实验一 动物组织切片观察
一．实验目的
1.正确书写实验报告
2.系统发生及个体发生
3.生物量级：组织层次
4.多细胞生物与单细胞生物
二．实验原理
光学显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成（见下图）。机械装置一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和镜座部分等；光学系统包括目镜、物镜、聚光器、光源等。标本经物镜和管镜放大后，形成放大倒立的实像；实像经目镜再次放大后，形成放大的虚像。
三．动物与器材
动物组织切片，显微镜
四．方法与步骤
1.显微镜工作原理
2.动物组织构成
3.切片观察
五．实验结果
六．实验结论
假复层纤毛柱状上皮主要分布在呼吸管道，由纤毛细胞、杯状细胞、刷细胞、基细胞和小颗粒细胞等组成（图2.2.1-2、图16-4）。其中纤毛细胞最多，呈柱状，游离面有密集的纤毛，纤毛向咽部快速摆动，将粘液及附着其上的尘埃、细菌等推向咽部被咳出，净化吸入的空气。杯状细胞较多，形态与肠道杯状细胞相同。分泌的粘蛋白与混合腺的分泌物在上皮表面构成粘液性屏障，可粘附空气中的异物颗粒，溶解吸入的SO2等有毒气体。刷细胞呈柱状，游离面有排列整齐地微绒毛，形如刷状。小颗粒细胞是一种内分泌细胞，数量少，锥形，单个或成团分布在上皮深部，胞质内有许多致密核心颗粒，可调节呼吸道平滑肌的收缩与腺体的分泌。基细胞呈锥形，位于上皮深部，为干细胞，可增殖分化为上皮中其它各类细胞。
七．问题解答
1.显微镜下观察标本切片的基本程序依次为哪些？
显微镜的准备→标本的肉眼观察→低倍镜→高倍镜→油镜
2.气管HE染色横切片在低倍镜和高倍镜下分别可以看到那些结构？
低倍镜：从内向外依次为：黏膜（表面为假复层纤毛柱状上皮；上皮深面的细密结缔组织为固有层，其内可见小血管、淋巴组织和气管腺的导管，有时可见导管在黏膜上的开口），黏膜下层（为疏松结缔组织，含有成团的混合性腺，即气管腺），外膜（由疏松结缔组织和“C”形透明软骨环组成，由于切面关系软骨环可能呈节段样。软骨环切口处，有弹性纤维组成的韧带、平滑肌束和腺体）
高倍镜：固有层内含丰富的弹性纤维，断面呈红色点状。混合性的气管腺可见浆液性、粘液性、混合性的气管腺可见浆液性、黏液性、混合性腺泡和复层上皮的导管。
八．参考文献
1.《组织学与胚胎学第五版》邹仲之主编 人民卫生出版社
2.《人体显微形态学实验》 汪维伟 王娅兰主编 科学出版社
第二篇：病理组织切片技术是病理实验室最基本的方法
病理组织切片技术是病理实验室最基本的方法，是病理学的一项极有使用价值的专业技能。它包括组织固定、脱水、透明、包埋、切片、漂片、烤片、脱蜡、染色、脱水、透明和封固等程序。HE 染色是既基本又十分重要的工作，HE 染色的好坏直接影响病理医生的正确诊断，而HE 染色质量好坏与HE 制片的每一步骤关系都十分密切。只要某一步骤出了问题都直接影响下一步工作，时常会出现个别片子色调不正、颜色对比不协调、染色不匀、模糊不清等现象，使切片的质量和诊断的准确性受到影响。本文作者在实验过程中就制作优良动物病理切片的体会阐述如下：
一、取材要及时、规范
（一）要取最新鲜的材料。由于各器官组织坏死变化很快，所以取材要求迅速。取材时要用锋利的刀片或剪刀，勿用镊子对组织加以压迫，以免组织破裂和变形。
（二）选取组织块的大小、厚薄亦应力求适度。过大、过厚的组织，固定液不宜渗透，亦可造成固定不佳，过小、过薄的组织又可能在固定或脱水的过程中发生扭曲变形情况[1]。
（三）应有代表性，能够反映出组织的基本结构，如肝要有肝小叶；肾要有皮质和髓质；肺要有支气管等。另外，要采取病变部位和健康部位交叉处的组织，这样才可以通过健康部位的对照，清楚地看到各种病理变化。
二、固定要充分
（一）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。笔者常用的固定液是10％福尔马林溶液。
（二）应及时固定，这样可保持细胞与生活时的形态相似，防止组织自溶而产生死后变化。将取下的材料立即放在固定液中固定24小时以上，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1~2次新液。目的是防止腐败、保持原有结构并使组织硬化，便于处理。笔者为了让组织块固定充分，常在此步骤增加一步重新修块和重复固定，做法是修块大小为10 mm×10 mm×2 mm，然后放入新配制好的10％福尔马林溶液中固定12小时以上，避免了因固定不充分带来的切片问题，收到很好的效果。
（三）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外贴上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色
铅笔或绘图黑墨水书写。
（四）材料经固定后，除乙醇外，组织中的固定液必须冲洗干净。因为残留在组织中的固定液，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察。冲洗方法根据固定液的性质而定，固定液为水溶液的常用水洗涤，方法是将组织块放入冲洗盒中，流水冲洗12小时以上；陈旧的固定时间长的组织应冲洗24小时左右，保证冲洗干净。
