶液中析出。
1.2 仪器与试剂：离心机、真空泵；饱和硫酸铵溶液、固体硫酸铵、牛血清
2. 实验方法
1.量取15ml牛血清，倒入一干净烧杯中，缓慢加入硫酸铵溶液15ml，加入过程并不断用玻璃棒搅拌，然后置于4摄氏度冰箱中放置30min，并做好标记。
2.将上述所得溶液倒入离心管中，做好标记，以3000r/min的速度离心20min.
3.离心后，将上清液倒入一干净量筒中，得24ml上清液，然后倒入一干净烧杯中，并加入4.2g固体硫酸铵，边加边搅拌，做好标记，在4摄氏度冰箱中放置30min。
4.在布氏漏斗中方两层滤纸，用烧杯中的液体将其润湿，再将烧杯中剩余的液体倒入漏斗中，于真空泵负压抽滤至龟裂。
5.刮下滤纸上的沉淀。
3. 实验结果：此沉淀即为α1-AT粗提蛋白组分。
4. 实验讨论：实验过程中，i)为什么向蛋白质溶液中加硫酸铵溶液，而不能反过来添加？我觉得主要有两点原因：1.硫酸铵溶液加入蛋白质溶液中，在溶液中作用的空间范围大，更利于其破坏蛋白质表面的水化膜，使蛋白质析出；2.硫酸铵溶液能再电离出氨根离子，使溶液呈酸性，饱和硫酸铵溶液酸性较大，会使蛋白质变性。ii)两次析出沉淀过程中，为什么第一次使用硫酸铵溶液，第二次使用固体硫酸铵？由沉淀理论可知，不同蛋白质沉淀对硫酸铵浓度有不同的要求，称为蛋白质的分级沉淀，如果第二次继续加硫酸铵溶液，溶液的硫酸铵浓度改变就不会很明显，这样α1-AT蛋白析出效果也不会很好。
二 凝胶过滤法层析
1 材料原理
1.1 实验原理：凝胶过滤法层析又称分子筛层析，混合物流经凝胶时，大分子因不能进入凝胶网孔而凝胶颗粒间隙流下，由于其所受阻力小，所以比小分子流速快，本实验利于大、小分子在凝胶中的流速不同而将他们分开。
1.2 实验材料：SephadexG-25凝胶、层析柱（20*550mm）、反应板；奈氏试剂（将3.5g碘化钾和1.3g氨化汞溶解于70ml水中，然后加入30ml 14mol/L的NaOH溶液，必要时过滤，保存在棕色瓶中）、0.05mol/LpH6.4磷酸缓冲溶液（PBS）/双缩尿试剂、α1-AT盐析粗提蛋白组分。
2 实验方法
1装柱及平衡
i).连接好层析柱
ii).夹住出口，加入约10cm高的PBS，降凝胶搅拌均匀，向层析柱灌入约占其高度1/3的凝胶，胶自然沉淀约1cm时，打开出口。控制流速，同时向层析柱继续加凝胶，最后凝胶为层析柱高度的2/3，夹紧出口。
iii).管好胶后，静置一段时间，取凝胶上清液少许与反应板中，同时从出口处也取少量液体于反应板中，用pH试纸测定两组液体，发现pH值相等。
2.待凝胶液面与PBS齐平时，沿壁环形缓慢加入α1-AT盐析粗提蛋白组分，待有色液体柱底时，不断用测试反应板上收集到的洗脱液，洗脱液一旦变紫红，立即用量筒收集，同时不断用PBS洗脱柱壁，确保凝胶不漏于空气中，当洗脱液不再变色时，结束收集，夹住出口，得到11.5ml溶液。
3.用PBS全速洗脱凝胶，直至洗脱液不再使奈氏试剂变色，回收凝胶。
3 实验结果：得到除盐的α1-AT溶液11.5ml
4 实验讨论：为什么凝胶不能暴露于空气中?由于凝胶的成分是交联葡聚糖，是以右旋糖酐与1-氯-2,3-环氧丙烷(表氯醇)交联制备而成的具有网状结构、水不溶性珠状微粒，可被强酸、强碱或氧化剂破坏降解。所以空气中不仅容易破坏其分子筛结构，而且交联葡萄糖容易被空气中的氧气氧化。
三 DEAE-纤维素离子交换层析
1 材料原理
1.1 实验原理：DEAE-cellulose是阴离子交换剂，本身带有正电荷，能吸附溶液中的阴离子，使用含阴离子的溶液洗柱时，含有电荷少的离子首先被洗脱下来，增加洗脱液阴离子浓度，含负电荷多的蛋白质再洗脱下去，这样能达到将盐于蛋白质分离的目的。
1.2 实验材料：层析柱（10*150mm）、DEAE-纤维素、0.05mol/L及0.12mol/LpH6.4PBS、双缩尿试剂、经G-25除盐的α1-AT粗提液。
2 实验方法
i) 取出G-25除盐的α1-AT粗提样品，并在低温下解冻，留取1ml放入小试管中。
ii) 向层析柱中注入占其体积1/3的0.05mol/L的PBS,再往其中加约占其体积1/3的DEAE-纤维素，混合30s后，打开夹子放出液体，并不断蘸取滴出液与pH试纸反应，同时与PBS与试纸反应的颜色进行对比，直至颜色相同，进行此操作时不断层析柱口滴加0.05mol/L的PBS。
iii) 滴加α1-AT粗提样品，滴速控制为15滴/分，并用0.05mol/L的PBS进行洗脱，用双缩脲试剂检查洗脱液，当出现紫红色时，为第一峰蛋白，收集至一支试管。第一峰通过后，即双腿缩尿试剂不变色时，改用0.12mol/L的PBS进行洗脱，再次出现紫红色时，为第二峰蛋白，每15滴收集至一支试管中，直至双缩脲试剂不变色为止，经检测最后收集的蛋白质溶液还可以使双缩脲试剂变色，将所有收集的液体置于一支试管中，同时留取1ml于小试管。
iv) 回收凝胶于指定的烧杯中。
3.实验讨论：为什么在前后洗脱过程中所采用的流速和PBS浓度会不一样？此过程是一个层析柱的吸附和解吸附的过程，由于DEAE-cellulose是阴离子交换剂，本身带有正电，这样弱酸性、中性蛋白质就会穿过柱子，而偏弱碱性的会不牢固的吸附。而α1-AT会较牢固的吸附，在第一次洗脱时，由于蛋白质所带电荷少，因此PBS溶液离子强度不宜过大，这样洗脱液阴离子于交换剂结合相对来说就比较慢，流速就必须慢；第二次洗脱时，蛋白质所带负电荷多，因此PBS溶液离子强度应该大，这样洗脱液阴离子于交换剂结合相对来说就比较快，就需进行全速洗脱。
四．α1-AT活力测定及蛋白定量
1.材料原理
1.1 实验原理：1胰蛋白酶可以水解BAPNA，使之释放出黄色产物对硝基苯胺，而α1-AT可以抑制胰蛋白酶的活性，同时，α1-AT活力与产物呈负相关，产物可通过410nm波长进行比色测定。2蛋白质与双缩脲试剂反应，其呈色强度与其浓度呈正相关，通过与已知浓度蛋白质溶液对比，可得出其含量。
1.2 实验材料:722分光光度计、恒温水浴、胰蛋白酶液（0、12mg/ml）、苯甲酰精氨酰对硝基苯胺( BAPNA)、33%乙酸、0.05mol/LpH Tris-HCL缓冲液（内含0.02mol/LCaCl2）、0.9%NaCl、7%标准蛋白液、双缩脲试剂、各步α1-AT提取液（血清，G25样品，DEAE样品）
2.实验方法：【1】α1-AT活力测定
1取5支试管按表中的量加液（单位：ml)
2 410nm比色所测的数据如下表：
【2】蛋白定量
1取4支试管按表中的量加液（单位：ml)
2混匀，室温放置30min,520nm比色，得到如下数据：
3 实验结果：1 α1-AT活力计算：
根据α1-AT活力（mg/L）={（D对-D检）/D对}*0.06/0.1其中D对为对照管光密度，D检为样品光密度。
血清：α1-AT活力（mg/L）=0.573mg/Ml
G25: α1-AT活力（mg/L）=0.581mg/Ml
DEAE: α1-AT活力（mg/L）=0.232mg/Ml
2 蛋白定量：根据蛋白质含量（g%）=Du/Ds*Cs（其中Ds=0.209,Cs=7g%）有：
血清：蛋白质含量（g%）=9.2g%
G25: 蛋白质含量（g%）=5.7g%
DEAE: 蛋白质含量（g%）=3.0g%
4.实验讨论：反应为什么要在37℃下进行?因为胰蛋白酶在37℃下才能发挥其催化作用，如果不在此温度下进行，实验将会产生较大的误差。
五．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
1 材料原理
1.1 实验原理：1电泳，带电质点在电场中能向异种电荷电极移动。
2泳动速度：V=EQ/6πrη
迁移速度为：M=V/E=Q/6πrη
3SDS可以消除电荷差异和形状差异，在一定条件下有：lgMW=k1-bm
其中，MW为蛋白质分子量，k1为常数，b为斜率，m为迁移率，因此可通过迁移率求出蛋白质分子量。