三、脱水、透明要彻底
（一）脱水采用酒精梯度脱水法，让组织块依次经过70%、80%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%Ⅰ、100%Ⅱ等各级酒精溶液中，脱水必须在有盖的玻璃瓶中进行，防止吸收空气中的水分和酒精挥发，保证脱水彻底。否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象。
（二）笔者在实践中得出脱水的时间为70%2小时、80%2小时、95%Ⅰ1.5小时、95%Ⅱ1.5小时、100%Ⅰ0.5小时、100%Ⅱ0.5小时，就能达到彻底脱水的效果。如需过夜，应停留在95%酒精中。在100%酒精中，每级停留的时间不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
（三）使用二甲苯作为透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。
（四）在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。
四、浸蜡包埋要认真
（一）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；由于作者使用的石蜡溶点为58℃，所以恒温箱的温度设定为60℃，保持不变。
（二）操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。作者采用两次浸蜡，每次各15分钟，这样浸蜡较为充分，没有发生组织变硬、变脆、收缩等情况。
（三）包埋过程可在恒温箱中进行，避免由于温度变化导致组织块和蜡的分离，影响切片。放置组织
块时注意切面朝下放置，并用温镊子轻轻拨动材料，使之摆放平整。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。
五、切片要完整，贴片要恰当。
（一）切片刀要锋利，切片刀如果不锋利，切出的片会自行卷起，如刀片有缺口，将使制成的切片断裂、破碎、不完整。此时可通过更换刀片解决。
（二）切片刀放置的倾角要合适。过大则切片上卷，过小则切片皱起。切片厚度一般要在４－６微米；过厚，会出现双层细胞的现象，不便于观察。一张优良的切片，在切片时应尽可能的将所要的组织结构切出，要力求完整，铺片时要平整，没有折叠[2]。笔者在切片之前将包埋好的组织块预先冰冻10分钟，避免皱褶产生且利于展片。
（三）贴片过程中，用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放入38℃ 恒温水浴锅的水面上，注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端。
（四）展片后将载玻片放在平盘上做好标记，置于60℃温箱中烘片至少12小时以上，防止染片过程中脱片。
六、染色封固要细心
（一）染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多。石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3~5min，再放入蒸馏水中3min。
（二）染色：切片放入苏木精中染色约5~10min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。一般常用的苏木素染液染色之后需要分化，但是往往分化时间难以掌握，所以作者采用了Gill改良苏木精染液[3]，不需要分化过程，效果非常理想。
（三）水洗：用自来水流水冲至少15min。冲洗过程中要注意流水不能过大，不能直冲，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。以作者的经验流水冲洗30 min左右效果最为理想，此时低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚，红细胞颜色为金黄色。
（四）对于一张染色良好的切片来说伊红染色也是重要的一步。有时伊红染色淡，这可能是某些原因导致伊红不易着染，或者在后面的酒精脱水过程中，又把伊红的颜色脱掉。伊红染色也不宜过深。一张染色好的切片应该是苏木素伊红染色对比度适当鲜艳亮丽。
（五）封固：切片经染色、脱水、透明后，即可用封固剂将其封藏起来，目的是永久保存切片，便于镜检。封固时不应该等切片上的二甲苯干了在封固，否则，切片中易出现色素[4]。放置盖玻片时避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。
笔者认为，制片过程的每一步骤都必须认真对待、科学处理，否则就会影响制片质量。一张优良的切片从外观上看要平整、无皱折、无破裂，厚薄适度，分化良好，HE染色对比度好、明亮鲜艳，封胶、标签整洁。只有认真、科学、严谨的对待切片制作的每一个步骤，掌握每一个细节，不断总结经验，才能制作出优良的病理组织切片，为教学、科研提供依据。