4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统不联系性，凝胶孔径不连续性，缓冲溶液pH值不连系性，缓冲溶液种类不连续性。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有：电荷效应，凝胶的浓缩效应，分子筛效应。
1.2 实验材料：电极缓冲液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、凝胶、染色液、脱色液、样品缓冲液、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED。
2 实验方法:
i) 样品处理：将血清、G-25、DEAE个1ml,用蒸馏水稀释至2mg/mL，再个取样品0.5ml与缓冲液1:1比例混合，煮沸5min，冷却准备加样。
ii) 组装电泳槽：洗净玻璃板，用无尘纸吸干模具上的水分，固定检漏。
iii) 按以下成分配胶:
0.5mol/Ltris-HCLpH6.8 --- 2.4
H2O 3.5 6.3
甘油 3.0 ---
10%过硫酸铵（催化剂） 75μL 200μL
TEMED(加速剂) 20μL 20μL
iv) 灌入分离胶，缓慢加蒸馏水至与玻璃板上缘齐平，30min后，分离胶凝固，倒出胶面上的水，并用无尘纸吸干。
v) 灌入浓缩胶与玻璃板上缘齐平，此过程中由于失误，浓缩胶中没有加入TEMED,为了赶上其他同学的速度，我后组加入了30μL TEMED ,同时借用了他组同学4个槽进行电泳。 插入梳子。
vi) 胶凝固后，拔出梳子，按从左至右依次加入20μL血清、20μL血清、30μL G-25、40μL G-25、30μL DEAE、40μL DEAE。
vii) 将电泳槽组装好，加入电极液，黑对黑，白对白，稳压100V。
viii) 其余步骤由指老师完成。
3 实验结果：
4.实验讨论：从实验结果上来看，第一组的效果明显好于第二组，这是怎么造成的呢？从图中可以看出，第二组色带比较宽且模糊不清，这是由于在实验过程中，第二组使用的TEMED剂量比第一组大，这样的话聚合速度就快，导致浓缩胶孔径变小。由此会造成蛋白质经过浓缩胶后所形成的区带不窄，在分离胶分离过程中，区带会拉长，呈现出第二组模糊不清的情况。因此在进行电泳时，一定要通过TEMED的量准确控制聚合速度，以达到较好的实验效果。
实验总结：1整个牛血清α1-AT抗胰蛋白酶（α1-AT）的分离及鉴定实验经过盐析、层析、离子交换、活力测定、电泳达到了分离与鉴定的目的，各步纯化样品的检测结果如下表：
从表格中可以看出DEAE的比活性比G-25的小，因为比活性是样品抑制活力与相应蛋白浓度之比，也就是说经DEAE提纯之后的α1-AT的纯度低于经G-25提纯的，这一点从实验四第一组电泳图像各蛋白色带比例也能看出，G-25中α1-AT色带比例更大。这与理论值相违背了，我觉得很有可能是实验三离子交换出问题了，提纯过程中可能混入了其他杂质，具体原因现在还不能弄明白。
2.从上次实验五第一次电泳图像可以得出：电泳效果较好，因为图中区带较窄，且同一垂直位置各区带界限明显；但同时也说明经过盐析、层析、离子交换提纯之后的蛋白质纯度并不高，因为除α1-AT区带之外区带仍能占较大比例，如果要得更纯蛋白质，还需高压液相层析等更精确的方法处理。
3.由第一组和第二组电泳图像可以看出聚丙烯酰胺凝胶的制备很关键，特别是对TEMED的用量一定要准确把握。
4.在实验条件允许下，可以通过测出蛋白质区带中心与加样端距离，得出相对迁移率，进一步求出蛋白质分子量。
参 考 文 献
1. 魏金荣.生物化学实验 2008.4
2. D.R.马歇克、J.T.门永、R.R.布格斯等.蛋白质纯化与鉴定实验指南.科学出版社【M】.1999
3. 沃兴德.蛋白质电泳与分析.军事医学科学出版社
4. 陈誉华.医学细胞生物学.人民卫生出版社